对丙型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性的抗体及其用途

摘要

本发明的目的在于提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗体。本发明提供：通过将丙型肝炎病毒颗粒的立体构造的全部或一部分识别为表位后与其结合，从而抑制丙型肝炎病毒与宿主细胞表面结合，可以抑制HCV感染的抗丙型肝炎病毒抗体、其人源化抗体以及丙型肝炎病毒感染抑制剂。

权利要求

1.抗丙型肝炎病毒抗体，其将由丙型肝炎病毒颗粒的E1蛋白和E2蛋白构成的复合物的立体构造识别为表位，对丙型肝炎病毒具有感染抑制活性，其在重链可变区包含含有序列表的SEQ ID NO: 18、20和22所示氨基酸序列的互补性决定区域，并且在轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 25、27和29所示氨基酸序列的互补性决定区域。

2.权利要求1记载的抗丙型肝炎病毒抗体，其由保藏号为FERM BP-11263的杂交瘤细胞株产生。

3.抗丙型肝炎病毒抗体，其将由丙型肝炎病毒颗粒的E1蛋白和E2蛋白构成的复合物的立体构造识别为表位，对丙型肝炎病毒具有感染抑制活性，其在重链可变区包含含有序列表的SEQ ID NO: 32、34和36所示氨基酸序列的互补性决定区域，并且在轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 39、41和43所示氨基酸序列的互补性决定区域。

4.权利要求3记载的抗丙型肝炎病毒抗体，其由保藏号为FERM BP-11264的杂交瘤细胞株产生。

5.权利要求1或3记载的抗丙型肝炎病毒抗体，其为人源化抗体。

6.保藏号为FERM BP-11263的杂交瘤细胞株。

7.保藏号为FERM BP-11264的杂交瘤细胞株。

8.丙型肝炎病毒的感染抑制剂，其以权利要求1～5中任一项记载的抗丙型肝炎病毒抗体作为有效成分。

说明书

对丙型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性的抗体及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及对丙型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性的抗体及其用途。

背景技术

[0002] 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus：下称“HCV”)是被认定为非甲非乙型肝炎的主要致病病毒的、属于黄病毒科丙型肝炎病毒(Hepacivirus)属的RNA病毒(非专利文献1)。HCV基因组编码翻译后由来自宿主的信号肽酶或来自HCV的蛋白酶切断为10种病毒蛋白(核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A以及NS5B)的前体蛋白。其中，核心、E1、E2以及p7蛋白被分类为结构蛋白，NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A以及NS5B蛋白被分类为非结构蛋白。

[0003] HCV主要通过输血而感染，由于目前已经确立了高灵敏度的HCV检测方法，因此通过输血而导致的新HCV感染患者剧减。另一方面，即使现在，推测包含无肝炎症状的病毒携带者在内的HCV携带者在日本有200万人以上，在全世界有1亿7000万人以上。很大的原因是由于HCV感染引起的肝炎的慢性化率高达70～80％，现阶段除干扰素以外还没有有效的抗病毒剂。因HCV感染引起的慢性肝炎(慢性丙型肝炎)有可能在之后二十多年的时间中发展为肝硬化、最终恶化为肝癌。另外，已知肝癌即使通过手术摘除癌，由于非癌部分持续发生炎症而复发的患者较多。

[0004] 故希望开发出以预防携带者发病或清除病毒为目的的药效优异的抗病毒药或疫苗。因此，需要明确HCV是如何侵入宿主细胞进行复制增殖的，以及会对宿主细胞产生什么样的影响之类的HCV的生活周期的详细情况。

[0005] HCV的生活周期具有下示的一系列循环。首先，HCV与细胞表面的特异性蛋白(病毒受体)结合，通过内吞作用摄入到宿主细胞内，接着，HCV基因组RNA由病毒颗粒释放到宿主细胞质内(脱壳)。接着，该释放的HCV基因组RNA所编码的HCV蛋白前体被翻译、通过加工生成各病毒蛋白，之后HCV基因组RNA被生成的病毒蛋白的一种即RNA聚合酶复制。复制的HCV基因组RNA被作为结构蛋白的核心蛋白和包膜蛋白(E1蛋白和E2蛋白)包装，形成新的病毒颗粒。最后，病毒颗粒破坏宿主细胞膜，释放到细胞外。

[0006] 因此，要预防HCV携带者发病或清除病毒，开发出阻止HCV感染的上述一系列过程中的至少一个路径的方法是很重要的。

[0007] 人们认为HCV与细胞表面的结合是HCV的包膜蛋白承担的，因此一直以来都在研究制作抗HCV感染患者血清中的包膜蛋白的抗体。然而，对C100抗体(NS4-NS-5抗体)或抗核心抗体的至少一种、以及抗包膜蛋白抗体显示阳性的HCV感染患者为整体患者的10％左右，而且，因中和抗体的出现而使丙型肝炎自然治愈者占其中的约10％(非专利文献2)，因此认为因抗包膜蛋白抗体而治愈的患者只不过为整体患者的1％左右。推测这是由于存在阻碍或抑制抗HCV包膜蛋白抗体产生的机构(非专利文献3)。

[0008] 另一方面，非专利文献4中公开了在用哺乳动物表达HCV的包膜蛋白的一种即E2蛋白的情况下，与人细胞表面存在的CD81特异性结合。根据该实验结果，尝试由丙型肝炎患者分离显示抑制E2蛋白与CD81的结合(结合的中和作用(Neutralisation of binding)，NOB)活性的抗体。例如，通过由基因型1a的HCV引起的慢性丙型肝炎患者的骨髓淋巴细胞制作抗体基因文库，使用噬菌体展示法，分离上述抗体(专利文献1)。在由基因型1b的HCV引起的丙型肝炎患者的末梢B细胞制作杂交瘤的方法中，也分离了显示NOB活性的抗体(非专利文献5、专利文献2)。然而，在由HCV感染患者制备单克隆抗体的方法中，因为限于具有HCV感染抑制抗体的患者等，难以获得感染抑制抗体的不同谱(repertoire)或找出作为抗HCV剂有用的抗体。另外，据报道，显示NOB活性的抗体未必抑制感染(非专利文献8)。

[0009] 还尝试了将重组型包膜蛋白给予小鼠来诱导抗体的方法(专利文献3)、以及使其淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合来制作产生抗体的杂交瘤，制作抗包膜蛋白抗体(专利文献4及非专利文献6)。然而，迄今为止尚未获得抑制HCV感染的有效抗体。未用包膜蛋白对动物进行免疫、制作中和HCV感染的抗体的一个理由为：免疫使用的重组型包膜蛋白与病毒本来的包膜蛋白构造不同。另外，据报道，重组型包膜蛋白容易凝集，无法保持本来的立体构造(非专利文献7)。

[0010] 因此，从利用HCV的抗体进行治疗、预防的观点来看，需要开发出能抑制病毒感染的抗包膜蛋白抗体及有效诱导该抗体的新方法。

[0011] 基于上述背景，近年来确立了利用细胞培养系制作感染性HCV颗粒的技术(专利文献5、专利文献6及专利文献7)。与通过基因重组技术表达重组型包膜蛋白、将其用作抗原的上述方法相比，利用细胞培养系制作的HCV颗粒显示感染性，因此认为其保持了HCV抗原的立体构造。

[0012] HCV的立体构造由包膜构成，该包膜由作为包膜蛋白的E1蛋白和E2蛋白、以及脂质膜构成。另外，认为这些E1蛋白和E2蛋白相互结合，形成复合物(非专利文献7)。

[0013] 另一方面，明确了：艾滋病病毒的包膜蛋白形成3聚体，将其立体构造识别为表位(抗原决定簇)的抗体与以往的抗艾滋病病毒抗体相比，对大范围的艾滋病病毒有效，而且为中和活性高的抗体。这表明，在抗体的中和活性中，可以将病毒抗原的立体构造识别为表位是很重要的(非专利文献9)。

[0014] 现有技术文献

[0015] 专利文献

[0016] 专利文献1：日本特表2005-531286号公报

[0017] 专利文献2：日本特表2006-504645号公报

[0018] 专利文献3：日本特表2004-500366号公报

[0019] 专利文献4：日本特表平6-505389号公报

[0020] 专利文献5：WO 05080575A1

[0021] 专利文献6：WO 06022422A1

[0022] 专利文献7：WO 06096459A2

[0023] 非专利文献

[0024] 非专利文献1：Choo等人，Science，1989年，244卷，359-362页

[0025] 非专利文献2：Matsuura等人，J.Virol.，1992年，66卷，1425-1431页[0026] 非专利文献3：斋藤等人，实验医学，1991年，9卷，2075-2080页

[0027] 非专利文献4：Pileri等人，Science，1998年，282卷，938-941页

[0028] 非专利文献5：Hadlock等人，J.Virol.，2000年，74卷，10407-10416页[0029] 非专利文献6：铃木等人，最新医学，2003年，58卷，2017-2022页

[0030] 非专利文献7：Op de Beeck等人，J.Gen.Virol.，2001年，82卷，2589-2595页[0031] 非专利文献8：Burioni等人，J.Virol.，2002年，76卷，11775-11779页[0032] 非专利文献9：Laura M.Walker等人，Science，2009年，326卷，285页发明内容

[0033] 发明要解决的课题

[0034] 本发明的目的在于提供抑制HCV感染的抗体。

[0035] 解决课题的手段

[0036] 本发明人进行了深入的研究，结果成功地从产生抗体的杂交瘤中取得了多个具有HCV感染抑制活性的单克隆抗体，所述产生抗体的杂交瘤是由给予了感染性HCV颗粒的小鼠制作的。这些单克隆抗体是将由HCV的E1蛋白和E2蛋白构成的复合物的立体构造识别为表位的抗HCV抗体。预想可以将这种立体构造识别为表位的抗体对大范围的HCV有效，且不会因HCV的变异而失去感染抑制能力。本发明正是基于这些发现而完成的，即，包含以下内容：

[0037] (1)抗HCV抗体，其将由HCV颗粒的E1蛋白和E2蛋白构成的复合物的立体构造识别为表位，对HCV具有感染抑制活性。

[0038] (2)(1)中记载的抗HCV抗体，其中E1蛋白和E2蛋白的氨基酸序列分别含有序列表的SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

[0039] (3)(1)或(2)记载的抗HCV抗体，其中上述HCV颗粒产自将HCV的J6CF株和JFH-1株的基因组的一部分连接而构成的HCV嵌合基因组，上述HCV嵌合基因组为下面的(i)或(ii)。

[0040] (i)将来自J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列及p7蛋白编码序列、来自JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列及3’非翻译区由5’一侧顺序连接而成的HCV嵌合基因组

[0041] (ii)将来自J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列及NS2蛋白编码区域的编码N末端至16位的氨基酸残基的氨基酸序列的序列、来自JFH-1株的NS2蛋白编码区域的编码始自N末端的17位氨基酸残基以后的氨基酸序列的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列及3’非翻译区由5’一侧顺序连接而成的HCV嵌合基因组

[0042] (4)(3)记载的抗HCV抗体，其中上述HCV嵌合基因组是由序列表的SEQ ID NO：2所示核苷酸序列构成的核酸(不过，在该核酸为RNA的情况下，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)改读为尿嘧啶(U))。

[0043] (5)上述(1)～(4)的任一项中记载的抗HCV抗体，其中感染抑制活性是抑制HCV颗粒与宿主细胞表面结合的活性。

[0044] (6)上述(1)～(5)的任一项中记载的抗HCV抗体，其由保藏号为FERM BP-11263的杂交瘤细胞株产生。

[0045] (7)上述(1)～(5)的任一项中记载的抗HCV抗体，其由保藏号为FERM BP-11264的杂交瘤细胞株产生。

[0046] (8)上述(1)～(5)的任一项中记载的抗HCV抗体，其为人源化抗体。

[0047] (9)保藏号为FERM BP-11263的杂交瘤细胞株。

[0048] (10)保藏号为FERM BP-11264的杂交瘤细胞株。

[0049] (11)HCV感染抑制剂，其以上述(1)～(8)的任一项中记载的抗HCV抗体作为有效成分。

[0050] (12)上述(1)～(5)的任一项中记载的抗HCV抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含含有序列表的SEQ ID NO：18、20和22所示的氨基酸序列的互补性决定区域。

[0051] (13)上述(12)中记载的抗HCV抗体，其包含含有序列表的SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的重链可变区。

[0052] (14)上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(12)或(13)中记载的抗HCV抗体，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有序列表的SEQ ID NO：25、27的29所示的氨基酸序列的互补性决定区域。

[0053] (15)上述(14)中记载的抗HCV抗体，其包含含有序列表的SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的轻链可变区。

[0054] (16)上述(1)～(5)的任一项中记载的抗HCV抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含含有序列表的SEQ ID NO：32、34和36所示的氨基酸序列的互补性决定区域。

[0055] (17)上述(16)中记载的抗HCV抗体，其包含含有序列表的SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的重链可变区。

[0056] (18)上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(16)或(17)中记载的抗HCV抗体，其具有轻链可变区，该轻链可变区包含含有序列表的SEQ ID NO：39、41和43所示的氨基酸序列的互补性决定区域。

[0057] (19)上述(18)中记载的抗HCV抗体，其具有包含序列表的SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的轻链可变区。

[0058] (20)上述(12)～(19)中记载的抗体，其中，在上述重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中，框架区中的1～5个氨基酸被缺失、取代、插入或添加。

[0059] (21)上述(12)～(20)的任一项中记载的抗HCV抗体，其为人源化抗体。

[0060] (22)上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)或(21)中记载的抗HCV抗体的片段，其将由HCV颗粒的E1蛋白和E2蛋白构成的复合物的立体构造识别为表位，对HCV具有感染抑制活性。

[0061] (23)多核苷酸，其编码上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)或(21)的任一项中记载的抗体或上述(22)中记载的抗体的片段。

[0062] (24)载体，其含有上述(23)中记载的多核苷酸。

[0063] 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2009-251165号、2009-251341号的说明书和/或附图中所记载的内容。

[0064] 发明效果

[0065] 本发明的具有HCV感染抑制活性的抗体及其用途可用于丙型肝炎的治疗或预防，还可在为了阐明HCV的感染机理的研究中利用。

附图说明

[0066] 图1表示给予J6/JFH-1-HCV颗粒小鼠血清的IgG组分的HCV感染抑制活性。

[0067] 图2表示单克隆抗体P18-9E对J6CF感染性HCV样颗粒的HCV感染抑制活性。

[0068] 图3表示单克隆抗体P19-7D对J6CF感染性HCV样颗粒的HCV感染抑制活性。

[0069] 图4表示单克隆抗体P18-9E对J6/JFH1感染性HCV颗粒的HCV感染抑制活性。

[0070] 图5表示单克隆抗体P18-9E和P19-7D的重链及轻链可变区中互补性决定区域(CDR)和框架区(FR)的氨基酸序列的序列编号。

[0071] 图6表示使用将重组E1蛋白和E2蛋白固相化的板的、单克隆抗体8D10-3的酶免疫测定(EIA)结果。

[0072] 图7表示使用将HCV样颗粒(HCV-VLP)固相化的板的、单克隆抗体8D10-3和单克隆抗体P18-9E的EIA结果。

[0073] 图8表示使用将HCV样颗粒(HCV-VLP)固相化的板的、单克隆抗体8D10-3和单克隆抗体P19-7D的EIA结果。

具体实施方式

[0074] 下面详细说明本发明的实施方式。需要说明的是，本发明可以使用在该领域技术范围内的分子生物学和免疫学的现有技术来实施。这类技术已在文献中充分说明。例如可参照Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(第3版，2001)；Ed Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。

[0075] 本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请都整体援引到本说明书中作为参考。

[0076] 1.抗HCV抗体及其片段

[0077] 本发明的一种方案是以HCV颗粒作为抗原、并具有HCV感染的抑制活性的抗HCV抗体或其片段。

[0078] 1-1.抗HCV抗体及其片段

[0079] 本发明的“抗HCV抗体”是以产自后述的HCV嵌合基因组的HCV颗粒作为抗原而诱导的抗体，是将HCV颗粒的立体构造识别为表位而结合、并且具有抑制其HCV感染宿主细胞的活性的所谓中和抗体。本发明的抗HCV抗体包含多克隆抗体或单克隆抗体，优选为单克隆抗体。在本说明书中，“单克隆抗体”是指：含有单一的免疫球蛋白、或者其框架区(Frame work region，下称“FR”)和互补性决定区域(Complementarity determining region，下称“CDR”)，与作为抗原的HCV颗粒特异性结合、并且可识别该HCV颗粒的多肽。上述免疫球蛋白中，IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的各类抗体是已知的，本发明的抗体可以是任一类，优选IgG。

[0080] 本发明的抗HCV抗体的具体例子有：重链可变区(H链V区：下称“VH”)中包含含有SEQ ID NO：18、20和22、或者SEQ ID NO：32、34和36所示的氨基酸序列的CDR的抗体。例如，具有包含SEQ ID NO：13或者15所示的氨基酸序列的VH的抗体是适当的。

[0081] 本发明的抗HCV抗体的具体例子还有：轻链可变区(L链V区：下称“VL”)中包含含有SEQ ID NO：25、27和29、或者SEQ ID NO：39、41和43所示的氨基酸序列的CDR的抗体。例如，具有包含SEQ ID NO：14或者16所示的氨基酸序列的VL的抗体是适当的。

[0082] 本发明的抗体或者后述的其片段的可变区(下称“V区”)，特别是该区中所含FR的氨基酸序列只要保持与HCV颗粒的特异性结合活性，可以含有变异。即，FR的氨基酸序列中可以缺失、取代、插入或者添加1～5个、优选1～4个、更优选1～3个、进一步优选1或2个氨基酸。其原因是：FR为构成V区的骨格的区域，与抗体的抗原结合特异性不直接相关，因此即使在向该区域引入上述变异的情况下，保持与HCV颗粒的特异性结合活性的可能性仍较高。另一方面，向CDR导入变异很有可能改变抗原特异性结合活性，通常不优选。然而，向CDR导入变异而显著增大抗体的结合活性的例子也是已知的。因此，本发明中上述变异也可以在CDR内。在这种情况下，CDR可以含有1～3个、优选1或2个氨基酸的缺失、取代、插入或者添加。这种变异的导入可以利用后述的噬菌体载体。由于噬菌体载体可迅速且大量地表达导入的抗体，并且有可能在宿主细菌的表面表达足量的抗体分子，因此在进行筛选保持与HCV颗粒的特异性结合活性或增大该活性的含有变异的抗体方面是便利的。

[0083] 本发明的“其片段”是指：上述抗HCV抗体的部分区域，具有与该抗体所具有的抗原特异性结合活性实质上同等的活性的多肽链或其复合物。例如，包含至少1个抗原结合部位的抗体部分，即具有至少1个VL与至少1个VH的多肽链或其复合物是适当的。具体例子有：通过用各种肽酶切断免疫球蛋白而产生的多个充分带有特征的抗体片段等。更具体的例子有Fab、F(ab’)2、Fab’等。Fab是通过木瓜蛋白酶在铰链区的较之二硫键靠近N末端一侧切断IgG分子而产生的片段，由多肽和轻链构成，该多肽由VH和构成H链C区(重链恒定区，下称“CH”)的3个结构域(CH1、CH2、CH3)中与VH邻接的CH1构成。F(ab’)2是通过胃蛋白酶在铰链区的较之二硫键靠近C末端一侧切断IgG分子而产生的Fab’的二聚体。Fab’与Fab相比仅含有铰链区的部分H链稍长，实质上具有与Fab同等的构造(参照Fundamental Immunology，Paul ed.，第3版，1993)。Fab’可通过将F(ab’)2在温和的条件下还原，切断铰链区的二硫键而获得。这些抗体片段均包含抗原结合部位，具有与抗原(即，本发明中为HCV颗粒)特异性结合的能力。

[0084] 本发明的抗HCV抗体或其片段可以修饰。此处所称修饰也包含：在本发明的抗体或其片段具有与HCV颗粒的特异性结合活性方面必要的功能上的修饰(例如糖基化)、或者在检测本发明的抗体或其片段方面必要的标记。上述抗体标记中例如有：用荧光色素(FITC、罗丹明、Texas Red(德克萨斯红)、Cy3、Cy5)、荧光蛋白(例如PE、APC、GFP)、酶(例如、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶)、或者生物素或(链霉)抗生物素蛋白进行的标记。另外，本发明抗体的糖基化也可以为了调整抗体对标的抗原的亲和性而改变。这种改变例如可以通过变更抗体序列内的一个以上的糖基化部位来实现。更具体来说，例如，可以通过向构成FR内的一个以上的糖基化部位的氨基酸序列中导入一个以上的氨基酸取代来除去该糖基化部位，使该部位的糖基化丧失。这种脱糖基化在增加抗体对抗原的亲和性方面是有效的(美国专利第5714350号和美国专利第6350861号)。

[0085] 本发明的抗HCV抗体或其片段优选具有与HCV颗粒的解离常数为5.0e-9M以下，优-9 -10 -10 -11 -11 -12选1.0e M以下，更优选5.0e M以下、1.0e M以下、5.0e M以下、1.0e M以下、5.0e M以-12
下或1.0e M以下的高亲和性。上述解离常数可以使用该领域中公知的技术测定。例如，可以通过BIAcore系统(GE Healthcare bioscience公司制)用速度评价工具包软件测定。
解离常数的测定适当确定即可，正确的测定优选在0.3M氯化钠的存在下进行。

[0086] 本发明的抗HCV抗体或其片段为来自任意生物的抗体或其片段，优选为来自哺乳动物的抗体或其片段。在为了抑制HCV感染而给予人的情况下，希望为人抗体、或者化学合成或用重组DNA法合成的重组抗体。这是由于：来自人以外的生物的抗HCV抗体的恒定区(下称“C区”)在人体内具有免疫原性，因此对该抗体诱发免疫反应，无法实现上述目的。

[0087] 本说明书中上述“重组抗体”是指例如嵌合抗体、人源化抗体及合成抗体。

[0088] “嵌合抗体”是指将某抗体的C区用其他抗体的C区取代而成的抗体。例如，在后述的具有HCV感染抑制活性的小鼠单克隆抗体P18-9E或P19-7D中，将其C区取代为人抗体的C区而成的抗体是适当的。由此能够减轻人体内对该抗体的免疫反应。本发明的嵌合抗体的更具体的例子有：VL含有来自抗HCV小鼠单克隆抗体的SEQ ID NO：14或16所示的氨基酸序列、且L链C区(轻链恒定区：下称“CL”)含有任意的人抗体的CL中的氨基酸序列、和/或VH含有来自抗HCV小鼠单克隆抗体的SEQ ID NO：13或15所示的氨基酸序列、且CH含有任意的人抗体的CH中的氨基酸序列的抗体。

[0089] “人源化抗体”也称为重构(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物，例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体的CDR中而获得的嵌合抗体。抗体的抗原结合特异性主要由V区中的CDR群承担。因此，在制作与某种特定的抗体具有同样的结合特性的重组抗体时，不必获得该抗体的全部氨基酸序列，通过使用已有的重组DNA技术，制备将编码来自该抗体的各CDR区的DNA序列取代为编码分别来自人抗体的相应CDR的DNA序列的嵌合抗体，使其进行表达，可以获得模仿了该特定抗体的性质的重组抗体。制备人源化抗体的一般性基因重组手法也是已知的(欧洲专利申请公开号EP 125023号公报)。例如有如下方法：将使小鼠抗体的CDR和人抗体的FR两者的末端区域具有重叠部分而制作的多个寡核苷酸用作引物，通过PCR法合成设计使小鼠抗体的CDR与人抗体的FR连接的DNA序列。本发明中，由于抗HCV小鼠单克隆抗体P18-9E和P19-7D的CDR已是清楚的，因此例如可以用后述的方法制作人源化抗体。

[0090] “合成抗体”是指化学合成或者使用重组DNA法合成的抗体或抗体片段。例如，介由具有适当长度和序列的连接肽等将特定抗体的一个以上的VL和一个以上的VH人工连接而成的一聚体多肽分子、或者其多聚体多肽是适当的。这种多肽的具体例子有：单链Fv(scFv：可变区的单链片段)(参照Pierce Catalog and Handbook，1994-1995，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)或者四链抗体(tetrabody)等。免疫球蛋白分子中，VL和VH通常位于不同的多肽链(轻链和重链)上。单链Fv是将这2个多肽链上的V区用足够长的柔软性接头连接，具有包含在1个多肽链上的构造的合成抗体片段。单链Fv内的两个V区可以相互自己集合而形成1个功能性抗原结合部位。单链Fv可以通过使用公知技术将编码它的重组DNA插入噬菌体基因组中进行表达而获得。双链抗体是具有以单链Fv的二聚体构造为基础的构造的分子(Holliger等人，
1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。例如，在上述接头的长度短于约12个氨基酸残基的情况下，单链Fv内的2个可变部位不能自己集合，通过形成双链抗体，即通过使
2个单链Fv相互作用，一个Fv链的VL有可能与另一个Fv链的VH集合，可以形成2个功能性抗原结合部位(Marvin等人，2005，Acta Pharmacol.Sin.26：649-658)。而且，通过在单链Fv的C末端添加半胱氨酸残基，两个Fv链彼此之间可能形成二硫键，也可以形成稳定的双链抗体(Olafsen等人，2004，Prot.Engr.Des.Sel.17：21-27)。这样，双链抗体是二价的抗体片段，各自的抗原结合部位不必与同一表位结合，可以具有识别并特异性结合各不相同的表位的双重特异性。例如，一个抗原结合部位可以由包含含有SEQ ID NO：18、20和
22所示的氨基酸序列的CDR(分别相当于P18-9E的VH中的CDR1、CDR2和CDR3)的VH、与包含含有SEQ ID NO：25、27和29所示的氨基酸序列的CDR(分别相当于P18-9E的VL中的CDR1、CDR2和CDR3)的VL构成，另一个抗原结合部位可以由包含含有SEQ ID NO：32、34和
36所示的氨基酸序列的CDR(分别相当于P19-7D的VH中的CDR1、CDR2和CDR3)的VH、与包含含有SEQ ID NO：39、41和43所示的氨基酸序列的CDR(分别相当于P19-7D的VH中的CDR1、CDR2和CDR3)的VL构成。三链抗体和四链抗体与双链抗体同样，具有以单链Fv构造为基础的其三聚体、及四聚体构造。也可以分别为三价及四价的抗体片段，为多重特异性抗体。而且，上述“其片段”包含使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(例如参照McCafferty等人，1990，Nature 348卷，552-554)、并且具有抗原结合能力的抗体片段。此外，还希望参照例如Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman & New York(1998)。

[0091] “HCV感染”是指HCV颗粒结合到宿主细胞的细胞表面，在宿主细胞内增殖后释放到细胞外的过程。因此，本说明书中的“抑制HCV感染”是指阻碍或者抑制HCV感染的上述一系列过程中的至少一个。优选抑制HCV结合到宿主细胞的细胞表面的病毒受体的路径和/或HCV基因组侵入宿主细胞内的路径。

[0092] 1-2.作为抗原的HCV颗粒

[0093] 本发明中的抗HCV抗体的特征在于：以产自HCV嵌合基因组的HCV颗粒作为抗原。

[0094] “HCV颗粒”是指由HCV包膜蛋白和其中包装的HCV基因组构成的HCV。

[0095] “HCV嵌合基因组”是指来自不同的二个以上HCV基因组的HCV基因组。例如，HCV基因组通常由从5’一侧向3’一侧由5’非翻译区、核心蛋白编码序列(下称“核心序列”)、E1蛋白编码序列(下称“E1序列”)、E2蛋白编码序列(下称“E2序列”)、p7蛋白编码序列(下称“p7序列”)、NS2蛋白编码序列(下称“NS2序列”)、NS3蛋白编码序列(下称“NS3序列”)、NS4A蛋白编码序列(下称“NS4A序列”)、NS4B蛋白编码序列(下称“NS4B序列”)、NS5A蛋白编码序列(下称“NS5A序列”)、NS5B蛋白编码序列(下称“NS5B序列”)及3’非翻译区构成的RNA构成。因此，“HCV嵌合基因组”由构成HCV基因组的上述各区域不同的二个以上的来自HCV株的区域构成。

[0096] 对构成上述HCV嵌合基因组中各区域的不同的二个以上的HCV株没有特别限定。例如有JFH-1株(基因型2a)、J6CF株(基因型2a)或者TH株(基因型1b)。另外，对构成嵌合基因组的各区域来自哪个HCV株、以及其组合没有特别限定。具体来说，HCV嵌合基因组例如可以使(i)5’非翻译区、核心序列、E1序列、E2序列、p7序列及NS2序列来自JFH-1株以外的毒株，且(ii)NS3序列、NS4A序列、NS4B序列、NS5A序列、NS5B序列及3’非翻译区来自JFH-1株。或者，也可以使(i)5’非翻译区、核心序列、E1序列、E2序列及p7序列来自JFH-1株以外的毒株，且(ii)NS2序列、NS3序列、NS4A序列、NS4B序列、NS5A序列、NS5B序列及3’非翻译区来自JFH-1株。

[0097] 在一个实施方案中，HCV嵌合基因组为从5’一侧向3’一侧使(i)5’非翻译区、核心序列、E1序列、E2序列及p7序列来自J6CF株，且(ii)NS2序列、NS3序列、NS4A序列、NS4B序列、NS5A序列、NS5B序列及3’非翻译区来自JFH-1株的嵌合基因组。优选为使(i)5’非翻译区、核心区域、E1区域、E2区域、p7区域、NS2区域的编码N末端一侧的16位氨基酸残基为止的序列来自J6CF株，且(ii)NS2区域的编码自N末端一侧数17位以后的氨基酸残基的序列、NS3区域、NS4A区域、NS4B区域、NS5A区域、NS5B区域及3’非翻译区来自JFH-1株的嵌合基因组。该嵌合基因组被克隆至由SEQ ID NO：2的核苷酸序列构成的J6/JFH-1中。还可以为使5’非翻译区来自JFH-1株，核心序列、E1序列、E2序列及p7序列来自TH株(Wakita，T.等人，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994，日本特开2004-179)，且NS2序列、NS3序列、NS4A序列、NS4B序列、NS5A序列、NS5B序列及3’非翻译区来自JFH-1株的嵌合基因组，优选为使5’非翻译区来自JFH-1株，核心序列、E1序列、E2序列、p7蛋白及NS2区域的编码N末端一侧33位为止的氨基酸残基的序列来自TH株，NS2区域的编码自N末端一侧数34位以后的氨基酸残基的序列、NS3序列、NS4A序列、NS4B序列、NS5A序列及NS5B序列以及3’非翻译区来自JFH-1株的嵌合基因组。

[0098] 在另一个实施方案中，通过将本说明书中记载的产自HCV嵌合基因组的HCV颗粒用后述的方法灭活，也可以用作疫苗。通过将该疫苗按照该领域中公知的方法对人接种，有可能在接种者的体内直接制造本发明的抗HCV抗体。

[0099] 1-3.HCV颗粒的制备

[0100] 本发明中用作抗原的感染性HCV颗粒可以用细胞培养系制备。这种基本技术记载在WO 04104198A1；WO 06022422A1；WO 06096459A2；Wakita，T.等人，Nat.Med.11：791-796，2005；Lindenbach，BD.等人，Science 309：623-626，2005及Pietschmann，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103：7408-7413，2006中。下面具体说明感染性HCV颗粒的制备。

[0101] 1-3-1.HCV嵌合基因组

[0102] HCV颗粒的制备中可以使用上述“1-2.作为抗原的HCV颗粒”项中记载的HCV嵌合基因组。例如，可以使用具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的核酸。另外，使用的HCV嵌合基因组也可以是RNA或DNA。不过，在核酸为RNA的情况下，上述核苷酸序列中的“胸腺嘧啶(T)”改读为“尿嘧啶(U)”。本说明书中，关于其他核苷酸序列，以下也同样。

[0103] 1-3-2.HCV嵌合基因组RNA的制备

[0104] HCV颗粒可以如下制备：由将完全长度的HCV嵌合基因组RNA的cDNA以能够表达的方式连接至转录启动子下游的表达载体(例如，在T7启动子的控制下插入了HCV嵌合基因组的载体)合成HCV嵌合基因组RNA，将该基因组RNA导入宿主细胞。基因组RNA的合成使用该领域中公知的技术即可。例如，在使用前述的表达载体的情况下，可以通过体外RNA合成法合成基因组RNA。利用体外RNA合成法的各种试剂盒由生命科学相关的各制造商销售(例如，Ambion公司的MEG Ascript T7试剂盒)，因此也可以利用它们进行合成。

[0105] 1-3-3.宿主细胞

[0106] 导入合成的HCV嵌合基因组RNA的宿主细胞只要允许形成HCV颗粒即可，没有特别限定。例如有Huh7、HepG2、IMY-N9、HeLa、HEK293等培养细胞，更优选Huh7等来自肝脏的培养细胞，进一步优选Huh7的衍生株Huh7.5、Huh7.5.1。本发明中“衍生株”是指由某种培养细胞诱导的不同细胞株。另外，在Huh7、HepG2、IMY-N9、HeLa或HEK293中还可以使用表达了CD81基因和/或Claudin1基因的细胞。

[0107] 1-3-4.向宿主细胞导入HCV嵌合基因组RNA的方法

[0108] 将HCV嵌合基因组RNA导入上述宿主细胞的方法可以使用公知的任意方法。例如有磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法、电穿孔法，优选脂质转染法和电穿孔法，更优选电穿孔法。

[0109] 导入了HCV嵌合基因组RNA的宿主细胞中病毒颗粒的产生能力可以通过该领域公知的技术进行评价。例如，可以使用针对构成释放到培养液中的HCV颗粒的蛋白(例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白)的抗体，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)法或者蛋白质印迹法等确认。另外，通过使用特异性引物的RT-PCR法将培养液中的HCV颗粒所含的HCV嵌合基因组RNA扩增来检测，也可以间接地检测HCV颗粒的存在。

[0110] 1-3-5.HCV颗粒的感染能力的验证

[0111] 制备的HCV颗粒是否具有感染能力可以通过该领域中公知的病毒感染的评价方法来确认。例如可以如下判断：将培养导入了HCV嵌合基因组RNA的细胞而获得的上清液进一步添加至新的HCV允许细胞(例如Huh7)中，之后培养适当的时间(例如48小时)。然后，充分洗涤该细胞，用识别抗核心抗体等HCV特异性蛋白的抗体免疫染色，对感染细胞数进行计数；或者由上述细胞提取蛋白，将提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后，通过蛋白质印迹法检测HCV特异性蛋白。

[0112] 1-3-6.HCV颗粒的纯化

[0113] 所得HCV颗粒用作抗原前优选进行纯化。HCV颗粒的纯化可以如下实现：由培养上述导入了HCV嵌合基因组RNA的细胞而获得的、含有感染性HCV颗粒的溶液(病毒液)除去细胞和/或细胞残渣，之后，将柱色谱法和密度梯度离心分别单独进行或按任意的顺序组合进行。细胞及其残渣的除去使用离心和/或过滤器等进行即可。根据需要，上述除去了残渣的病毒液也可以进一步用截留分子量100,000～500,000的超滤膜浓缩至10～100倍左右。

[0114] 上述柱色谱法例如有凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法及亲和色谱法。优选的凝胶过滤色谱法为以烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物作为凝胶基质的色谱法。更优选由Sephacryl(注册商标)S-300、S-400和S-500构成的色谱法。离子交换色谱法有使用Q-Sepharose(注册商标)作为阴离子交换树脂、和使用SP Sepharose(注册商标)作为阳离子交换树脂的方法。亲和色谱法中作为配体，可以将选自肝素、硫酸化Cellulofine、凝集素及各种色素的基质结合而成的树脂用作载体。优选利用HiTrap Heparin HP(注册商标)、HiTrap Blue HP(注册商标)、HiTrap Benzamidine FF(注册商标)和硫酸化Cellulofine以及LCA、ConA、RCA-120和WGA结合而成的载体。更优选通过将硫酸化Cellulofine用作载体的亲和色谱法来纯化HCV颗粒，该方法可以将纯化前和纯化后溶液中的总蛋白量与HCV的RNA拷贝数的比率纯化至30倍以上。

[0115] 作为密度梯度离心中形成密度梯度的溶质，可以使用氯化铯、蔗糖、Nycodenz(注册商标)以及Ficoll(注册商标)和Percoll(注册商标)等糖聚合物。优选蔗糖。作为密度梯度离心中使用的溶剂，可以使用水或者磷酸缓冲液、Tris缓冲液、乙酸缓冲液或甘氨4 9
酸缓冲液等缓冲液。通过密度梯度离心进行纯化时的离心力优选为1×10 ～1×10g，更
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优选为5×10 ～1×10g，进一步优选为5×10 ～5×10g。

[0116] 纯化上述HCV颗粒时的温度优选0～40℃，更优选0～25℃，进一步优选0～10℃。

[0117] 在将密度梯度离心和柱色谱法组合进行纯化的情况下，优选通过多个柱色谱法纯化后使用密度梯度离心的组合。更优选将使用阴离子交换柱、之后用亲和色谱法获得的含HCV颗粒的组分用密度梯度离心进行纯化的组合，进一步优选将通过使用Q-Sepharose(注册商标)的柱色谱法获得的含HCV颗粒的组分用使用硫酸Cellulofine的柱色谱法进一步纯化，将所得含HCV颗粒的组分用密度梯度离心纯化的组合。需要说明的是，在柱色谱法和密度梯度离心的步骤之间或之后，可以通过使用透析或超滤进行含HCV颗粒的溶液的溶质置换和/或HCV颗粒的浓缩。

[0118] 1-3-7.HCV颗粒的灭活

[0119] 本发明的抗HCV抗体的制作中，在给予人以外的动物的情况下，用作抗原的HCV颗粒的灭活处理不是必须的。然而，从防止感染操作者的角度来看，优选灭活。另外，在将产自上述HCV嵌合基因组的HCV颗粒作为疫苗给予人的情况下，该灭活处理是必须的。作为将HCV颗粒灭活的方法，可以通过将福尔马林、β-丙内酯、戊二醛等灭活剂例如添加到含有感染性HCV颗粒的病毒液中充分混合来实现(Appaiahgari等人，Vaccine，22：3669-3675，2004)。还可以通过对含有感染性HCV颗粒的病毒液照射紫外线，使HCV的感染性迅速丧失。
从对构成HCV的蛋白等的影响小的角度来看，用紫外线照射进行灭活的方法是优选的。紫外线的线源可以使用一般市售的杀菌灯，特别是15W杀菌灯，但并不限于此。优选可以通过
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用20mW/cm 的紫外线将含感染性HCV颗粒的溶液在室温下照射5分钟以上来灭活感染性HCV颗粒。另外，本灭活方法不受纯化、未纯化等状态限制。

[0120] 1-4.抗HCV抗体的制备

[0121] 1-4-1.对动物的免疫

[0122] 本发明的抗体可以通过将HCV颗粒给予动物，由免疫反应诱导来获得。作为免疫所用的动物，只要是可产生有可能制作杂交瘤的抗体产生细胞的非人动物即可，没有特别限定。例如，可以使用非人哺乳动物，更具体为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、驴、羊、骆驼和马等。本发明在下面将举出使用小鼠的方法作为例子。

[0123] 将通过上述方法获得的HCV颗粒作为抗原(免疫原)对4～10周龄的小鼠进行免疫，根据需要，可以变更、省略HCV颗粒的纯化步骤，也可以省略HCV颗粒的灭活。

[0124] 将作为免疫原的HCV颗粒溶解于缓冲液中制备免疫原溶液。此时，为了有效地进行免疫，必要时可以添加佐剂。佐剂例如可以将弗氏完全佐剂(下称“FCA”)、弗氏不完全佐剂(下称“FIA”)、氢氧化铝凝胶、百日咳菌疫苗、Titer Max Gold(Vaxel公司)、GERBU佐剂(GERBU Biotechnik公司)、MPL(Monophosphoryl Lipid A，单磷酸类脂A)+TDM(synthetic trehalose dicorynomycolate)(Sigma佐剂体系；Sigma公司)等单独或混合使用。

[0125] 接着，将上述制备的免疫原溶液给予小鼠(例如近交系小鼠的BALB/c)进行免疫。免疫原溶液的给予方法例如有：使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射、或者使用0.15mol/L氯化钠的静脉注射，但不限于此。免疫原的1次给予量是根据免疫动物的种类、给予途径等适当决定的，通常按每只动物约50～200μg即可。另外，对免疫的间隔没有特别限定，间隔数天至数周，优选间隔1～4周。优选在初次免疫后进行追加免疫，其次数为2～6次，优选3～4次。优选在初次免疫之后，由免疫小鼠的眼底静脉丛或尾静脉采血，通过ELISA法等测定血清中的抗体效价。还可同时测定感染抑制活性。如果抗体效价达到稳定，将免疫原溶液注射到静脉内或腹腔内，作为最终免疫即可。最终免疫中优选不使用佐剂。在最终免疫后第3～10天，优选第4天，由免疫小鼠采血，通过按公知的方法(Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，1988)处理血清可以获得多克隆抗体。需要说明的是，关于免疫的动物是否产生具有本发明的HCV感染抑制活性的抗HCV抗体，优选在最终免疫之前，通过前述“1-3-5.HCV的感染能力的验证”及后述的“1-4-6.抗HCV抗体的选择”中记载的方法预先加以确认。

[0126] 1-4-2.产生抗HCV单克隆抗体的杂交瘤细胞的制作

[0127] 在制作抗HCV单克隆抗体的情况下，产生该抗体的杂交瘤例如可以通过下面记载的方法制作。

[0128] 首先，由上述免疫的小鼠采集抗体产生细胞。抗体产生细胞有脾细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等，优选脾细胞或局部淋巴结细胞。接着，通过进行抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合，可以制作生产抗HCV单克隆抗体的杂交瘤。细胞融合中使用的骨髓瘤细胞为来自小鼠的确立细胞株，可在体外增殖的骨髓瘤细胞即可，没有特别限定，为了在后述的步骤中简便地选拔杂交瘤，优选具有药剂选择性、在未融合的状态下在选择培养基(例如HAT培养基，即，向Dulbecco’s改良MEM培养基(下称“DMEM”)中加入-5了5×10 M 2-巯基乙醇、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素及10％胎牛血清(下称-4 -5 -7
“FCS”)、10 M次黄嘌呤、1.5×10 M胸苷及4×10 M氨基蝶呤的培养基)中无法生存、仅在与抗体产生细胞融合的状态下具有可生育性质的骨髓瘤细胞。例如，可以使用8-氮鸟嘌呤耐性小鼠(来自BALB/c)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、P3-X63-Ag8653(653)、P3-X63-Ag8(X63)、P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)等。这些细胞株可购自理化学研究所生物资源中心、ATCC(American Type Culture Collection，美国模式培养物保藏中心)或者ECACC(European Collection of Cell Cultures，欧洲细胞培养物保藏中心)，关于这些细胞株的培养和继代，按照公知的方法(例如Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，1988，Selected Methods in Cellular Immunology W.H.Freeman and Company，1980)培养即可。

[0129] 使上述抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合时，将上面获得的脾细胞和骨髓瘤细胞洗涤之后，在不含血清的DMEM培养基、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基中，将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞按约1∶1～20∶1的比例混合，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应即可。作为细胞融合促进剂，可以将平均分子量1,500～4,000Da的聚乙二醇(下称“PEG”)等以约10～80％的浓度使用。通常，优选使用平均分子量1,500Da的PEG。为了提高融合效率，也可以根据需要结合使用二甲基亚砜等辅助剂。还可以使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售细胞融合装置使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合(Nature，1977，266卷，550-552)。

[0130] 细胞融合处理后，用骨髓瘤细胞的培养中使用的培养基(例如向DMEM培养基中加-5入了5×10 M 2-巯基乙醇、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素及10％FCS的培养基)洗涤细胞，之后制备细胞悬浊液，接着将细胞悬浊液用例如含有FCS的RPMI1640培养基等
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适当稀释，之后按2×10 个/孔左右加入96孔板中，向各孔中加入选择培养基，以后适当地交换选择培养基进行培养即可。培养温度为20～40℃，优选约37℃。在骨髓瘤细胞为HGPRT缺失株或胸苷激酶(TK)缺失株的情况下，通过使用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸苷的选择培养基(HAT培养基)，可以仅选择性生育、增殖抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤，因此可以将开始在选择培养基中培养后约10天前后生育的细胞选作杂交瘤。

[0131] 1-4-3.HCV感染抑制活性试验

[0132] 关于上述杂交瘤产生的抗体有无HCV感染抑制活性，可以通过下面例示的方法、以及后述的实施例中所述的使用感染性HCV颗粒的方法进行评价。例如，首先，培养上述产生抗HCV单克隆抗体的杂交瘤，之后采集培养上清液的一部分作为抗体样品。将该抗体样品与前述的感染性HCV颗粒混合，在37℃下反应1小时(混合样品)。接着，向前一天在963
孔板中按5×10 个/孔培养的Huh7细胞中加入50μL上述混合样品，在37℃下培养2.5小时。培养后除去培养液和混合样品，用PBS洗涤细胞后再加入新鲜培养基继续培养。48小时后，除去培养液，用PBS洗涤1次后加入100μL ISOGEN(Nippon Gene公司)，由细胞制备RNA。定量RNA后测定HCV基因组RNA量。用定量RT-PCR进行的HCV RNA的检测按照Takeuchi等的方法(Gastroenterology，116：636-642，1999)检测HCV RNA的5’非翻译区的RNA即可。

[0133] 评价HCV感染抑制活性的其他方法有如下方法。首先，将得自产生抗HCV单克隆抗体的杂交瘤株的抗体样品与感染性HCV颗粒混合，在37℃下反应1小时(混合样品)。接4
着，向前一天在96孔板中按1×10 个/孔培养的Huh7细胞中加入50μL上述混合样品，在
37℃下培养2.5小时。培养后除去培养液及混合样品，用PBS洗涤细胞后再加入新鲜培养基继续培养。72小时后，除去培养液，之后将板浸入冰冷却的甲醇中固定细胞。之后，风干除去甲醇，用含0.3％Triton(注册商标)-X100的Block Ace(注册商标)(大日本制药公司)进行细胞的可溶化处置。然后，用克隆2H9抗HCV-核心抗体(参照Nat Med.(2005)11：
p791-6.)及山羊抗小鼠IgG-Alexa488(Molecular Probe公司)将HCV感染细胞在荧光显微镜下计数，可以将抑制了HCV感染的孔的抗体样品选作具有HCV感染抑制活性的抗HCV单克隆抗体。

[0134] 作为其他方法，也可以使用通过在逆转录病毒颗粒上提呈功能性HCV包膜蛋白而制作的感染性HCV样颗粒(下称“HCVpp”)来代替感染性HCV颗粒，进行HCV感染抑制活性试验。通过向该HCVpp中包装绿色荧光蛋白(GFP)标记基因或荧光素酶基因，有可能以高可靠性迅速地测定HCV包膜蛋白介导的感染(Bartosch，B.等人，J.Exp.Med.197：633-642，2003)。具体来说，例如，具有基因型2a的包膜蛋白的HCVpp可以如下获得：通过使用FuGENE6(Roche公司：目录号11814443001)，将编码基因型2a的HCV株即J6CF株的蛋白(NCBI蛋白质登录号AAF01178.1)的132位的氨基酸残基至750位的氨基酸残基(相当于核心蛋白的一部分、E1蛋白和E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1的载体“pcDNA J6dC-E2”、将编码小鼠白血病病毒的gag和pol的基因克隆化的表达载体“Gag-Pol 5349”、以及将荧光素酶基因克隆化的逆转录病毒载体“Luc126”转染到HEK 293T细胞(ATCC CRL-1573)后，回收含HCVpp的培养液，用0.45μm的薄膜滤器过滤而获得。

[0135] 在制作携带有基因型1a的包膜蛋白的HCVpp的情况下，使用将编码基因型1a的HCV株即H77株的蛋白(NCBI蛋白登录号AAB67036.1)的132位的氨基酸残基至746位的氨基酸残基(相当于核心蛋白的一部分、E1蛋白和E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1的载体“pcDNA H77dC-E2”代替上述的pcDNA J6dC-E即可。

[0136] 在制作携带有基因型1b的包膜蛋白的HCVpp的情况下，使用将编码基因型1b的HCV株即TH株的蛋白(Wakita，T.等人，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994)的132位的氨基酸残基至747位的氨基酸残基(相当于核心蛋白的一部分、E1蛋白和E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1的载体“pcDNA THdC-E2”代替上述的pcDNA J6dC-E即可。

[0137] 例如，将得自产生抗HCV单克隆抗体的杂交瘤株的抗体样品与HCVpp混合，在37℃下反应约30分。抗体样品的稀释用DMEM培养基(含有10％FCS、1％MEM非必需氨基酸溶4
液、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠)进行。将Huh7.5.1细胞在96孔板中按1×10细胞/孔培养一天，向各孔中加入上述HCVpp与抗体样品的混合液，在37℃下培养约3小时。培养后除去样品，用PBS洗涤细胞1次，之后加入新鲜培养基继续培养。约72小时后，除去培养液。用PBS洗涤4次左右，之后分别按25μL/孔加入无血清DMEM培养基和溶解缓冲液(例如可以使用Steady-Glo(Promega公司：目录号E2520))，溶解细胞(使用试剂盒时，原则上按照所附的使用说明书)，将细胞的溶解液按40μL/孔移至白色的96孔板(例如住友Bakelite公司：目录号MS-8496W)，使用例如ARVO X4(PerkinElmer公司)的可测定荧光的装置测定发光强度。以与DMEM混合时的发光强度(％)作为感染率100％，可以求出与抗体样品混合时的感染率(％)。因此，可以将因添加抗体样品而感染率降低(即发光强度减弱)的抗体样品作为具有HCV感染抑制活性的抗HCV单克隆抗体。

[0138] 需要说明的是，产生本发明抗体的杂交瘤只要是通过上述方法选择的杂交瘤即可，没有特别限定。具体的例子有例如后述的产生本发明的具有HCV感染抑制活性的单克隆抗体“P18-9E”或“P19-7D”的杂交瘤株。

[0139] 1-4-4.抗HCV抗体的制备

[0140] 将上面选择的杂交瘤在无血清培养基，例如Hybridoma-SFM(Invitrogen公司)中驯化，可以将培养的上清液作为抗HCV抗体样品(抗HCV单克隆抗体样品)。培养中可以使用培养瓶(flask)、培养皿(dish)、旋动培养瓶、转瓶或者高密度培养的培养瓶CELLine(Becton Dickinson公司)。

[0141] 在使用动物制备单克隆抗体的情况下，对降植烷处理(腹腔内给予0.5mL 2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷)后饲养2周)过的8～10周龄小鼠、裸鼠或SCID小鼠按
7 6
2×10 ～5×10 细胞/匹腹腔内注射上面选择的产生抗HCV单克隆抗体的杂交瘤细胞。
在10～21天期间杂交瘤腹水癌化。由该小鼠采集腹水，可以将其作为抗HCV单克隆抗体样品。将所得抗体样品离心，除去细胞或其破碎物，单独或者组合使用以40～50％饱和硫酸铵进行的盐析、辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、Protein A柱、Protein G柱、HiTrap IgM Purification HP柱(GE Healthcare公司)、甘露聚糖结合性蛋白柱(Pierce公司)或者凝胶过滤柱等，回收IgG或者IgM组分，可以获得纯化抗HCV单克隆抗体。纯化单克隆抗体的亚型的确定也可以使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Pierce公司)等来进行。本发明的具有HCV感染抑制活性的抗体的类别没有特别限定，优选为IgG或者IgM，更优选为IgM的抗体。

[0142] 1-4-5.抗HCV人源化抗体的制作

[0143] 抗HCV人源化抗体中，选择CDR可形成良好的抗原结合部位的人抗体的FR。也可以根据需要，取代抗体的V区中FR的氨基酸，使重构人抗体的互补性决定区域形成适当的抗原结合部位(Sato，K.，等人，Cancer Res.53：851-856，1993)。

[0144] 在制作本发明的抗HCV人源化抗体的情况下，作为一个例子，首先，由产生抗HCV单克隆抗体的杂交瘤等提取mRNA，合成编码VH和VL的cDNA。将合成的cDNA插入噬菌体或者质粒等载体中，制作cDNA库。将小鼠抗体的C区部分或者V区部分用作探针，由cDNA库分别分离具有编码VH的cDNA的重组噬菌体或者重组质粒、及具有编码VL的cDNA的重组噬菌体或者重组质粒。确定重组噬菌体或者重组质粒上的目标抗体的VH和VL的全核苷酸序列，由核苷酸序列推定VH和VL的全氨基酸序列。

[0145] 作为其他方法，使用PCR克隆编码VH和VL的cDNA也是可能的。以如前所述制备的杂交瘤的cDNA作为模板，使用基于各自的基因中保存的氨基酸序列而设计的多个引物进行扩增，将其cDNA片段克隆至克隆载体，可以获得编码VH和VL的cDNA。

[0146] 通过在编码人抗体的CH和CL的基因的上游插入编码上述抗HCV抗体的VH和VL的cDNA，可以构建编码人抗HCV单克隆抗体的cDNA。CH中可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，CL中可以使用Cκ、Cλ。另外，为了改善抗体或其产生的稳定性，也可以修饰C区。

[0147] 在以哺乳动物细胞作为宿主的情况下，可以使用能够在哺乳动物细胞中表达的启动子、抗体基因以及其3’末端的下游功能性结合有PolyA信号的表达载体来表达该基因。可以使用的启动子例如有：人巨细胞病毒、逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子、或者延伸因子1α(EF1α)等来自哺乳细胞的启动子/增强子等。

[0148] 在以大肠杆菌作为宿主的情况下，可以使用能够在大肠杆菌中表达的启动子、用于抗体分泌的信号序列和抗体基因功能性结合的表达载体来表达该基因。启动子例如有lacZ启动子、araB启动子、Trp启动子、T7启动子等。

[0149] 在以昆虫细胞作为宿主的情况下，可以使用能够在昆虫细胞中表达的启动子、要表达的抗体基因以及其3’末端的下游功能性结合有PolyA信号的表达载体来表达该基因。可使用的启动子例如有多角体蛋白启动子、来自杆状病毒OpNMPV的极早期OpIE2启动子等。

[0150] 本发明中的抗HCV人源化抗体通过按照常规方法，在适当条件下培养含有表达该抗体的上述表达载体的宿主细胞，在其培养液上清或者宿主细胞内产生。具体来说，例如，5
在以哺乳动物的培养细胞作为宿主的情况下，通过向DMEM培养基中以1×10 细胞/mL接种宿主细胞，在37℃的5％CO2培养箱中培养，可以获得含有抗体的培养液上清。另外，例如，在以大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，通过接种到LB培养基等大肠杆菌培养所用的一般培养基中进行培养，诱导蛋白的表达，可以在培养液上清或者宿主细胞内产生抗体。

[0151] 需要说明的是，通过使用Protein A柱、Protein G柱、抗免疫球蛋白抗体亲和柱等对C区进行选择，可以从培养液上清或细胞破碎液中纯化、回收目标抗HCV人源化抗体。

[0152] 1-4-6.抗HCV抗体的选择

[0153] 为了选择本发明的抗HCV抗体，将HCV的蛋白固定(固相化)于载体上，接着加入样品抗体，在足以形成抗体/抗原复合物的时间和条件下进行反应。接着，为了检测形成的复合物，使其与二次抗体(即识别结合了作为信号的酶、色素或放射性同位素的样品抗体的抗体)接触，形成第2混合物。使第2混合物在足以形成抗体/抗原复合物的时间和条件下反应。由此，通过酶、色素或放射性同位素的信号来检测识别HCV蛋白的抗体的存在。

[0154] 作为固相化于载体上的HCV的蛋白，可以使用HCV颗粒本身，也可以使用由HCV基因组中的核心序列、E1序列、E2序列、p7序列、NS2序列、NS3序列、NS4A序列、NS4B序列、NS5A序列或者NS5B序列构成的cDNA在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等中表达的编码这些区域的蛋白，还可以化学合成该蛋白使用。固相化中使用的蛋白的氨基酸残基的长度没有限定，为3个氨基酸残基以上，优选8个氨基酸残基以上即可。

[0155] 下面示出在哺乳动物细胞中表达JFH-1株或J6CF株的包膜蛋白即E1蛋白和E2蛋白的例子。JFH-1株或J6CF株(JFH1株：NCBI蛋白登录号BAB32872、J6CF株：NCBI蛋白登录号AAF01178.1)的E1蛋白在以JFH-1株全长蛋白的氨基酸序列的起始甲硫氨酸作为第1位的情况下，为始自192位的氨基酸残基止于383位的氨基酸残基。该E1蛋白的353位的氨基酸残基至383位的氨基酸残基被认为是跨膜域(也称C末端疏水性区域)(Cocquerel，L.等人，J.Virol.74：3623-3633，2000)。

[0156] JFH-1株或J6CF株的E2蛋白为始自上述氨基酸序列的384位的氨基酸残基止于750位的氨基酸残基。该E2蛋白的722位的氨基酸残基至750位的氨基酸残基被认为是跨膜域(Cocquerel，L.等人，J.Virol.74：3623-3633，2000)。

[0157] 利用哺乳动物细胞使蛋白在培养上清液中分泌表达的情况下，该蛋白需要携带信号肽，不具有跨膜域。

[0158] 因此，E1蛋白和E2蛋白的不含跨膜域的蛋白分别由上述的192位至352位的氨基酸残基、及384位至721位的氨基酸残基构成，如果在性质上等价，氨基酸移位也没有问题。在JFH-1株的E1蛋白的情况下，若为192位至352位的氨基酸残基内的序列，在E2蛋白的情况下，若为384位至720位的氨基酸残基内的序列、优选384位至714位的氨基酸残基内的序列，则可以用作不含跨膜域的蛋白。另外，在J6CF株的E1蛋白的情况下，若为192位至352位的氨基酸残基内的序列，在E2蛋白的情况下，若为384位至720位的氨基酸残基内的序列，则可以用作不含跨膜域的蛋白。在将这些氨基酸残基的编号适用于其他HCV株的氨基酸序列的情况下，在与上述JFH-1全长蛋白的氨基酸序列的序列对比中以对应的氨基酸残基的编号指定即可。

[0159] 编码不含E1蛋白和E2蛋白的跨膜域的蛋白的核酸可以基于GenBank中记载的JFH-1株的核酸序列(NCBI核苷酸登录号AB047639)，以JFH-1株的cDNA为模板通过PCR合成，或者通过全合成制作。

[0160] JFH-1株以外的HCV株的对应E1蛋白和E2蛋白的区域能够如下容易地确定：边考虑取代或缺失其HCV株的序列，边进行整列(序列对比)以使与JFH-1株的序列相比序列间一致的序列最大。该分析可以使用基因信息处理软件(例如GENETYX，Software开发株式会社)进行。

[0161] 使不含E1蛋白和E2蛋白的跨膜域的蛋白在哺乳动物细胞中分泌表达时，在密码子的读框符合的状态(符合读框)下将编码该蛋白的核酸连接到编码信号肽的核酸的下游，再在其3’末端添加终止密码子插入表达载体中。信号肽由分泌蛋白的N末端存在的15～30个氨基酸残基、主要为疏水性氨基酸构成，参与蛋白的细胞膜通透机制。

[0162] 可用于在哺乳动物细胞中分泌表达蛋白的信号肽是分泌蛋白的信号肽即可。作为携带信号肽的载体，例如有携带小鼠GM-CSF的信号肽序列的载体(日本特开昭
63-276490)、携带IgGκ链的信号肽序列的载体pSecTag/FRT/V5-His(Invitrogen公司)、携带前胰蛋白酶原的信号肽序列的载体p3XFLAG-CMV13(Sigma公司)、携带IL-2的信号肽序列的载体pFUSE-Fc2(Invivogen公司)以及携带IgM的信号肽序列的载体pTriEx-7(Novagen公司)等。

[0163] 表达蛋白时，以目标蛋白与标记蛋白的融合蛋白形式表达，可以用抗标记蛋白的抗体或与标记蛋白特异性结合的分子来进行融合蛋白的检测或纯化。这种标记蛋白也称为标签(Tag)。对标记蛋白没有限定，例如有FLAG肽(也称为flag肽或Flag肽)、3×FLAG肽(也称为3×FLAG肽、3×Flag肽或3×flag肽)、HA肽、3×HA肽、myc肽、6×His肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ域多肽、碱性磷酸酶、免疫球蛋白、抗生物素蛋白等。这些肽或多肽通常融合到目标蛋白的N末端或C末端，但根据情况也可以插入目标蛋白内。另外，携带前胰蛋白酶原信号肽和3×FLAG肽的融合多肽的载体可以作为p3×FLAG-CMV-9购自Sigma公司。

[0164] 1-4-7.抗体表位的分析

[0165] 本发明涉及的更优选的具有HCV感染抑制活性的抗体可以将HCV的、优选J6CF株的E1蛋白和E2蛋白的复合物的立体构造识别为表位，即本发明涉及的优选的抗体可以将E1蛋白和E2蛋白的复合物的三级构造的全部或者一部分识别为表位。E1蛋白和E2蛋白是参与和宿主细胞表面上的受体(HCV受体)结合的包膜蛋白，HCV经由该HCV受体感染宿主细胞。据报导，CD81被鉴定为该HCV受体的一种，是HCV感染的一个必需因子(Akazawa等人，J.Virol.81：5036-5045，2007)。因此，认为维持感染细胞的能力的HCV保持着可与CD81结合的E1蛋白和E2蛋白的复合物的立体构造。

[0166] 本发明的抗HCV抗体将HCV中的E1蛋白和E2蛋白的复合物的立体构造的全部或者一部分识别为表位，与其结合。本发明的抗HCV抗体通过与E1蛋白和E2蛋白的复合物结合，抑制感染性HCV的E1蛋白和E2蛋白与宿主细胞上的CD81结合。结果，HCV的感染能力丧失。因此，本发明的抗HCV抗体与带有感染性的多种HCV具有结合能力，可抑制HCV感染。

[0167] 已知HCV是容易发生变异的病毒，将边发生变异边增殖的带有多样性的HCV的集合体称为“准种(quasispecies)”。HCV的E2蛋白的N末端具有氨基酸的变异频繁的称为超变区(hypervariable region，下称“HVR”)的区域。目前已知的具有HCV感染抑制活性的抗体显示以该变异频繁区域的肽作为表位(Farci等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15394-15399，1996；Shimizu等人，J.Virol.68：1494-1500，1994；Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：8449-8454，2007)。然而，有报导指出以HVR作为表位的抗体因HCV的变异会丧失某一方面的效果(Farci等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7792-7796，1994；
Weiner等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3468-3472，1992；Kato等 人，J.Virol.67：
3923-3930，1993)。因此，抗HCV抗体的表位优选为HVR以外的表位。

[0168] 本发明的抗HCV抗体是将由E1蛋白和E2蛋白的复合物构成的立体构造识别为表位的抗HCV抗体，不同于仅以HVR作为表位的现有的具有HCV感染抑制活性的抗HCV抗体，因此可以期待由于HCV的准种而不丧失感染抑制效果。

[0169] 为了分析通过上述方法选择的杂交瘤细胞株产生的本发明的抗体的表位，可以使用采用了HCV蛋白的酶免疫测定(EIA)、蛋白质印迹法或者点渍法等。通过进行作为抗HCV单克隆抗体的一次筛选的该表位分析，可以有效筛选以特定的HCV蛋白作为标的的抗HCV单克隆抗体。

[0170] 2.HCV感染抑制剂

[0171] 本发明的其他方案是HCV感染抑制剂。

[0172] 本发明的“HCV感染抑制剂”是以前述的本发明的抗HCV抗体作为有效成分，可以抑制HCV感染宿主细胞过程中必要的、至少一种功能的物质。本发明的HCV感染抑制剂可以单独用作药物，或者用作药物组合物的有效成分，优选用作丙型肝炎的治疗用或预防用药物，另外还可用作用于阐明HCV的感染机理的研究工具。

[0173] 2-1.药物组合物

[0174] 本发明的HCV感染抑制剂可以用于药物组合物。本发明的药物组合物可以含有作为药物的本发明的抗HCV抗体以及药学上可接受的载体。

[0175] “药学上可接受的载体”是指制剂技术领域中通常能使用的溶剂和/或添加剂。

[0176] 药学上可接受的溶剂例如有：水、药学上可接受的有机溶剂(例如乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯类)。希望对这些溶剂进行灭菌，根据需要优选调整至与血液为等渗的。

[0177] 药学上可接受的添加剂例如有：胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物添加物可接受的表面活性剂等。

[0178] 此外，还可以根据需要，含有赋形剂、结合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂、润滑剂、矫味矫臭剂、溶解辅助剂(增溶剂)、悬浊剂、稀释剂、表面活性剂、稳定剂、吸收促进剂、增量剂、润湿剂、保湿剂(例如甘油和淀粉)、吸附剂、崩解抑制剂、包衣剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、风味剂、甜味剂、缓冲剂等。

[0179] 上述溶剂和/或添加剂可以根据使用的本发明的药物组合物的剂型单独或适当组合使用。例如，在用作注射用制剂的情况下，可以使用将纯化的抗HCV抗体溶解于溶剂(例如生理盐水、缓冲液和葡萄糖溶液)中，向其中添加防吸附剂(例如吐温80、吐温20、明胶和人血清白蛋白)而成的制剂。或者，为了制成使用前溶解重构的剂型，也可以为冻干的制剂。例如，可以使用用于冻干的赋形剂(例如甘露醇、葡萄糖等糖醇或糖类)。

[0180] 本发明的药物组合物可以按照常规方法来制剂化。关于制剂化，希望参照例如Remington’s Pharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A.。

[0181] 本发明的药物组合物也可以结合已有的抗病毒剂，例如干扰素、病毒唑等来使用。

[0182] 2-2.药物组合物的给予方法

[0183] 本发明的含有HCV感染抑制剂的药物组合物优选根据给予单位剂型(unit dosage form)进行给予，可以经口给予、组织内给予(例如皮下给予、肌内给予和静脉内给予)、局部给予(例如经皮给予)或者经直肠给予。因此，优选HCV感染抑制剂的剂型为适合给予方法的剂型。例如，在组织内给予的情况下，优选经血流注射，因此剂型为液体。

[0184] 在注射的情况下，对注入部位没有特别限定。例如有静脉内、动脉内、肝脏内、肌内、关节内、骨髓内、髓腔内、心室内、经皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、肠内或者舌下等。优选静脉内注射或者动脉内注射等向血管内的注射。这是由于经由血流本发明的药物组合物可以迅速遍布全身，另外侵袭性比较低，对受试者产生的负担小。或者，也可以注射到肝脏内或肝门静脉。这是由于可以使HCV感染抑制剂直接作用于HCV局部存在的部位。

[0185] 在给予上述HCV感染抑制剂的情况下，优选一个给予单位中含有能发挥HCV感染抑制活性的有效量。在本说明书中使用时，“有效量”是指有效成分在发挥其功能上必要的量，即，本发明中HCV感染抑制剂在抑制HCV感染上必要的量，且对给予的受试者几乎没有或者完全没有有害的副作用的量。该有效量能够根据受试者的信息、剂型及给予途径等各种条件而变化。“受试者的信息”包括疾病的进展程度或者严重程度、全身的健康状态、年龄、体重、性别、饮食生活、药剂感受性、有无联用药物以及对治疗的耐受性等。上述HCV感染抑制剂的最终给予量及有效量根据各个受试者的信息等，由医师判断决定。在需要大量给予上述HCV感染抑制剂来获得HCV感染抑制效果的情况下，为了减轻受试者的负担，也可以分数次给予。

[0186] 作为具体给予量的一个例子，例如，在给予丙型肝炎发病初期、不必联合使用其他药物的成年男人(体重60kg)的情况下，每天的HCV感染抑制剂的有效量通常在1～2000mg，优选1～1000mg，更优选1～500mg的范围内。根据受试者的状态或者给予途径等，也可以给予不足上述范围或者超过上述范围的用量。

[0187] 在将本发明的HCV感染抑制剂给予受试者的情况下，作为有效成分的本发明抗体的有效给予量在每次每kg体重0.001mg～1000mg的范围内选择。或者，可以选择每名受试者0.01～100000mg/人的给予量，但不限于这些给予量。另外，作为上述给予时期，可以不考虑是在疾病的临床症状发生之前还是之后来给予。

[0188] 本发明的具有HCV感染抑制活性的抗体对任意的丙型肝炎有效，例如对慢性肝炎或者暴发型肝炎有效，另外对基因型2a或者1b的HCV引起的丙型肝炎特别有效。

[0189] 3.HCV检测方法

[0190] 本发明的其他方案是HCV的检测方法及该方法中使用的HCV检测试剂。本发明可以使用本发明的抗HCV抗体通过免疫学检测方法检测试样中的HCV颗粒。

[0191] 本说明书中“试样”是指能够含有HCV颗粒或者其包膜蛋白的各种试样。例如，培养细胞、培养细胞破碎液、培养液上清、或者人试样。人试样是采自人的组织(例如术后采集的组织)、血液、血清、血浆、尿、脑脊液、唾液、淋巴液、精液等体液等所有来自人的生物试样，优选血液、血清、血浆或者尿。另外，本发明中的试样不仅可以是液体试样，也可以是固体试样。例如，可以使用脏器移植的捐赠者的脏器、或者组织切片标本等。

[0192] 本发明的“免疫学检测方法”可以通过ELISA法、EIA法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法或者发光免疫测定法等使用标记抗体的公知的免疫学检测法、或者表面等离振子共振法(SPR法)、石英晶体微天平测定法(QCM法)实施，优选适用于使用标记抗体的免疫学检测法中。

[0193] ELISA法也称为酶免疫吸附分析法，是使用酶标记的抗体或者抗原，利用该酶的作用基于发色浓度或荧光强度检测抗原抗体反应，由此来定量试样中所含微量的标的抗原的方法。即，将本发明的抗HCV抗体或者HCV颗粒固定在固相载体上，酶促检测该抗体等和HCV的免疫学反应的方法。关于ELISA法的测定方法，希望参照公知的方法(日本临床病理学会编的“臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検查のためのイムノアツセイ-技術と応用-”，临床病理刊行会，1983年；石川荣治等人编的“酵素免疫測定法”，第3版，医学书院，1987年；北川常广等人编的“タンパク質核酸酵素別冊No.31酵素免疫測定法”，共立出版，
1987年；入江实编的“ラジオイムノアツセイ”，讲谈社Scientific，1974年；入江实编的“続ラジオイムノアツセイ”，讲谈社Scientific，1979年)。上述固相载体可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖(agarose)、纤维素、琼脂糖凝胶(sepharose)、玻璃、金属、陶瓷或者磁性体等材质形成的珠、微板、试验管、棒或者试验片等形状的不溶性载体。本发明的抗HCV抗体或者HCV颗粒在固相载体上的固定可以按照物理吸附法、化学结合法或者二者并用的方法等公知的方法使该HCV抗体或者HCV颗粒结合到固相载体上来实现。

[0194] 作为标记抗HCV抗体的标记物质，例如在ELISA法的情况下，可以使用过氧化酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶或者生物素-抗生物素蛋白复合物等，在荧光免疫测定法的情况下，可以使用异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、取代罗丹明异硫氰酸酯、二氯三嗪异硫氰酸酯、Alexa480或3 125
者AlexaFluor488等，在放射免疫测定法的情况下，可以使用氚(H)、碘125( I)或者碘
131
131( I)等，但不限于这些。另外，发光免疫测定法可以使用NADH-FMNH2-荧光素酶系、鲁米诺-过氧化氢-POD系、吖啶酯系或者二氧杂环丁烷化合物系等。在ELISA法的情况下，标记抗原与抗体的结合法可以使用戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或者过碘酸法等公知的方法，在放射免疫测定法的情况下，标记抗原与抗体的结合法可以使用氯胺T法、Bolton-Hunter法等公知的方法。

[0195] 本发明的免疫学测定方法还可以通过基于透过光或散射光的光学方法测量或者目视测量免疫比浊法、胶乳凝聚反应、胶乳比浊法、红细胞凝聚反应或者颗粒凝聚反应等生成的免疫复合物凝聚物的测定法来实施。在这种情况下，作为溶剂可以使用磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液或者Good缓冲液等，还可以含有PEG等的反应促进剂或非特异性反应抑制剂。

[0196] 下面，作为本发明的HCV检测方法的具体例子，就适用ELISA法的情况进行简单说明。首先，将本发明的抗HCV抗体固相化于不溶性载体上。需要说明的是，固相化的抗体只要特异性识别HCV颗粒即可，可以为1种，也可以为多种。接着，使能够含有HCV颗粒的试样与固相化抗体的表面作用，在载体表面形成固相化抗体与HCV颗粒的复合物。之后，通过用洗涤液充分洗涤，除去试样中存在的HCV颗粒以外的未结合的物质。再制作特异性识别HCV颗粒的其他抗HCV标记抗体，使该标记抗体、与固相化抗体和HCV颗粒的复合物所结合的载体作用，通过用洗涤液充分洗涤后利用标记进行检测，可检测试样中存在的HCV颗粒。

[0197] 也可以先将标记抗体和含有HCV颗粒的试样混合而形成抗原抗体复合物，之后使其与固相化抗体作用。如果将固相化抗体用生物素标记，在将生物素化固相化抗体、含有HCV颗粒的试样、实施了生物素以外的标记的抗体全部混合形成抗原抗体复合物之后，通过使抗生物素蛋白与固相化的载体作用，可以利用生物素化以外的标记检测抗原抗体复合物。

[0198] 本发明的免疫学测定方法还可以使用免疫色谱法用试验片条。免疫色谱法用试验片条例如由下述部分构成：由容易吸收试样的材料构成的试样接收部分；含有本发明诊断药的试剂部分；试样与诊断药的反应物进行移动的展开部分；，使展开的反应物显色的标记部分；显色的反应物进行展开的提示部分等。例如，市售的妊娠诊断药等具有与此同样的形态。本测定方法的原理如下：首先，向试样接收部分供给试样，试样接收部分吸收试样，使试样到达试剂部分。接着，在试剂部分，试样中的HCV与前述的抗HCV抗体发生抗原抗体反应，反应复合物在展开部分移动到达标记部分。在标记部分上述反应复合物与标记二次抗体发生反应，其与标记二次抗体的反应物展开至提示部分，确认显色。上述免疫色谱法用试验片条侵袭性极低，根本不会给使用者带来痛苦或者因使用试剂而产生危险性，因此可用于家庭中的监测器，将其结果在各医疗机关等级进行精查和/或治疗(外科的切除等)，可以预防转移和/或复发。另外，这种试验片条在可廉价地大量生产这一点上也很便利。

[0199] 根据本发明的方案，可以检测试样中的HCV颗粒和/或其包膜蛋白。由此，可以将经由捐赠者的血液或脏器发生的HCV感染防患于未然。

[0200] 4.HCV检测用试剂盒

[0201] 本发明的其他方案是含有本发明的抗HCV抗体、用于通过上述“3.HCV检测方法”检测HCV的HCV检测用试剂盒。本发明的检测用试剂盒可以含有标记二次抗体、检测标记所需要的基质、阳性对照或阴性对照、用于稀释或洗涤试样的缓冲液、和/或使用说明书。

[0202] 实施例

[0203] 下面举出实施例来更具体地说明本发明。不过，这些实施例只是用于具体地说明本发明而举出的，并不限制本发明的技术范围。

[0204] <实施例1>J6/JFH-1-HCV颗粒的制作

[0205] 按照Wakita，T.等人，Nat.Med.，11(2005)791-796页和国际公开WO 2004/104198中记载的方法，制作将分离自暴发型肝炎患者的HCV JFH-1株(基因型2a)的基因组RNA全部区域逆转录获得的cDNA(基因组cDNA)克隆至pUC19质粒的T7 RNA启动子序列下游而获得的质粒DNA(pJFH-1)。pJFH-1中插入的来自JFH-1株的基因组cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将该pJFH-1用EcoRI消化后，再用BclI部分消化，制备切除了从EcoRI部位至最初的BclI部位的片段(约2840bp)的质粒DNA片段，将其纯化。

[0206] 另一方面，按照国际公开WO 2006/022422中记载的方法，制作将来自HCV J6CF株的基因组cDNA(GenBank登录号AF177036、Yanagi，M.等人，Virology 262：250-263(1999))克隆至pUC19质粒的T7 RNA启动子序列下游而获得的质粒DNA(pJ6CF)。将该pJ6CF用EcoRI和BclI部分消化，将获得的约2840bp的片段纯化，将其与上述切除了EcoRI-BclI片段的pJFH-1质粒DNA片段连接，获得质粒DNA(pJ6/JFH-1)。克隆化至该pJ6/JFH-1中的DNA(SEQ ID NO：2)为HCV嵌合基因组cDNA，其是使来自J6CF株基因组cDNA的5’非翻译区、核心序列、E1序列、E2序列和p7序列、NS2蛋白的编码N末端至16位的氨基酸残基的区域的序列、以及来自JFH-1株基因组cDNA的NS2蛋白的编码17位氨基酸残基至C末端的区域的序列、NS3序列、NS4A序列、NS4B序列、NS5A序列、NS5B序列和3’非翻译区按该顺序连接而成的。

[0207] 将制作的pJ6/JFH-1用XbaI切割后，加入绿豆核酸酶20U(总反应液量50μL)在30℃下培育30分钟，由此使Xba I切割末端平滑。进行苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀，获得除去了粘性末端的4碱基(CTAG)的XbaI切割片段。以该切割的质粒作为模板，用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)合成RNA(参照WO 2006/022422)。将如此合成的各HCV基因组RNA用于以下的细胞导入。

[0208] 将3×106个Huh7细胞与5μg的各HCV RNA悬浮于Cytomix溶液(120mM KCl、0.15mM CaCl2、10mM K2HPO4/KH2PO4、25mM Hepes、2mM EGTA、5mM MgCl2、20mM ATP、50mM 谷胱甘肽400μL)中，移至4mm透明试管中，然后使用Gene Pulser(BioRad公司)在260V、
950μF下使HCV RNA电穿孔至Huh-7细胞中。之后，将HCV基因组RNA导入用的宿主细胞
2
接种在10cm 培养皿中，进行继代培养。继代时使用HCV抗原ELISA检测试剂盒(Ortho公司)对培养上清液中所含的HCV核心蛋白进行定量，确认HCV颗粒的产生。选择核心蛋白的量多、HCV颗粒产生的活性高的培养上清液，作为病毒原液(virus stocks)保存。

[0209] 向用10％FCS-DMEM培养基(含有1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)和1mM丙酮酸钠)培养的10cm培养皿中的Huh7细胞中加入上述
4
获得的J6/JFH-1病毒原液(4×10ffu/mL)各100μL左右，使HCV病毒感染Huh7细胞。

[0210] 细胞适宜在不融合(confluent)的情况下进行继代，由1个225cm2培养瓶(flask)2
扩大培养至4个、12个。接着由其中的8个225cm 培养瓶剥离细胞，接种在2个5层CellSTACK(注册商标)(Corning公司)中，培养基添加至650mL/个。将得自余下4个培养瓶的细胞接种在12个培养瓶中，由此继续以良好的效率产生病毒。

[0211] 继代次日弃去培养基，加入650mL 2％FCS-DMEM培养基(含有1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)和1mM丙酮酸钠)。培养基更换3天后回收培养基，通过0.45μm过滤器，然后保存在超低温冰柜(deep freezer)中。另外，向回收培养上清液后的CellSTACK中加入650mL上述2％FCS-DMEM培养基，继续培养。培养基更换2天后进行同样的操作，回收培养上清液。再重复1次同样的操作。这里，将回收的培养上清液用于后述的实施例2。

[0212] 如上所述，导入了由pJ6/JFH-1合成的HCV嵌合基因组RNA的细胞产生具有感染性的HCV病毒颗粒，其上清液中混在产生的感染性HCV病毒颗粒。

[0213] <实施例2>J6/JFH-1 HCV颗粒的纯化

[0214] 将实施例1中产生的病毒颗粒用以下3个步骤纯化。

[0215] 1)浓缩和透析过滤

[0216] 利用中空纤维滤芯(Hollow Fiber Cartridge)(GE Healthcare公司：500kDa截留，型号UFP-500-C-8A，下称“中空纤维”)，将上述实施例1获得的含HCV颗粒的培养上清液浓缩至60倍。

[0217] 2)密度梯度超离心

[0218] 向Ultra-clear 25×89mm离心管(Beckman Coulter公司：目录号344058)中加入3mL冷却的含60％蔗糖的TNE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA)，覆盖7mL含20％蔗糖的TNE缓冲液。再在含20％蔗糖的TNE缓冲液上覆盖25mL样品。使用SW-28(Beckman Coulter公司)，以28,000转在4℃下超速离心4小时。

[0219] 使用25G注射针(Terumo公司)在管的底面穿孔，由该孔获得12支1mL的组分。测定各组分溶液的比重，确认形成了蔗糖的密度梯度。由比重大的组分开始，回收第3、4、5号的各个组分，用于浓缩和缓冲液置换。

[0220] 3)浓缩和缓冲液置换

[0221] 使 用Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(排 除 分子 量 100kDa，Millipore公司)和TNE缓冲液，将洗脱组分进行缓冲液置换的同时进行浓缩。将如此获得的浓缩液在后述免疫步骤中用作含感染性HCV颗粒的病毒液。

[0222] <实施例3>HCV的灭活

[0223] 将上述实施例2中获得的病毒液中的HCV通过紫外线照射灭活。使用东芝公司制6
GL-15作为紫外线的线源。将纯化的感染效价1×10ffu/mL的含有HCV颗粒的溶液装入涂布了硅的聚乙烯制微量离心管(Assist公司制)中，放置在使紫外线的照射强度为20mW/
2
cm 的距离，照射5分钟UV-C。

[0224] 处置后，将HCV颗粒在DMEM培养基中以50倍、250倍、1250倍、6250倍、31250倍、156250倍、和781250倍系列稀释。

[0225] 前一天，按1×104细胞/孔在96孔聚-L-赖氨酸包被板(Corning公司制；Corning 96孔透明平底聚-L-赖氨酸包被微孔板(Corning 96 Well Clear Flat Bottom Poly-L-Lysine Coated Microplate))中接种Huh-7细胞，向其中接种系列稀释的上述病毒颗粒，在37℃培养72小时。

[0226] 除去培养上清液后，将板浸在冰冷却的甲醇中，固定细胞。之后，风干除去甲醇，用含0.3％Triton(注册商标)-X100(GE Healthcare公司)的Block Ace(注册商标)(大日本制药公司)进行细胞的可溶化处置。使用克隆2H9抗HCV-核心抗体(Wakita，T.等人，Nat.Med.11：791-796，2005)和山羊抗-小鼠IgG-Alexa488(Molecular Probe公司)，检测HCV感染细胞，在荧光显微镜(Olympus公司制IX-70)下计数。确认紫外线处置后的HCV的感染效价在检测限以下。在后述实施例中，给予小鼠时使用这种感染性完全消失的灭活J6/JFH-1-HCV颗粒。

[0227] <实施例4>使用灭活HCV颗粒对小鼠进行免疫

[0228] 佐剂使用动物用佐剂MPL+TDM(Sigma公司：Sigma佐剂系统，目录号S6322)。向100μL含实施例3所示灭活J6/JFH-1-HCV颗粒(相当于2pmol HCV核心蛋白的量)的溶液中加入等量的MPL+TDM，形成乳液。乳液的形成如下确认：在烧杯中准备适量的水，在水面上滴一滴混合液，混合液不分散。乙醚麻醉Balb/c小鼠(7周龄、雌)，通过腹腔内给予如上所述制备的含灭活J6/JFH-1-HCV颗粒的乳液进行免疫。

[0229] 2周后，向100μL含J6/JFH-1-HCV颗粒(相当于2pmol HCV核心蛋白的量)的溶液中加入等量的MPL+TDM，形成乳液，同样地腹腔内给予以进一步免疫。再在4周后及6周后，同样地腹腔内给予以进行免疫。

[0230] <实施例5>测定用灭活HCV颗粒免疫的小鼠的血清中HCV感染抑制活性

[0231] (1)感染性HCV样颗粒(HCVpp)的制作

[0232] HCVpp的制作按照Bartosch等人的方法进行(文献：Bartosch，B.等人，(2003)J.Exp.Med.，197，633-642)。该方法如下：通过将3种表达载体(表达逆转录病毒的Gag-pol的载体、表达HCV的包膜蛋白的载体以及表达报道基因的逆转录病毒包装载体)导入动物细胞中进行表达，报道基因被包装，制作在其病毒表面表达HCV包膜蛋白的假病毒(pseudo virus)。

[0233] 为了制作携带基因型2a的包膜蛋白的HCVpp，使用pcDNA J6dC-E2。该质粒是将编码基因型2a的HCV株即J6CF的蛋白(NCBI蛋白质登录号AAF01178.1)的132位的氨基酸残基至750位的氨基酸残基(核心蛋白的一部分、E1蛋白和E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1的表达载体。

[0234] 作为将编码小鼠白血病病毒的gag和pol的基因克隆化的表达载体，使用Gag-Pol5349。作为将荧光素酶基因克隆化的逆转录病毒包装载体，使用Luc126。

[0235] 293T细胞在10％FCS-DMEM培养基(含有1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES(pH 7.3)、1mM丙酮酸钠、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Gibco公司：目录号15140-122))(下称“DMEM-10F”)中继代培养。培养使用胶原包被的培养瓶(IWAKI公司：目录号4100-010和4160-010)。将293T细胞接种在胶原包被的10cm培养6
皿中(IWAKI公司：目录号4020-010)，达到2.5×10 细胞/培养皿，培养一夜。将下示量的Opti-MEM(Gibco公司：目录号11058)、FuGENE6以及3种构建物(construct)(HCV包膜蛋白表达载体pcDNA J6dC-E2、Gag-Pol 5349及Luc126)按Opti-MEM为500μL、FuGENE6为21.6μL、pcDNA J6dC-E2为1μg、Gag-Pol 5349为3.1μg、Luc126为3.1μg(或与它们相同的构成比)进行混合，在室温下培育15分钟。将293T细胞的培养基更换为7.5mL Opti-MEM，向其中添加DNA复合物，在37℃、5％CO2下培育6小时。反应结束后，用PBS洗涤1次，添加8mL DMEM-10F，在37℃、5％CO2下培育48小时。培养结束后，回收上清液，将用0.45μm过滤器过滤所得的溶液作为HCVpp溶液。HCVpp按每1mL分注，在-80℃下保存。

[0236] 将如此操作获得的携带基因型2a的J6CF株的结构蛋白的感染性HCV颗粒称为“J6CF HCVpp”。

[0237] (2)感染抑制活性的测定

[0238] 将实施例4中HCV颗粒给予前的正常小鼠血清、以及从用灭活HCV颗粒(J6/JFH-1-HCV颗粒)免疫的小鼠在初次免疫49天后采血200μL的血清分别应用于1mL的Protein G琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare公司)，用PBS洗涤柱后，用0.1M甘氨酸缓冲液(pH3.0)按1mL/组分洗脱。洗脱后，立即添加1M Tris-HCl(pH9.5)，返回中性。将洗脱的蛋白的峰组分作为IgG组分，测定该组分的HCV感染抑制活性。具体来说，向本实施例的步骤“(1)感染性HCV样颗粒(HCVpp)的制作”中获得的J6CF HCVpp溶液中加入DMEM培养基(含有10％FCS(Invitrogen公司)、1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠的DMEM)，稀释IgG组分样品，使IgG的最终浓度为10、4
30、100、200μg/mL，在37℃下培育30分。弃去前一天在96孔板上按1x10 细胞/孔培养的Huh7.5.1细胞的培养基，之后按50μL/孔添加加入IgG组分样品培育的病毒液，在37℃下培育3小时。弃去病毒液后，用PBS按100μL/孔洗涤1次，加入200μL/孔的培养基在37℃下培育72小时。弃去培养基后，加入25μL/孔的DMEM培养基(未添加血清)和
25μL/孔的Steady-Glo(Promega公司：目录号E2520)，按照所附的说明书溶解细胞。将细胞的溶解液按40μL/孔移至白色的96孔板(住友Bakelite公司：目录号MS-8496W)，用ARVO X4(PerkinElmer公司)测定发光强度。

[0239] 结果如图1所示。图1的纵轴表示作为发光强度的荧光素酶活性，横轴的数值表示J6CF HCVpp溶液中混合的IgG浓度(μg/mL)。另外，“对照”表示未加抗体的阳性对照，“正常小鼠mIgG”表示对照抗体。将向J6CF HCVpp溶液中混合DMEM时的值作为显示100％感染率的对照，发光强度越低显示抑制感染的活性越高。确认HCV感染抑制活性依赖于来自给予J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠血清的IgG组分的用量。

[0240] <实施例6>杂交瘤的制作

[0241] 将小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0(购自ECACC)用含有5×10-5M的2-巯基乙醇、100单位/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、以及10％FCS(Invitrogen公司)的DMEM培养基(Invitrogen公司)培养，获得对数增殖期的SP2/0细胞。将该细胞用不含血清的DMEM培养基洗涤3次。

[0242] 接着从给予了实施例4的HCV颗粒(J6/JFH-1-HCV颗粒)的小鼠取出脾细胞，用不含血清的DMEM培养基洗涤3次。按SP2/0细胞与小鼠脾细胞为1∶5的比率装入50mL的离心管中，在1,000转下离心10分钟。将上清液完全吸除，用手指轻叩管底，将团块(cell pellet)分散(loosen)。用1分钟向细胞中加入1mL在37℃下保温的50％PEG-1500溶液(Roche公司)，在37℃下继续反应1分钟。接着，用1分钟缓慢加入1mL不含血清的DMEM培养基，再用1分钟缓慢加入1mL不含血清的DMEM培养基。最后，用3分钟加入7mL不含血清的DMEM培养基，稀释PEG溶液。将稀释液中的该细胞以1,000转离心10分钟，向其中-5加入50mL的HT培养基(含有5×10 M的2-巯基乙醇、100单位/mL的青霉素、100μg/mL-4 -5
的链霉素以及10％的FCS、10 M的次黄嘌呤以及1.5×10 M的胸苷的DMEM培养基)，通过
2
移液分散细胞团块。将细胞移到2个75cm 的培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养一夜。

[0243] 将细胞以1,000转离心10分钟后回收。轻叩细胞团块将其分散，并悬浮于10mL的DMEM培养基中。将该细胞悬浮液加入到90mL的甲基纤维素HAT选择培养基(Stem Cell Technology公司)中，充分混合，按10mL/培养皿的量加入10cm的培养皿中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。

[0244] 培养10～14天，用移液管(pipette chip)将被认为由单一的细胞增殖而获得的杂交瘤的菌落吸上来，将其加入96孔板的各孔中进行培养，该96孔板按每孔200μL加入有含10％的杂交瘤增殖因子(Bio Veris公司)的HT培养基。

[0245] <实施例7>筛选产生HCV感染抑制抗体的杂交瘤

[0246] 在实施例6制作的杂交瘤充分增殖时，回收培养上清液，如下进行筛选。

[0247] 筛选如下进行：将E1蛋白和E2蛋白固定在板上，通过EIA评价杂交瘤上清液中的抗体是否与上述蛋白结合，并评价杂交瘤上清液中的抗体是否可抑制HCV感染(实施例8中记载)。

[0248] (1)制作来自J6CF株的E1蛋白和E2蛋白

[0249] 如下所示制备J6CF株的E1蛋白和E2蛋白。以基因型2a的来自J6CF株的基因组cDNA(GenBank登录号AF177036)作为模板，使用Advantage GC2 PCR试剂盒(Takara Bio公司)、以及J6E1dTM-s(SEQ ID NO：3：CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)和J6E1dTM-as(SEQ ID NO：4：GCTCTAGATTAATGAGCCCCGCTAATGATGTC)，用PCR法扩增编码E1蛋白的基因，所述E1蛋白为以J6CF全长蛋白序列(J6CF株基因组序列所编码的一个连续的蛋白序列；GenBank登录编号AF177036中也有记载的氨基酸序列)的N末端的起始甲硫氨酸作为第1位时相当于192位至352位的、不含跨膜域的蛋白。将扩增的DNA片段克隆至pCR-TOPO(Invitrogen)中，分析3个克隆的核苷酸序列。将具有正确的核苷酸序列的插入片段的克隆命名为“pTOPO-J6E1dTM”。

[0250] 将pTOPO-J6E1dTM用HindIII和XbaI消化，切出含有约500bp的DNA片段(E1片段)的凝胶。使用GeneElute(SIGMA公司)，由该凝胶纯化DNA片段。同样，将p3XFLAG-CMV-9(SIGMA公司)用HindIII和XbaI消化后，用1％琼脂糖凝胶电泳。切出含有约6,400bp的片段的凝胶后，使用GeneElute(SIGMA公司)由凝胶纯化DNA片段。将各纯化的DNA片段用T4连接酶(Takara Bio公司)连接，获得参入了J6CF株的E1片段的动物细胞表达载体“CMV-3XFLAG J6E1dTM”。

[0251] 接着，使用Advantage GC2 PCR试剂盒(Takara Bio公司)、以及J6E2dTM-s(SEQ ID NO：5：CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)和J6E2dTM-as(SEQ ID NO：6：GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT)，用PCR法扩增编码E2蛋白的基因，所述E2蛋白为以J6CF全长蛋白序列的N末端的起始甲硫氨酸作为第1位时相当于384位至720位的、不含跨膜域的蛋白。将扩增的DNA片段克隆至pCR-TOPO(Invitrogen公司)中，分析3个克隆的核苷酸序列。将具有正确核苷酸序列的插入片段的克隆命名为“pTOPO-J6E2dTM”。

[0252] 接着，将用HindIII和XbaI消化p3XFLAG-CMV-9(SIGMA公司)获得的DNA以及用HindIII和XbaI自pTOPO-J6E2dTM切出的约1,000bp的DNA片段用T4 DNA连接酶连接而环化。将该载体命名为“CMV-3XFLAGJ6E2dTM”。

[0253] 如下所述，将这些CMV-3XFLAGJ6E1dTM或CMV-3XFLAG J6E2dTM导入来自猴肾脏的COS1细胞(获自理研细胞银行，保藏号为RCB0143)，分别使E1蛋白或E2蛋白表达。

[0254] 用含有10％FCS(Invitrogen公司)、100U/mL青霉素、100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基(Ivitrogen公司)培养COS1细胞。在基因导入前一天，以2倍的稀释倍率2
(split ratio)将COS1细胞接种到150cm 培养瓶(Corning Coaster)中，在37℃、5％CO2培养箱中培养一夜。

[0255] 另一方面，向DMEM培养基(Invitorogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia公司)和氯喹(SIGMA公司)，使其终浓度分别为400μg/mL和100μM，再按照每13mL该溶液加入500μL(50μg)的0.1μg/μL浓度的上述表达载体(CMV-3XFLAGJ6E1dTM或者CMV-3XFLAG J6E2dTM)进行培养(将其称为“DEAE葡聚糖-DNA混合液”)。接着，吸除培养的COS1细胞的
2
上清液后，添加10mL的PBS(-)(日水公司)洗涤细胞1次。吸除PBS(-)后，按照13mL/150cm培养瓶加入DEAE葡聚糖-DNA混合液，在37℃、5％CO2存在下培育4小时。

[0256] 4小时后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合液，用10mL的PBS洗涤1次，按50mL/培养瓶加入CHO-SFM培养基(Invitorogen公司)，在37℃、5％CO2存在下培养。4天后，将培养上清液回收至50mL的离心管(Corning Coaster)中。回收的上清液在以6,000rpm(使用HITACHI RPR9-2转子)、30分钟、4℃离心后，用0.2μm的过滤器(Whatman公司)过滤。

[0257] 使用抗FLAG M2琼脂糖(SIGMA公司)，如下所述纯化培养上清液。向500mL的培养上清液中添加1mL的抗FLAG M2琼脂糖，用转瓶边搅拌边在4℃(低温室)下反应。2小时后，将上清液和抗FLAG M2琼脂糖的混合液移至Econo-Column(BIO-RAD公司)，回收流出的组分(flow-through fractions)。接着，用10mL的TBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)洗涤2次。用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脱6个组分(1mL/组分)。洗脱后，立即添加1M Tris-HCl(pH9.5)，返回中性。将各组分的20μL在还原下供给SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色。结果，确认来自J6CF株的E1蛋白或E2蛋白得到纯化。

[0258] (2)E1蛋白和E2蛋白的固相化板的制作

[0259] 将来自J6CF株的E1蛋白和E2蛋白用PBS稀释，使其分别达到1μg/mL。向Immuno Plate(NUNC公司)的各孔中加入50μL该E1蛋白和E2蛋白的混合蛋白溶液，在4℃下静置一夜，将蛋白固定在板上。除去蛋白溶液，向各孔中加入150μL的Block Ace(大日本制药)，在室温下封闭4小时。

[0260] 将这些板用于后述的在杂交瘤的培养上清液中筛选抗HCV抗体。

[0261] (3)筛选以J6/JFH-1-HCV颗粒为抗原制作的杂交瘤的上清液

[0262] 将上述(2)中制作的、固定有来自J6CF株的E1蛋白和E2蛋白的板用含有0.1％吐温20(SIGMA公司)的PBS洗涤4次，向各孔中加入50μL实施例6中获得的各杂交瘤上清液样品，在室温下边用Plate Mixer振动边反应1小时。反应后，用含有0.1％吐温20(SIGMA公司)的PBS洗涤4次，之后向各孔中加入50μL用含有0.1％吐温20的PBS稀释至10,000倍的HRP标记抗小鼠IgG抗体(SIGMA公司)，在室温下边振动边反应1小时。
反应后，用含有0.1％吐温20(SIGMA公司)的PBS洗涤4次，使用过氧化酶发色试剂盒(住友Bakelite公司)发色，用多重扫描(Titer-Tech公司)测定450nm下的吸光度，选出阳性克隆。

[0263] <实施例8>HCV感染抑制活性的评价

[0264] 向实施例5的步骤“(1)感染性HCV样颗粒(HCVpp)的制作”中获得的J6CF HCVpp4
溶液中加入杂交瘤上清液，在37℃下培育30分钟。由前一天在96孔板中按1×10 细胞/孔培养的Huh7.5.1细胞除去培养基，之后按50μL/孔添加加入杂交瘤上清液培育的病毒液，在37℃下培育3小时。弃去病毒液后，用PBS按100μL/孔洗涤1次，加入200μL/孔的培养基在37℃下再培育72小时。弃去培养基后，加入25μL/孔的DMEM培养基(未添加血清)和25μL/孔的Steady-Glo(Promega公司：目录号E2520)，按所附的说明书溶解细胞。
将细胞的溶解液按40μL/孔移至白色的96孔板(住友Bakelite公司：目录号MS-8496W)，使用ARVO X4(PerkinElmer公司)测定发光强度。将用向J6CF HCVpp溶液中混合了DMEM培养基(与杂交瘤上清液等量)的病毒液同时进行上述试验时的发光强度作为100％感染，用％表示与杂交瘤上清液混合时的发光强度，求出感染率(％)。

[0265] 将感染率少的样品作为产生具有HCV感染抑制活性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株选出2类。将这些细胞株用有限稀释法克隆化，获得产生单克隆抗体P18-9E的杂交瘤细胞株P18-9E以及产生单克隆抗体P19-7D的杂交瘤细胞株P19-7D。

[0266] 将本实施例中选出的杂交瘤细胞株P18-9E(保藏号：FERM BP-11263)和杂交瘤细胞株P19-7D(保藏号：FERM BP-11264)于2009年10月15日保藏在独立行政法人 产业技术综合研究所 专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。

[0267] 这些杂交瘤细胞株可以用向DMEM中添加了1mM丙酮酸钠、55μM 2-巯基乙醇、10％FCS的培养基，在37℃下适当培养。

[0268] <实施例9>抑制HCV感染的单克隆抗体的分析

[0269] 实施例8中获得的产自杂交瘤细胞株的、抑制HCV感染的单克隆抗体的特性分析如下进行。需要说明的是，将产自杂交瘤细胞株P18-9E(保藏号：FERM BP-11263)的单克隆抗体称为“单克隆抗体P18-9E”，将产自杂交瘤细胞株P19-7D(保藏号：FERM BP-11264)的单克隆抗体称为“单克隆抗体P19-7D”。

[0270] (1)抗体的亚型

[0271] 小鼠抗体的亚型分析使用杂交瘤的培养上清液、用Mouse MonoAB ID试剂盒(Invitrogen公司)进行。单克隆抗体P18-9E的同种型的分析结果表明H链为γ2b、L链为κ，因此显示为IgG2b抗体。单克隆抗体P19-7D的同种型的分析结果表明H链为γ1、L链为κ，因此显示为IgG1抗体。

[0272] (2)纯化

[0273] 用无血清培养基Hybridoma SFM(Invitrogen公司)将杂交瘤培养至融合后，将培养液回收至离心管，在1500rpm下离心5分钟。将培养上清液添加到Prosep-G(Millipore公司)中，用20床体积(bed volume)的PBS洗涤，接着用1床体积的0.1M甘氨酸-HCl(pH3.0)洗脱6个组分。洗脱后，立即添加1M Tris-HCl(pH9.5)，返回中性。使用NanoDrop(NanoDrop Technologies公司，ND-1000)测定各组分在280nm的吸光度，回收含蛋白的组分(OD280nm＞0.1)，在用Amicon Ultra 50K(Millipore公司)浓缩的同时用PBS进行缓冲液更换，用0.22μm过滤器进行过滤。将浓缩样品的20μL在还原下和非还原下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色，确认为IgG。测定样品在280nm的吸光度，计算溶液中所含的抗体量(按10mg/mL IgG＝13.7OD换算)。

[0274] (3)纯化单克隆抗体的HCV感染抑制活性

[0275] A.对感染性HCV样颗粒(J6CF HCVpp)的HCV感染抑制活性

[0276] 向实施例5的步骤“(1)感染性HCV样颗粒(HCVpp)的制作”中获得的J6CF HCVpp溶液中加入纯化单克隆抗体P18-9E或纯化单克隆抗体P19-7D，在37℃下培育30分。纯化单克隆抗体P18-9E或纯化单克隆抗体P19-7D用PBS稀释至最终浓度分别为100μg/mL或者300μg/mL后使用。

[0277] Huh7.5.1细胞用10％FCS-DMEM培养基(含有1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES(pH7.3)、1mM丙酮酸钠、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Gibco公司：目录号15140-122))继代培养。

[0278] 由前一天在96孔板中按1×104细胞/孔培养的Huh7.5.1细胞弃去培养基，之后按50μL/孔添加加入纯化单克隆抗体培育的病毒液，在37℃下培育3小时。弃去病毒液后，用PBS按100μL/孔洗涤1次，加入200μL/孔的培养基，在37℃下培育72小时。弃去培养基后，加入25μL/孔的DMEM培养基(未添加血清)和25μL/孔的Steady-Glo(Promega公司：目录号E2520)，按照所附的说明书溶解细胞。将细胞的溶解液按40μL/孔移至白色的96孔板(住友Bakelite公司：目录号MS-8496W)，使用ARVO X4(PerkinElmer公司)测定发光强度。将用向J6CF HCVpp溶液中混合了PBS(与稀释的纯化单克隆抗体等量)的病毒液同时进行上述试验时的发光强度作为100％感染，用％表示与纯化单克隆抗体混合时的发光强度，求出感染率(％)。

[0279] 图2表示单克隆抗体P18-9E的HCV感染抑制活性。图2的纵轴表示感染率(％)，横轴的“PBS”表示未加入抗体的阳性对照，“P18-9E 100μg/mL”表示J6CF HCVpp溶液中混合的单克隆抗体P18-9E的最终浓度。如图2所示，纯化单克隆抗体P18-9E抑制了J6CF HCVpp的感染。

[0280] 图3表示单克隆抗体P19-7D的HCV感染抑制活性。图3的纵轴表示感染率(％)，横轴的“P19-7D 100μg/mL、300μg/mL”表示J6CF HCVpp溶液中混合的单克隆抗体P19-7D的最终浓度。另外，“P.C”表示未加入抗体的阳性对照，“IgG”表示作为对照抗体的小鼠IgG300μg/mL的结果。如图3所示，纯化单克隆抗体P19-7D抑制了J6CF HCVpp的感染。

[0281] B.对感染性HCV颗粒(J6/JFH1 HCVcc)的HCV感染抑制活性

[0282] HCVcc病毒液使用上述实施例2的步骤(1)中获得的J6/JFH1-HCV颗粒液(含有HCV颗粒的培养上清液的浓缩液)(下称“J6/JFH1 HCVcc”)。

[0283] Huh7.5.1细胞用10％FCS-DMEM培养基(含有1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES(pH7.3)、1mM丙酮酸钠、100单位/mL青霉素、100μg/mL
4
链霉素(Gibco公司：目录号15140-122))继代培养。将Huh7.5.1细胞按1×10 细胞/孔接种到96孔板(包被poly-D-lysin)上，培养一夜。向J6/JFH1 HCVcc溶液中混合纯化单克隆抗体P18-9E，在室温下培育30分钟。此时，将单克隆抗体P18-9E用PBS稀释至
20μg/mL、60μg/mL、200μg/mL后使用(混合液中抗体的最终浓度为10μg/mL、30μg/mL、
100μg/mL)。弃去细胞的培养基后，按50μL/孔添加加入抗体培育的病毒液，在37℃下培育3小时。弃去病毒液后，用PBS按100μL/孔洗涤1次，加入200μL/孔的DMEM培养基在37℃下培育72小时。除去培养上清液后，将板浸在冰冷却的甲醇中，固定细胞。之后，风干除去甲醇，按100μL/孔添加含有3％H2O2的PBS溶液，在室温下培育5分钟。用PBS按
150μL/孔洗涤2次，按100μL/孔加入含0.3％Triton(注册商标)-X100(GE Healthcare公司)的Block Ace(注册商标)(大日本制药公司)，在室温下封闭处置1小时。用PBS按
150μL/孔洗涤2次，按50μL/孔加入稀释100倍的HRP标记抗HCV-核心抗体(Ortho公司)，反应1小时。之后，用PBS按150μL/孔洗涤4次，按50μL/孔加入QuantaBlu(注册商标)(PIERCE公司)反应液，在室温下静置30分钟，按50μL/孔加入QuantaBlu停止液停止反应。按20μL/孔移至黑色的384孔板(Corning公司：目录号3676)，使用ARVO X4(PerkinElmer公司)测定荧光强度。将用向J6/JFH1 HCVcc溶液中混合了PBS(与稀释的纯化单克隆抗体等量)的病毒液同时进行上述试验时的荧光强度作为100％感染，用％表示与纯化单克隆抗体混合时的荧光强度，求出感染率(％)。

[0284] 结果如图4所示。图4的纵轴表示感染率(％)，横轴的“P18-9E 10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL”表示J6/JFH1 HCVcc溶液中混合的单克隆抗体P18-9E的最终浓度。另外，“PBS”表示未加入抗体的阳性对照，“小鼠IgG”表示阴性对照抗体，“CD81 0.1μg/mL”表示阳性对照抗体的结果。如图4所示，纯化单克隆抗体P18-9E抑制了J6/JFH1 HCVcc的感染。

[0285] 这些结果显示，单克隆抗体P18-9E和单克隆抗体P19-7D是具有HCV感染抑制活性的中和抗体。

[0286] (4)单克隆抗体的表位分析

[0287] 关于J6CF株的E1蛋白的1～162位的氨基酸(SEQ ID NO：7)、J6CF株的E2蛋白的1～337位的氨基酸(SEQ ID NO：8)，合成由将10个连续的氨基酸自N末端开始通过以每3个氨基酸为单位(3アミノ酸ずつ)进行移动(shift)而设计的氨基酸序列构成的肽组。各肽的N末端生物素化，C末端作为甘氨酰胺(委托JPT公司合成)。

[0288] 将合成的肽溶解在DMSO中，然后溶解于PBS中以达到0.01nmol/μL。向链霉抗生物素蛋白包被板(Nunc公司)的各孔中加入50μL该肽溶液，在室温下反应1小时。接着，弃去肽溶液，按200μL/孔加入Blocking One(Nacalai Tesque公司)，在室温下放置5小时。之后，弃去Blocking One溶液，按150μL/孔用含有0.05％吐温20的PBS(pH7.2)洗涤4次，按50μL/孔加入用含有0.05％吐温20的PBS(pH7.2)稀释至1μg/mL的单克隆抗体，在室温下反应1小时。接着，弃去抗体溶液，按150μL/孔用含有0.05％吐温20的PBS(pH7.2)洗涤5次，按50μL/孔加入用含有0.05％吐温20的PBS稀释至5000倍的HRP化抗小鼠IgG山羊抗体(GE Healthcare公司)，在室温下反应1小时。反应后，弃去抗体溶液，按150μL/孔用含有0.05％吐温20的PBS(pH7.2)洗涤5次，接着，用分光光度计(OD450nm)检测用HPR发色试剂盒(住友Bakelite公司)结合在肽上的抗体。

[0289] 其结果，纯化单克隆抗体P18-9E和纯化单克隆抗体P19-7D与任何肽都未反应。该结果暗示，单克隆抗体P18-9E和单克隆抗体P19-7D是识别立体构造表位的抗体。

[0290] (5)编码单克隆抗体的V区的DNA的克隆化

[0291] 如下将编码抗HCV颗粒的小鼠单克隆抗体的V区的DNA克隆化。

[0292] 使用PureLink Micro-to-Midi(Invitrogen公司)，按照所附手册中记载的方6
法，由杂交瘤细胞株制备总RNA。即，使2×10 个的杂交瘤细胞株P18-9E和杂交瘤细胞株P19-7D的细胞悬浮于0.5mL的RNA裂解溶液中，使细胞数次通过带18号注射针的注射器而均浆化。将匀浆离心，向所得的该上清液中加入等量的70％乙醇，应用于RNASpin Cartridge。向Cartridge中加入洗涤液充分洗涤，用不含RNA酶的水洗脱RNA。

[0293] 使用Novagen公司的Mouse Ig-Primer Set的IgGμ型H链和κ型L链特异性3’引物，由总RNA合成单股cDNA。具体来说，向3μg的各RNA中加入2pmol的μ型H链特异性3’引物或κ型L链特异性3’引物、1μL的10mM dNTPs溶液，再加入蒸馏水使最终容量达到13μL，在65℃下退火10分钟，在冰上静置。向其中加入1μL的0.1M DTT、1μL的RNA OUT、4μL的SuperScriptIII(Invitrogen公司)附带的5×RT Buffer以及1μL的逆转录酶SuperScriptII(Invitrogen公司)，在50℃下反应60分钟、70℃下反应15分钟，在4℃下保存所得反应物，将所得反应物直接用于下一步骤的聚合酶链式反应(PCR)。作为用于PCR的引物组，使用Mouse Ig-Primer Set，按所附使用手册的条件进行PCR。PCR使用GeneAmp(注册商标)PCR System 9700(Applied Biosystems公司)和Advantage GC2 DNA polymerase试剂盒(TAKARA公司)进行。具体来说，在H链的扩增中，使用试剂盒附带的MuIgVH5’-A至MuIgVH5’-F的引物(与小鼠μ型H链的前导序列杂交)和MuIgGVH3’-1引物(与小鼠μ型CH杂交)进行PCR。在L链的扩增中，使用试剂盒附带的MuIgκVL5’-A至MuIgκVL5’-F的引物(与小鼠κ型L链的前导序列杂交)和MuIgκVL3’-1引物(与小鼠κ型CL杂交)进行PCR。向1～4μL如上所述制备的单股cDNA合成的反应混合物中加入Advantage GC2 DNA polymerase试剂盒所附的、10μL的5×PCR Buffer、5μL的GC Melt、5μL的2mM dNTPs溶液、1μL的Advantage GC2 DNA polymerase mix、2～5pmol的MuIgκVL 5’引物、2pmol的MuIgκVL3’-1引物，再加入蒸馏水使最终容量达到50μL。将
50μL该PCR溶液在94℃下培育3分钟后，反复进行40次94℃1分钟、60℃1分钟、72℃2分钟的温度循环后，将反应混合物再在72℃下培育6分钟。

[0294] 在如上所述用PCR法扩增的DNA片段的克隆化中，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)。加入试剂盒所附的pCR-TOPO载体和DNA片段以及所附的盐溶液，将在室温下放置5分钟后的反应溶液的一部分加入大肠杆菌DH5α(TAKARA公司)的感受态细胞中。将该大肠杆菌感受态细胞在冰上放置30分钟，接着在42℃下加热45秒后，再在冰上放置2分钟，加入SOC培养基(室温)，在37℃下培养1小时后接种在琼脂培养基中，在37℃下培养一夜。由该转化体制备质粒DNA，通过常规方法确定克隆化的DNA的核苷酸序列。

[0295] (6)分析编码单克隆抗体V区的cDNA的核酸序列

[0296] 对于在上述(5)中确定核苷酸序列、克隆至质粒中的DNA(分别编码小鼠单克隆抗体的VH和VL的cDNA)，如下进行分析。

[0297] 对将在单克隆抗体P18-9E的H链中用MuIgVH5’-B的5’引物扩增的PCR产物克隆化的6个克隆进行分析。结果，在核苷酸序列的1处，6个克隆中的1个克隆有取代，5个克隆的V区的核苷酸序列相同。选择5个克隆获得的DNA，确定单克隆抗体P18-9E的H链cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

[0298] 对将在单克隆抗体P18-9E的L链中用MuIgκVL5’-F的5’引物扩增的PCR产物克隆化的3个克隆进行分析，结果是，在核苷酸序列的2处，3个克隆中的1个克隆有取代，2个克隆的V区的核苷酸序列相同。选择在各取代处2个克隆显示的碱基，确定单克隆抗体P18-9E的L链cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。

[0299] 对得自将在单克隆抗体P19-7D的H链中用MuIgVH5’-C的5’引物扩增的产物克隆化的6个克隆的核苷酸序列进行分析。其结果是，在核苷酸序列的3处，6个克隆中的1个克隆有取代，各取代处的5个克隆的核苷酸序列相同。选择在各取代处5个克隆显示的碱基，确定单克隆抗体P19-7D的H链cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。

[0300] 对将在单克隆抗体P19-7D的L链中用MuIgκVL5’-G的5’引物扩增的PCR产物克隆化的4个克隆进行分析。结果是，在V区的核苷酸序列的2处，4个克隆中的1个克隆有取代，3个克隆的核苷酸序列相同。选择在各取代处3个克隆显示的碱基，确定单克隆抗体P19-7D的L链cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。

[0301] 另外，通过用数据库检索由核酸序列推定的编码化氨基酸序列，推定出单克隆抗体P18-9E和单克隆抗体P19-7D的、H链及L链的V区的FR1至J区(FR4)的氨基酸序列(SEQ ID NO：13～16)。由该氨基酸序列推定的CDR1至CDR3示于图5。

[0302] 单克隆抗体P18-9E的VH的、FR1的氨基酸序列为DAQGQMQQSGPELVKPGASVKLSCKTTDFTFN(SEQ ID NO：17)，CDR1的氨基酸序列为RNYIS(SEQ ID NO：18)，FR2的氨基酸序列为WLRQKPGQSLEWIA(SEQ ID NO：19)，CDR2的氨基酸序列为WIYAGTGGTKYNQKFTG(SEQ ID NO：20)，FR3的氨基酸序列为KAQMTVDTSSHTAYMQFSNLTTEDSAVYYCAR(SEQ ID NO：21)，CDR3的氨基酸序列为YLFDGYYIPLFDY(SEQ ID NO：22)，FR4(J区，也称为J片段或者J链)的氨基酸序列为WGQGTTLTVS(SEQ ID NO：23)。

[0303] 单 克 隆 抗 体 P18-9E 的 VL 的、FR1 的 氨 基 酸 序 列 为AQCDVQITQSPSYLAASPGETISINC(SEQ ID NO：24)，CDR1的氨基酸序列为RANKSIDKYLA(SEQ ID NO：25)，FR2的氨基酸序列为WYQEKPGKTNKLLIY(SEQ ID NO：26)，CDR2的氨基酸序列为SGSTLQS(SEQ ID NO：27)，FR3的氨基酸序列为GVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYC(SEQ ID NO：28)，CDR3的氨基酸序列为QQHNEYPLT(SEQ ID NO：29)，及FR4(J区)的氨基酸序列为FGAGTKLDLRR(SEQ ID NO：30)。

[0304] 单克隆抗体P19-7D的VH的、FR1的氨基酸序列为LSQPSQSLSITCTVSGFSLT(SEQ ID NO：31)，CDR1的氨基酸序列为TYGVH(SEQ ID NO：32)，FR2的氨基酸序列为WVRQSPGKGLEWLG(SEQ ID NO：33)，CDR2的氨基酸序列为VIWRGGSTDYNAAFLS(SEQ ID NO：34)，FR3的氨基酸序列为RLSITKDNSKSQVFFKMNSLQPDDTAIYYCAKN(SEQ ID NO：35)，CDR3的氨基酸序列为SWDGAY(SEQ ID NO：36)，FR4(J区)的氨基酸序列为WGQGTLVTVS(SEQ ID NO：
37)。

[0305] 单 克 隆 抗 体 P19-7D 的 VL 的、FR1 的 氨 基 酸 序 列 为SSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO：38)，CDR1 的 氨 基 酸 序 列 为
RSSQSLLHSNGNTYLH(SEQ ID NO：39)，FR2的氨基酸序列为WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO：
40)，CDR2的氨基酸序列为KVSNRFS(SEQ ID NO：41)，FR3的氨基酸序列为GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFC(SEQ ID NO：42)，CDR3的氨基酸序列为SQNTHFPWT(SEQ ID NO：43)，FR4(J区)的氨基酸序列为FGGGTELEISR(SEQ ID NO：44)。

[0306] 明确了：在通过单克隆抗体P18-9E和单克隆抗体P19-7D识别立体构造表位中发挥作用的H链和L链的V区的核苷酸序列和氨基酸序列。

[0307] (7)使用HCV样颗粒(HCV-VLP)分析单克隆抗体P18-9E和单克隆抗体P19-7D的性状

[0308] A.使用酶免疫测定(EIA)研究(HCV-VLP)单克隆抗体对HCV样颗粒(HCV-VLP)的反应性

[0309] (a)HCV样颗粒(HCV-VLP)的制作

[0310] HCV样颗粒(HCV-VLP)是指不含病毒基因组的中空颗粒。使用MembranePro(注册商标)Reagent(Invitrogen公司)，可以由表达HCV的E1蛋白和E2蛋白的293T细胞，制作HCV的E1蛋白和E2蛋白在其表面表达的中空颗粒(HCV-VLP)。

[0311] 用在500mL的DMEM培养基(Invitrogen公司)中添加了50mL的FCS(GIBCO公7
司)和5mL的PenStrep(Invitrogen公司)的培养基培养293T细胞。将1.2×10 个293T
2
细胞接种在225cm 胶原蛋白包被的培养瓶(IWAKI公司)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一昼夜。

[0312] 将4mL的Opti-MEM I(GIBCO公司)和216μL的Lipofectamine2000(Invitrogen公司)混合，在室温下培育5分钟后，再添加4mL的Opti-MEM I(GIBCO公司)、10.8μg的pcDNA J6dC-E2(实施例5中记载的HCV J6CF株的E1蛋白和E2蛋白的表达质粒)和32.4μL的MembranePro(注册商标)Reagent(Invitrogen公司)的混合物，在室温下培育
20分钟。将该溶液滴加到培养了一昼夜的293T细胞的培养液中，在37℃、5％CO2的条件下培育18小时。之后，除去培养液，更换为35mL的新鲜培养基(除去了PenStrep的培养基)，再培养48小时。将培养上清液回收至50mL的离心管中，在4℃、2,000×g下离心分离
10分钟。将上清液移至新的50mL的离心管中(剩下2mL不取)，添加7mL的MembranePro Precipitation Mix(Invitrogen公司)。数次倒转混和，在4℃下静置一昼夜以上。之后，在4℃、5,500×g下离心分离5分钟，用移液管除去上清液。向细胞团(pellet)中添加5mL将MembranePro Precipitation Mix用1×PBS(-)稀释6倍的溶液，再在4℃、5,500×g下离心分离5分钟，用移液管除去上清液。向细胞团中添加500μL的PBS(-)使其悬浮，进行分注，在-80℃下保存至使用。将其作为“HCV-VLP”。

[0313] (b)来自J6CF株的E1蛋白和E2蛋白(重组蛋白)的制作

[0314] 以实施例7的(1)中记载的方法，分别制作来自J6CF株的E1蛋白和E2蛋白(重组蛋白)。

[0315] (c)酶免疫测定(EIA)

[0316] 将各50ng作为重组蛋白的E1蛋白和E2蛋白混合，将其混合物用PBS(-)稀释并添加至96孔板(Nunc公司)中以达到50μL/孔，进行固相化。同样，添加在“a.HCV样颗粒(HCV-VLP)的制作”中制作的HCV-VLP，以达到500ng/孔，在4℃下培育一昼夜进行固相化。倾析(decant)除去抗原溶液，添加用milliQ水稀释5倍的Blocking One(Nacalai Tesque公司)，以达到200μL/孔，在室温下培育1小时进行封闭。倾析除去封闭溶液，用含有0.05％(v/v)吐温20(Sigma公司)的PBS(-)(下称“洗涤液”)洗涤2次。添加用洗涤液稀释的单克隆抗体溶液(P18-9E或P19-7D)，以达到50μL/孔。在作为阴性对照的孔中仅添加洗涤液，以达到50μL/孔。在室温下培育约1.5小时后，用洗涤液洗涤3次。接着，添加用洗涤液稀释至3,000倍的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Amersham公司)，以达到50μL/孔，在室温下培育1小时后，用洗涤液洗涤4次。按过氧化酶发色试剂盒(Sumiron公司)的产品所附文件制备发色液，添加该发色液以达到50μL/孔。在室温下培育15分钟后，添加试剂盒中包含的反应停止液，达到50μL/孔。之后，用酶标仪(Model 680，Bio-Rad公司)测定450nm的吸光度。由各孔的吸光度减去阴性对照的孔的吸光度，将所得的值作为各溶液的反应值。

[0317] 实验中用单克隆抗体8D10-3(WO2010/038789)作为对照抗体。单克隆抗体8D10-3是用重组E2蛋白对BALB/c小鼠进行免疫获得的、具有E2蛋白的线状表位的抗体。

[0318] 结果示于图6～图8中。图6显示使用将重组E1蛋白和E2蛋白的混合物固相化的板的、单克隆抗体8D10-3的EIA的结果。图7显示使用将HCV样颗粒(HCV-VLP)固相化的板的、单克隆抗体8D10-3和单克隆抗体P18-9E的EIA的结果。图8显示使用将HCV样颗粒(HCV-VLP)固相化的板的、单克隆抗体8D10-3和单克隆抗体P19-7D的EIA的结果。图中纵轴表示450nm的吸光度的值，横轴表示单克隆抗体的浓度(μg/mL)。

[0319] 结果显示，单克隆抗体8D10-3与作为重组蛋白的E1蛋白和E2蛋白的混合物反应(图6)。另一方面，单克隆抗体8D10-3对抗HCV-VLP的反应比单克隆抗体P18-9E对抗HCV-VLP弱(图7)。同样，单克隆抗体8D10-3对抗HCV-VLP的反应比单克隆抗体P19-7D对抗HCV-VLP弱(图8)。

[0320] 由于单克隆抗体8D10-3是具有E2蛋白的线状表位的抗体，识别HCV-VLP表面的包膜构造的能力弱；而单克隆抗体P18-9E和单克隆抗体P19-7D对抗HCV-VLP的反应强，暗示它们识别作为由HCV颗粒表面的E1蛋白和E2蛋白构成的复合物的包膜型构象(envelope conformation)。

[0321] B.使用Biacore研究单克隆抗体对抗HCV样颗粒(HCV-VLP)的反应性

[0322] (a)protein A/G的固定化

[0323] 在表面等离振子共振测定装置Biacore S51(GE公司)用传感器芯片中，将S系列传感器芯片CM-5(GE公司)装在Biacore S51上，达到将用超纯水稀释至1×的分析缓冲液即HBS-EP(GE公司)以30μL/分钟的流速在芯片上流过的状态。内部温度设定为25℃。制备胺偶联试剂盒(GE公司)中的EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，使其分别达到100mM和400mM。用Acetate 4.0(GE公司)制备50μg/mL的protein A/G(Pierce公司)。使用制备的EDC、NHS和同一试剂盒中的乙醇胺溶液将protein A/G用胺偶联法固定化。一系列的固定化操作以10μL/分钟的流速进行，protein A/G的添加时间设定为10分钟。由此在同一流动池(flow cell)的两个点1和2处将protein A/G近似等量固定化。

[0324] (b)抗体的捕获

[0325] 将用HBS-EP制成20μg/mL的、纯化单克隆抗体P18-9E和Mouse IgG(Sigma公司)以10μL/分钟的流速在上述芯片上流过8分钟。利用Protein A/G与各抗体的Fc部位的亲和性，在芯片上的点1处捕获单克隆抗体P18-9E，点2处捕获小鼠IgG。

[0326] (c)与VLP的结合和解离

[0327] 将用HBS-EP制成30、100、300μg/mL的HCV-VLP以10μL/分钟的流速在上述芯片上分别流过3分钟，通过表面等离振子共振实时测量监测VLP的结合反应后，将HBS-EP流过10分钟，测定解离反应。

[0328] (d)分析

[0329] 分析使用S51 Evaluation。测定值用共振反应的单位RU(Resonance Unit)表示。将HCV-VLP对抗小鼠IgG的反应作为非特异吸附，通过从HCV-VLP对抗单克隆抗体P18-9E的反应中减去来进行校正。

[0330] (e)结果

[0331] 其结果，观察到对单克隆抗体P18-9E有依赖于VLP浓度、且类似抗原抗体反应的温和结合及解离。该结果还暗示，单克隆抗体P18-9E与HCV-VLP结合，识别作为由HCV颗粒表面的E1蛋白和E2蛋白构成的复合物的包膜立体构造。

[0332] 产业上的可利用性

[0333] 本发明的具有HCV感染抑制活性的抗体可用作HCV感染的治疗和预防用药物。

[0334] 序列表自由文本

[0335] SEQ ID NO：1：表示克隆至pJFH-1中的HCV基因组cDNA。

[0336] SEQ ID NO：2：表示克隆至pJ6/JFH-1中的嵌合HCV基因组cDNA的序列。

[0337] SEQ ID NO：3：表示引物(J6E1dTM-s)的序列。

[0338] SEQ ID NO：4：表示引物(J6E1dTM-as)的序列。

[0339] SEQ ID NO：5：表示引物(J6E2dTM-s)的序列。

[0340] SEQ ID NO：6：表示引物(J6E2dTM-as)的序列。

[0341] SEQ ID NO：7：表示J6CF株的E1蛋白的1～162位的氨基酸的序列。

[0342] SEQ ID NO：8：表示J6CF株的E2蛋白的1～337位的氨基酸的序列。

[0343] SEQ ID NO：9：表示编码单克隆抗体P18-9E的VH的基因的核苷酸序列。

[0344] SEQ ID NO：10：表示编码单克隆抗体P18-9E的VL的基因的核苷酸序列。

[0345] SEQ ID NO：11：表示编码单克隆抗体P19-7D的VH的基因的核苷酸序列。

[0346] SEQ ID NO：12：表示编码单克隆抗体P19-7D的VL的基因的核苷酸序列。

[0347] SEQ ID NO：13：表示单克隆抗体P18-9E的VH的氨基酸序列。

[0348] SEQ ID NO：14：表示单克隆抗体P18-9E的VL的氨基酸序列。

[0349] SEQ ID NO：15：表示单克隆抗体P19-7D的VH的氨基酸序列。

[0350] SEQ ID NO：16：表示单克隆抗体P19-7D的VL的氨基酸序列。

[0351] SEQ ID NO：17：表示单克隆抗体P18-9E的VH中的FR1的氨基酸序列。

[0352] SEQ ID NO：18：表示单克隆抗体P18-9E的VH中的CDR1的氨基酸序列。

[0353] SEQ ID NO：19：表示单克隆抗体P18-9E的VH中的FR2的氨基酸序列。

[0354] SEQ ID NO：20：表示单克隆抗体P18-9E的VH中的CDR2的氨基酸序列。

[0355] SEQ ID NO：21：表示单克隆抗体P18-9E的VH中的FR3的氨基酸序列。

[0356] SEQ ID NO：22：表示单克隆抗体P18-9E的VH中的CDR3的氨基酸序列。

[0357] SEQ ID NO：23：表示单克隆抗体P18-9E的VH中的FR4(J区域)的氨基酸序列。

[0358] SEQ ID NO：24：表示单克隆抗体P18-9E的VL中的FR1的氨基酸序列。

[0359] SEQ ID NO：25：表示单克隆抗体P18-9E的VL中的CDR1的氨基酸序列。

[0360] SEQ ID NO：26：表示单克隆抗体P18-9E的VL中的FR2的氨基酸序列。

[0361] SEQ ID NO：27：表示单克隆抗体P18-9E的VL中的CDR2的氨基酸序列。

[0362] SEQ ID NO：28：表示单克隆抗体P18-9E的VL中的FR3的氨基酸序列。

[0363] SEQ ID NO：29：表示单克隆抗体P18-9E的VL中的CDR3的氨基酸序列。

[0364] SEQ ID NO：30：表示单克隆抗体P18-9E的VL中的FR4(J区)的氨基酸序列。

[0365] SEQ ID NO：31：表示单克隆抗体P19-7D的VH中的FR1的氨基酸序列。

[0366] SEQ ID NO：32：表示单克隆抗体P19-7D的VH中的CDR1的氨基酸序列。

[0367] SEQ ID NO：33：表示单克隆抗体P19-7D的VH中的FR2的氨基酸序列。

[0368] SEQ ID NO：34：表示单克隆抗体P19-7D的VH中的CDR2的氨基酸序列。

[0369] SEQ ID NO：35：表示单克隆抗体P19-7D的VH中的FR3的氨基酸序列。

[0370] SEQ ID NO：36：表示单克隆抗体P19-7D的VH中的CDR3的氨基酸序列。

[0371] SEQ ID NO：37：表示单克隆抗体P19-7D的VH中的FR4(J区)的氨基酸序列。

[0372] SEQ ID NO：38：表示单克隆抗体P19-7D的VL中的FR1的氨基酸序列。

[0373] SEQ ID NO：39：表示单克隆抗体P19-7D的VL中的CDR1的氨基酸序列。

[0374] SEQ ID NO：40：表示单克隆抗体P19-7D的VL中的FR2的氨基酸序列。

[0375] SEQ ID NO：41：表示单克隆抗体P19-7D的VL中的CDR2的氨基酸序列。

[0376] SEQ ID NO：42：表示单克隆抗体P19-7D的VL中的FR3的氨基酸序列。

[0377] SEQ ID NO：43：表示单克隆抗体P19-7D的VL中的CDR3的氨基酸序列。

[0378] SEQ ID NO：44：表示单克隆抗体P19-7D的VL中的FR4(J区)的氨基酸序列。

[0379] 本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请都原样作为参考，援引到本说明书中。