一种治疗帕金森病运动并发症的药物及其应用转让专利
申请号 : CN201210063023.8
文献号 : CN102600375B
文献日 : 2014-05-07
发明人 : 刘振国 , 魏江磊 , 吴娜 , 陈伟
申请人 : 上海交通大学医学院附属新华医院
摘要 :
本发明涉及一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻10-20份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5-20份、天南星5-20份。本发明还提供这种中药组合物的应用。本发明优点在于：配伍符合中药“君臣佐使”原则，药味数较少，具有疗效高、无毒副作用、价格低等优点，从病原根本入手，对症下药，以达到治疗的效果；制备方法简单，成本低，对环境友好，适于长期服用，是一种安全有效的治疗帕金森病运动并发症的中药组合物，具有良好的应用前景。
权利要求 :
1.一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻10-20份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5-20份、天南星5-20份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻12-16份、黄芪12-16份、熟地黄12-16份、白芍药16-25份、当归12-16份、钩藤12-16份、僵蚕8-12份、天南星8-12份。
3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻15份、黄芪15份、熟地黄15份、白芍药20份、当归15份、钩藤15份、僵蚕10份、天南星10份。
4.根据权利要求1-2任一所述的中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。
说明书 :
一种治疗帕金森病运动并发症的药物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种中药组合物，具体地说，是一种治疗帕金森病运动并发症的药物及其应用。
背景技术
[0002] 帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是中老年人常见的神经系统退行性疾患，主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的药物。但长期应用后大部分患者会出现症状波动、运动障碍和精神症状。加之实验室发现高浓度多巴胺（dopamine, DA）和左旋多巴由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死。因此，联合其他药物共同治疗PD运动并发症十分迫切。
[0003] 此外，研究发现纹状体GRKs和Arrestins表达的变化与PD的发展关系密切。近年研究表明，帕金森病运动并发症的发生与表达D1受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000，DARPP-32)的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了异动症(1evodopa-induced
dyskinesia，LID)的发病。
dyskinesia，LID)的发病。
[0004] 目前认为使用左旋多巴控释剂、多巴胺受体激动剂、B型单胺氧化酶(monoamine oxidase-B type，MAO-B)抑制剂和儿茶酚-氧位-甲基转移酶抑制剂(eateehol-O-methyl transferase inhibitor，COMTI)可延缓运动并发症的出现。但这些药物往往副作用较大，容易形成耐药性，不宜长期服用。我国在中医药治疗PD方面积累了丰富经验，总结其治疗原则是益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则。
[0005] 中国专利文献CN100409867C公开了一种熄风止颤胶囊，提供了由白芍、钩藤等组成的复方中药，治疗PD，改善震颤症状、肌强直、运动不能症状。李敏等提出了补肾活血中药可以改善PD患者运动并发症症状，且疗效随治疗时间延长而增加，该补肾活血中
药由山萸肉10g，何首乌15g，丹参15g，水蛭6g等中药组成，但没有公开其他中药成分
（详见：李敏等. 补肾活血颗粒治疗帕金森病运动并发症临床研究. 中华中医药杂志,
2011,26(6):1296-1299.）。但是关于一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物目前还未见报道。
药由山萸肉10g，何首乌15g，丹参15g，水蛭6g等中药组成，但没有公开其他中药成分
（详见：李敏等. 补肾活血颗粒治疗帕金森病运动并发症临床研究. 中华中医药杂志,
2011,26(6):1296-1299.）。但是关于一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物目前还未见报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物。
[0007] 本发明的再一的目的是，提供一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物的应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻10-20份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5-20份、天南星5-20份。
[0009] 所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻12-16份、黄芪12-16份、熟地黄12-16份、白芍药16-25份、当归12-16份、钩藤12-16份、僵蚕8-12份、天南星8-12份。
[0010] 所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻15份、黄芪15份、熟地黄15份、白芍药20份、当归15份、钩藤15份、僵蚕10份、天南星10份。
[0011] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。
[0012] 本发明优点在于：
[0013] 1、本发明的中药组合物，其配伍符合中药“君臣佐使”原则，药味数较少，具有疗效高、无毒副作用、价格低等优点，采用治疗原则是益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，从病原根本入手，对症下药，以达到治疗的效果；
[0014] 2、制备方法简单，成本低，对环境友好，适于长期服用，是一种安全有效的治疗帕金森病运动并发症的中药组合物，具有良好的应用前景。
附图说明
[0015] 附图1是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型AIM评分的影响，#与西药组比较，P<0.05；*与小剂量组比较，均P<0.05；+与中剂量组比较，P<0.01。
[0016] 附图2是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型剂峰旋转次数的影响，#与西药组比较，均P<0.01；*与西药组比较，均P<0.01。
[0017] 附图3是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响的免疫组化结果，A:sham组，B:LID组，C:levodopa组，D:TCM-low组，E:TCM-medium组，F:TCM-high组。
[0018] 附图4是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响的Western结果，1:sham组，2:LID组， 3:levodopa组，4:TCM-low组，5:TCM-medium组，6:TCM-high组。
[0019] 附图5是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32（THr75）表达的影响的免疫组化结果，A:sham组，B:LID组，C:levodopa组，D:TCM-low组，E:TCM-medium组，F:TCM-high组。
[0020] 附图6是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32（THr75）表达的影响的Western结果，1:sham组，2:LID组， 3:levodopa组，4:TCM-low组，
5:TCM-medium组，6:TCM-high组。
5:TCM-medium组，6:TCM-high组。
[0021] 附图7是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区GRK6的影响的免疫组化结果，1:sham组，2:LID组，3:levodopa组，4:TCM-low组，5:TCM-medium组，6:TCM-high组；U:未损伤侧，L:损伤侧。
[0022] 附图8是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区GRK6的影响的Western结果，1’、2’:sham组，3’、4’:PD组，5’、6’:LID组，1、2:levodopa组，3、4:TCM-low组，5、
6:TCM-medium组，7、8:TCM-high组； 1’、3’、5’、1、3、5、7:未损伤侧，2’、4’、6’、2、4、6、8:
损伤侧。
6:TCM-medium组，7、8:TCM-high组； 1’、3’、5’、1、3、5、7:未损伤侧，2’、4’、6’、2、4、6、8:
损伤侧。
[0023] 附图9是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区β-arrestin1的影响的免疫组化结果，1:sham组，2:LID组，3:levodopa组，4:TCM-low组，5:TCM-medium组，
6:TCM-high组；U:未损伤侧，L:损伤侧。
6:TCM-high组；U:未损伤侧，L:损伤侧。
[0024] 附图10是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区β-arrestin1的影响的Western结果，1’、2’:sham组，3’、4’:PD组，5’、6’:LID组，1、2:evodopa组，3、4:TCM-low组，5、6:TCM-medium组，7、8:TCM-high组； 1’、3’、5’、1、3、5、7:未损伤侧，2’、4’、6’、2、4、
6、8:损伤侧。
6、8:损伤侧。
具体实施方式
[0025] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0026] 本发明提供一种治疗帕金森病运动并发症的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成：天麻10-20份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5-20份、天南星5-20份。
[0027] 实施例1 中药组合物的制备（一）
[0028] 天麻10份、黄芪20份、熟地黄10份、白芍药30份、当归10份、钩藤20份、僵蚕5份、天南星20份，常规方法煎煮。
[0029] 实施例2 中药组合物的制备（二）
[0030] 天麻11份、黄芪19份、熟地黄11份、白芍药28份、当归11份、钩藤19份、僵蚕6份、天南星18份，常规方法煎煮。
[0031] 实施例3 中药组合物的制备（三）
[0032] 天麻12份、黄芪18份、熟地黄12份、白芍药26份、当归12份、钩藤18份、僵蚕8份、天南星16份，常规方法煎煮。
[0033] 实施例4 中药组合物的制备（四）
[0034] 天麻13份、黄芪17份、熟地黄13份、白芍药24份、当归13份、钩藤17份、僵蚕12份、天南星14份，常规方法煎煮。
[0035] 实施例5 中药组合物的制备（五）
[0036] 天麻14份、黄芪16份、熟地黄14份、白芍药22份、当归14份、钩藤16份、僵蚕14份、天南星12份，常规方法煎煮。
[0037] 实施例6 中药组合物的制备（六）
[0038] 天麻15份、黄芪15份、熟地黄15份、白芍药20份、当归15份、钩藤15份、僵蚕10份、天南星10份，常规方法煎煮。
[0039] 实施例7 中药组合物的制备（七）
[0040] 天麻16份、黄芪14份、熟地黄16份、白芍药18份、当归16份、钩藤14份、僵蚕16份、天南星8份，常规方法煎煮。
[0041] 实施例8 中药组合物的制备（八）
[0042] 天麻17份、黄芪13份、熟地黄17份、白芍药16份、当归17份、钩藤13份、僵蚕18份、天南星6份，常规方法煎煮。
[0043] 实施例9 中药组合物的制备（九）
[0044] 天麻18份、黄芪12份、熟地黄18份、白芍药14份、当归18份、钩藤12份、僵蚕20份、天南星5份，常规方法煎煮。
[0045] 实施例10 中药组合物的制备（十）
[0046] 天麻19份、黄芪11份、熟地黄19份、白芍药12份、当归19份、钩藤11份、僵蚕15份、天南星15份，常规方法煎煮。
[0047] 实施例11 中药组合物的制备（十一）
[0048] 天麻20份、黄芪10份、熟地黄20份、白芍药10份、当归20份、钩藤10份、僵蚕9份、天南星7份，常规方法煎煮。
[0049] 实施例12 中药组合物的制备（十二）
[0050] 天麻18份、黄芪18份、熟地黄18份、白芍药24份、当归18份、钩藤18份、僵蚕12份、天南星12份，常规方法煎煮。
[0051] 实施例13 中药组合物的制备（十三）
[0052] 天麻12份、黄芪12份、熟地黄12份、白芍药16份、当归12份、钩藤12份、僵蚕8份、天南星8份，常规方法煎煮。
[0053] 需要说明的是，实施例1-13所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。
[0054] 实施例14 本发明的中药组合物的临床前试验
[0055] 一、实验方法
[0056] 1.LID模型制备和分组
[0057] 利用6-OHDA制备PD模型大鼠后，腹腔注射左旋多巴甲酯 /苄丝肼（50 mg/kg左旋多巴甲酯和 25 mg/ kg苄丝肼）溶于含0.2%维生素 C的消毒生理盐水中)4周，制备异
动症（levodopa-induced dyskinesia, LID）大鼠模型，随机将LID模型分为：LID组、西药组、中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组。LID组为LID模型大鼠腹腔注射 0.2%维生素 C液29天。西药组为腹腔注射左旋多巴甲酯+苄丝肼（50 mg/
kg左旋多巴甲酯和 25 mg/ kg苄丝肼）溶于含0.2%维生素 C的消毒生理盐水中），2次/d (上午9点和下午5点)，持续 29d；中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组在给予左旋多巴甲酯+苄丝肼的基础上分别加用本发明的中药组合物，9 ml /kg，每日1次灌胃，连续4周。中药组合物中剂量组参照实施例6所述的方法制备中药组合物；中药组合物大剂量组按照中剂量组各中药原料药各增加20%，参照实施例12所述的方法制备；中药组合物小剂量组按照中剂量组各中药原料药各减少20%，参照实施例13所述的方法制备。在治疗过程中于第8、15、22、29天上午用药后进行异常不自主运动(AIM)评分及剂峰旋转次数测定。AIM评定：AIM分成4个组分（上肢AIM、口面部AIM、轴性AIM和旋转AIM）进行评定，每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级（0-4）：0 无；1 持续时间小于30s；2 持续时间大于30s，小于60s；3 持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4 持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察1min。AIM总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上1只大鼠一次用药后各组分AIM最大
评分为4分，总AIM评分为16分。剂峰旋转次数：注射左旋多巴后，每5min记录旋转次数，最多的旋转次数为剂峰旋转次数。
动症（levodopa-induced dyskinesia, LID）大鼠模型，随机将LID模型分为：LID组、西药组、中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组。LID组为LID模型大鼠腹腔注射 0.2%维生素 C液29天。西药组为腹腔注射左旋多巴甲酯+苄丝肼（50 mg/
kg左旋多巴甲酯和 25 mg/ kg苄丝肼）溶于含0.2%维生素 C的消毒生理盐水中），2次/d (上午9点和下午5点)，持续 29d；中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组在给予左旋多巴甲酯+苄丝肼的基础上分别加用本发明的中药组合物，9 ml /kg，每日1次灌胃，连续4周。中药组合物中剂量组参照实施例6所述的方法制备中药组合物；中药组合物大剂量组按照中剂量组各中药原料药各增加20%，参照实施例12所述的方法制备；中药组合物小剂量组按照中剂量组各中药原料药各减少20%，参照实施例13所述的方法制备。在治疗过程中于第8、15、22、29天上午用药后进行异常不自主运动(AIM)评分及剂峰旋转次数测定。AIM评定：AIM分成4个组分（上肢AIM、口面部AIM、轴性AIM和旋转AIM）进行评定，每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级（0-4）：0 无；1 持续时间小于30s；2 持续时间大于30s，小于60s；3 持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4 持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察1min。AIM总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上1只大鼠一次用药后各组分AIM最大
评分为4分，总AIM评分为16分。剂峰旋转次数：注射左旋多巴后，每5min记录旋转次数，最多的旋转次数为剂峰旋转次数。
[0058] 2.免疫组化染色
[0059] 结束注射后12h，3%戊巴比妥钠麻醉，于左心室灌注4%多聚甲醛固定，断头取脑后相同固定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5μm。取纹状体冠状层面采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法行免疫组化染色，步骤如下：石蜡切片脱蜡至水；3%双氧水室温避光孵育
5min，以消除内源性过氧化氢酶活性；PH7.7的1nmol/l 乙二胺四乙酸-三羟甲基氨基甲
烷-氯化氢(EDTA-Tris-HCl微波加热修复；1%牛血清白蛋白室温封20min；GRK6多克隆
抗体（1：200）、β-arrestin1多克隆抗体（1：500）、兔抗鼠DARPP-32抗体（1：500）、抗磷酸化DARPP-32(Thr75)抗体（1：500）、兔抗大鼠总ERKl/2单克隆抗体（1：500）和兔抗大鼠磷酸化ERKl/2单克隆抗体（1：500）4℃湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗，
37℃孵育20min；滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min；联苯二胺（3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB）显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用0.01mol/l TBS充分漂洗，TBS代替一抗作为阴性对照。在显微镜下观察免疫组化切片，各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜(10×40)下观察，采用OLYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5.1图象处理软件进行半定量分析，计算GRK6蛋白阳性细胞指数（IOD）=阳性细胞面积×校正光密度值（测量区光密度－背景光密度）。
5min，以消除内源性过氧化氢酶活性；PH7.7的1nmol/l 乙二胺四乙酸-三羟甲基氨基甲
烷-氯化氢(EDTA-Tris-HCl微波加热修复；1%牛血清白蛋白室温封20min；GRK6多克隆
抗体（1：200）、β-arrestin1多克隆抗体（1：500）、兔抗鼠DARPP-32抗体（1：500）、抗磷酸化DARPP-32(Thr75)抗体（1：500）、兔抗大鼠总ERKl/2单克隆抗体（1：500）和兔抗大鼠磷酸化ERKl/2单克隆抗体（1：500）4℃湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗，
37℃孵育20min；滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min；联苯二胺（3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB）显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用0.01mol/l TBS充分漂洗，TBS代替一抗作为阴性对照。在显微镜下观察免疫组化切片，各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜(10×40)下观察，采用OLYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5.1图象处理软件进行半定量分析，计算GRK6蛋白阳性细胞指数（IOD）=阳性细胞面积×校正光密度值（测量区光密度－背景光密度）。
[0060] 3.Western blot蛋白免疫印迹
[0061] 结束注射后 3h，快速冰上分离双侧纹状体，每10mg组织加入100μl蛋白裂解液RIPA和1μl蛋白酶抑制剂PMSF，超声裂解，提取总蛋白。测定蛋白浓度后于 - 80℃保存。40μg样本经10% SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至二氟化树(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，用5%脱脂奶粉洗脱缓冲液后室温封闭 1 h；加入抗GRK6抗体
(1:500)、抗β-arrestin1抗体（1:500）、抗总DARPP-32抗体(1:1000)或抗磷酸化
DARPP-32(Thr75) 抗体(1:1000)、抗总ERKl/2抗体(1:1000)或抗磷酸化ERKl/2抗体
(1：500)或抗β-actin (l:1000)，4℃孵育过夜；TBST冲洗，加HRP标记的山羊抗兔二抗 (1:1000)或山羊抗小鼠二抗（1:3000），37℃孵育 1h；TBST冲洗，滴加ECL显色液，Bio-Rad凝胶成像仪曝光、显像。Western blot图像采用SmartView2000图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。
(1:500)、抗β-arrestin1抗体（1:500）、抗总DARPP-32抗体(1:1000)或抗磷酸化
DARPP-32(Thr75) 抗体(1:1000)、抗总ERKl/2抗体(1:1000)或抗磷酸化ERKl/2抗体
(1：500)或抗β-actin (l:1000)，4℃孵育过夜；TBST冲洗，加HRP标记的山羊抗兔二抗 (1:1000)或山羊抗小鼠二抗（1:3000），37℃孵育 1h；TBST冲洗，滴加ECL显色液，Bio-Rad凝胶成像仪曝光、显像。Western blot图像采用SmartView2000图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。
[0062] 4. 统计学方法
[0063] 采用 SPSS 13.0软件进行统计学处理。数据以均数±标准误差表示，用单因素方差分析及独立T建议进行检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
[0064] 二、结果
[0065] （一）不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型行为学的影响
[0066] 1. 中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型各组分AIM评分的影响
[0067] 就口面部AIM评分而言，第8天各组间均值无显著差异（F=2.18, P >0.05），第15、22、29天各组间均值差异显著（F=10.43、F=11.70、F=15.62, P<0.01）。小剂量组与西药组比较，各天差异均不明显。第15、22、29天中剂量组比小剂量组明显降低，差异有统计学意义（t=5.06、t=5.48、t=5.46, 均P<0.01）。中剂量组与大剂量组比较，无统计学差异。
[0068] 就上肢AIM评分而言，第8、22、29天各组间均值差异有统计学意义（F=9.64、F=13.70、F=30.30, P<0.01），第15天各组间无明显差异。小剂量组与西药组比较，仅于第
22天差异显著（t=5.69, P<0.01）。中剂量组于第8、15、22天于小剂量组比较差异不显著，仅于第29天差异有统计学意义（t=6.20, P<0.01），与西药组比较，第22、29天差异有统计学意义（t=3.11、t=7.30, 均P<0.05）。大剂量组与中剂量组之间比较，第8、22天时差异有统计学差异（t=5.06、t=2.53, 均P<0.05）； 与西药组比较，第8、15、22、29天差异均有统计学意义（t=3.10、t=2.72、t=6.06、t=7.31, 均P<0.05）。
22天差异显著（t=5.69, P<0.01）。中剂量组于第8、15、22天于小剂量组比较差异不显著，仅于第29天差异有统计学意义（t=6.20, P<0.01），与西药组比较，第22、29天差异有统计学意义（t=3.11、t=7.30, 均P<0.05）。大剂量组与中剂量组之间比较，第8、22天时差异有统计学差异（t=5.06、t=2.53, 均P<0.05）； 与西药组比较，第8、15、22、29天差异均有统计学意义（t=3.10、t=2.72、t=6.06、t=7.31, 均P<0.05）。
[0069] 就轴向AIM评分而言，第8、15、22、29天各组间比较，均无统计学意义。
[0070] 就旋转AIM评分而言，第15、22、29天各组间均值差异显著（F=17.12、F=27.26、F=26.18, P<0.01）。第8、15、22、29天小剂量组与西药组比较均无统计学意义。第15、22、29天中剂量组与西药组比较，旋转AIM值均明显降低，差异有统计学意义（t=5.67、t=6.80、t=6.40, 均P<0.01）。大剂量组比中剂量组第15、22天旋转AIM评分降低（t=2.43、t=2.32, 均P<0.05）。（见表1）
[0071] 表1 中 药 组 合 物 TCM小、中、大 剂 量 与 西 药 组 AIM评 分 的 比 较（ ±S，分）
[0072]时间 组别 鼠数（只） 口面部 上肢 轴向 旋转
8d 西药治疗组 5 2.47±0.31 2.73±0.15 3.13±0.64 3.58±0.26
TCM-小剂量组 5 2.38±0.33 2.8±0.09 3.02±0.58 3.6±0.19
TCM-中剂量组 5 2.36±0.30 2.82±0.10 3.04±0.59 3.40±0.19
TCM-大剂量组 5 1.98±0.37 2.47±0.12 2.84±0.49 3.29±0.24
15d 西药治疗组 5 2.58±0.27 2.84±0.17 3.18±0.66 3.6±0.23
TCM-小剂量组 5 2.64±0.24 2.73±0.15 3.22±0.69 3.64±0.18
TCM-中剂量组 5 1.93±0.20 2.64±0.27 2.84±0.51 2.93±0.13
TCM-大剂量组 5 1.87±0.40 2.51±0.22 2.73±0.42 3.18±0.19
22d 西药治疗组 5 2.69±0.29 2.91±0.12 3.18±0.66 3.62±0.22
TCM-小剂量组 5 2.53±0.27 2.51±0.10 2.96±0.56 3.38±0.10
TCM-中剂量组 5 1.78±0.16 2.62±0.17 2.78±0.47 2.82±0.15
TCM-大剂量组 5 1.91±0.41 2.36±0.16 2.60±0.34 3.02±0.12
29d 西药治疗组 5 2.71±0.28 2.96±0.13 3.18±0.66 3.58±0.16
TCM-小剂量组 5 2.64±0.31 2.87±0.14 3.18±0.66 3.47±0.14
TCM-中剂量组 5 1.69±0.24 2.18±0.20 2.69±0.40 2.89±0.18
TCM-大剂量组 5 1.80±0.38 2.27±0.17 2.53±0.30 2.89±0.16
8d 西药治疗组 5 2.47±0.31 2.73±0.15 3.13±0.64 3.58±0.26
TCM-小剂量组 5 2.38±0.33 2.8±0.09 3.02±0.58 3.6±0.19
TCM-中剂量组 5 2.36±0.30 2.82±0.10 3.04±0.59 3.40±0.19
TCM-大剂量组 5 1.98±0.37 2.47±0.12 2.84±0.49 3.29±0.24
15d 西药治疗组 5 2.58±0.27 2.84±0.17 3.18±0.66 3.6±0.23
TCM-小剂量组 5 2.64±0.24 2.73±0.15 3.22±0.69 3.64±0.18
TCM-中剂量组 5 1.93±0.20 2.64±0.27 2.84±0.51 2.93±0.13
TCM-大剂量组 5 1.87±0.40 2.51±0.22 2.73±0.42 3.18±0.19
22d 西药治疗组 5 2.69±0.29 2.91±0.12 3.18±0.66 3.62±0.22
TCM-小剂量组 5 2.53±0.27 2.51±0.10 2.96±0.56 3.38±0.10
TCM-中剂量组 5 1.78±0.16 2.62±0.17 2.78±0.47 2.82±0.15
TCM-大剂量组 5 1.91±0.41 2.36±0.16 2.60±0.34 3.02±0.12
29d 西药治疗组 5 2.71±0.28 2.96±0.13 3.18±0.66 3.58±0.16
TCM-小剂量组 5 2.64±0.31 2.87±0.14 3.18±0.66 3.47±0.14
TCM-中剂量组 5 1.69±0.24 2.18±0.20 2.69±0.40 2.89±0.18
TCM-大剂量组 5 1.80±0.38 2.27±0.17 2.53±0.30 2.89±0.16
[0073] 2. 中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型AIM评分的影响
[0074] 用药第8、15、22、29天进行评分，结果显示西药组总AIM评分为（11.91±0.55）、（12.2±0.65）、（12.4±0.65）、（12.42±0.70）分，小剂量组总AIM评分为（11.80±0.42）、（12.24±0.78）、（11.38±0.37）、（12.16±0.64）分，二组比较，仅第22天差异明显（t=3.06，p<0.05）。而中剂量组与小剂量组比较，第15、22、29天中剂量组总AIM评分分别为（10.36±0.41）分、（10.00±0.29）分、（9.44±0.16）分均低于小剂量组，差异有统计学意义（t=4.77、t=6.51、t=9.22，p<0.01）；大剂量组总AIM评分分别为（10.58±0.32）分、（10.29±0.41）分、（9.89±0.42）分、（9.49±0.49）分，仅于第8天较中剂量组的（11.62±0.45）分低（t=4.24，p<0.01），其余时间点大剂量组与中剂量组比较，差异无统计学意义（见图1）。
[0075] 3. 中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型剂峰旋转次数的影响
[0076] 于第8、15、22、29天分别进行剂峰旋转次数检测，小剂量组第22、29天该值为（139.8±8.76）次、（136.8±13.31）次，明显低于西药治疗组（170.0±12.63）次、
（169.2±8.79）次，差异有统计学意义（t=4.39、t=4.54, 均p<0.01）。而第15、22、29天中剂量组剂峰旋转次数分别为（142.8±10.43）次、（139.4±19.78）次、（125.2±13.16）次，与西药组比较有明显差异（t=2.71、t=2.90、t=6.22, 均p<0.05）。大剂量组分别为（141.6±16.74）次、（128.0±12.14）、（120.0±13.66）次、（115.0±14.09）次，与中剂量比较无明显差异，与小剂量组比较，第15、22、23天有显著差异（t=2.52、t=2.73、 t=2.52, 均p<0.05）（见图2）。
（169.2±8.79）次，差异有统计学意义（t=4.39、t=4.54, 均p<0.01）。而第15、22、29天中剂量组剂峰旋转次数分别为（142.8±10.43）次、（139.4±19.78）次、（125.2±13.16）次，与西药组比较有明显差异（t=2.71、t=2.90、t=6.22, 均p<0.05）。大剂量组分别为（141.6±16.74）次、（128.0±12.14）、（120.0±13.66）次、（115.0±14.09）次，与中剂量比较无明显差异，与小剂量组比较，第15、22、23天有显著差异（t=2.52、t=2.73、 t=2.52, 均p<0.05）（见图2）。
[0077] （二）不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区信号蛋白的影响
[0078] 1. 中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响
[0079] 免疫组化显示各组总ERK1/2表达量无显著差异，对于磷酸化ERK1/2，损伤侧均值差异显著（F=108.79, P<0.01）。LID大鼠磷酸化ERK1/2阳性细胞指数
4 4
为（8.09±0.37）×10，明显高于sham组大鼠的（5.25±0.34）×10，差异有统计学
意义（t=39.84, P<0.01）。左旋多巴长期治疗后，磷酸化ERK1/2表达进一步升高至
4
（8.87±0.23）×10，差异有统计学意义（t=11.54, P<0.01）。加用中药组合物治疗后，大、
4 4
中、小剂量组磷酸化ERK1/2阳性细胞指数分别为（5.48±0.30）×10、（5.03±0.55）×10、
4
（5.57±0.25）×10，明显逆转了磷酸化ERK1/2表达的升高，与LID组比较，差异均有统计学差异（t=12.23、t=12.38、t=46.36, P<0.01）。而大、中、小剂量组之间比较，差异无统计学意义（见图3）。
4 4
为（8.09±0.37）×10，明显高于sham组大鼠的（5.25±0.34）×10，差异有统计学
意义（t=39.84, P<0.01）。左旋多巴长期治疗后，磷酸化ERK1/2表达进一步升高至
4
（8.87±0.23）×10，差异有统计学意义（t=11.54, P<0.01）。加用中药组合物治疗后，大、
4 4
中、小剂量组磷酸化ERK1/2阳性细胞指数分别为（5.48±0.30）×10、（5.03±0.55）×10、
4
（5.57±0.25）×10，明显逆转了磷酸化ERK1/2表达的升高，与LID组比较，差异均有统计学差异（t=12.23、t=12.38、t=46.36, P<0.01）。而大、中、小剂量组之间比较，差异无统计学意义（见图3）。
[0080] Western结果与免疫组化基本一致，LID大鼠磷酸化ERK1/2的灰度值为6 6
（5.39±0.09）×10，比sham组大鼠的（3.54±0.12）×10 明显增多（t=24.19, P<0.01）；
6
左旋多巴长期治疗后，磷酸化ERK1/2的灰度值进一步升高至（5.56±0.16）×10，但与LID对照组比较，差异无统计学意义。用大、中、小剂量中药组合物治疗的大鼠纹状体磷酸化
6 6 6
ERK1/2表达量分别为（3.58±0.14）×10、（3.45±0.17）×10、（3.65±0.15）×10，与LID大鼠比较均有明显降低，差异有统计学意义（t=20.12、t=19.83、t=26.61, P<0.01）（见图
4）。
（5.39±0.09）×10，比sham组大鼠的（3.54±0.12）×10 明显增多（t=24.19, P<0.01）；
6
左旋多巴长期治疗后，磷酸化ERK1/2的灰度值进一步升高至（5.56±0.16）×10，但与LID对照组比较，差异无统计学意义。用大、中、小剂量中药组合物治疗的大鼠纹状体磷酸化
6 6 6
ERK1/2表达量分别为（3.58±0.14）×10、（3.45±0.17）×10、（3.65±0.15）×10，与LID大鼠比较均有明显降低，差异有统计学意义（t=20.12、t=19.83、t=26.61, P<0.01）（见图
4）。
[0081] 2.不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32（THr75）表达的影响
[0082] 免疫组化显示各组损伤侧均值差异显著（F=132.42, P<0.01）。sham组大鼠磷4 4
酸化DARPP-32（THr75）表达量为（7.06±0.57）×10，LID组为（3.85±0.30）×10，明
显降低，差异有统计学意义（t=16.30, P<0.01）。左旋多巴长期治疗后，磷酸化DARPP-32
4
（THr75）表达进一步降低至（3.53±0.20）×10，差异有统计学意义（t=6.49, P<0.01）。加用中药组合物治疗后，大、中、小剂量中药组合物组磷酸化DARPP-32（THr75）表达量分别为
4 4 4
（8.54±0.17）×10、（8.10±0.31）×10、（7.06±0.69）×10，明显逆转了磷酸化ERK1/2表达的降低，与LID对照组比较，差异有统计学意义（t=8.49、t=18.24、t=22.73, 均P<0.01）。
大、中、小剂量中药组合物组之间比较，中剂量组比小剂量组磷酸化DARPP-32（THr75）表达有所增多，差异有统计学意义（t=3.48, P<0.05），大剂量组比中剂量组表达增多（t=3.13, P<0.05）。（见图5）。
酸化DARPP-32（THr75）表达量为（7.06±0.57）×10，LID组为（3.85±0.30）×10，明
显降低，差异有统计学意义（t=16.30, P<0.01）。左旋多巴长期治疗后，磷酸化DARPP-32
4
（THr75）表达进一步降低至（3.53±0.20）×10，差异有统计学意义（t=6.49, P<0.01）。加用中药组合物治疗后，大、中、小剂量中药组合物组磷酸化DARPP-32（THr75）表达量分别为
4 4 4
（8.54±0.17）×10、（8.10±0.31）×10、（7.06±0.69）×10，明显逆转了磷酸化ERK1/2表达的降低，与LID对照组比较，差异有统计学意义（t=8.49、t=18.24、t=22.73, 均P<0.01）。
大、中、小剂量中药组合物组之间比较，中剂量组比小剂量组磷酸化DARPP-32（THr75）表达有所增多，差异有统计学意义（t=3.48, P<0.05），大剂量组比中剂量组表达增多（t=3.13, P<0.05）。（见图5）。
[0083] Western结果与免疫组化结果基本一致，sham组大鼠磷酸化DARPP-32（THr75）6 6
的灰度值为（2.08±0.22）×10，LID组为（1.08±0.12）×10，明显降低，差异有统计学
意义（t=16.53, P<0.01）；左旋多巴长期治疗后，磷酸化DARPP-32（THr75）灰度值进一步
6
降低至（0.97±0.24）×10，但与LID组比较，差异无统计学意义。用大、中、小剂量中药
6
组合物治疗后，大鼠纹状体磷酸化DARPP-32（THr75）灰度值分别为（2.40±0.09）×10、
6 6
（2.37±0.16）×10、（1.44±0.14）×10，与LID组大鼠比较，差异均有统计学意义
（t=52.74、t=30.75、t=10.81, P<0.01）。但中剂量、大剂量组逆转磷酸化DARPP-32（THr75）的程度大于小剂量组，几乎恢复到正常大鼠的水平。中剂量组与大剂量组之间比较，无明显差异（见图6）。
的灰度值为（2.08±0.22）×10，LID组为（1.08±0.12）×10，明显降低，差异有统计学
意义（t=16.53, P<0.01）；左旋多巴长期治疗后，磷酸化DARPP-32（THr75）灰度值进一步
6
降低至（0.97±0.24）×10，但与LID组比较，差异无统计学意义。用大、中、小剂量中药
6
组合物治疗后，大鼠纹状体磷酸化DARPP-32（THr75）灰度值分别为（2.40±0.09）×10、
6 6
（2.37±0.16）×10、（1.44±0.14）×10，与LID组大鼠比较，差异均有统计学意义
（t=52.74、t=30.75、t=10.81, P<0.01）。但中剂量、大剂量组逆转磷酸化DARPP-32（THr75）的程度大于小剂量组，几乎恢复到正常大鼠的水平。中剂量组与大剂量组之间比较，无明显差异（见图6）。
[0084] 3.不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区GRK6的影响
[0085] 免疫组化结果显示GRK6表达于细胞膜上。各组未损伤侧均值比较，差异无统计学意义（F=0.46, P>0.05），各组损伤侧均值差异有统计学意义（F=12.47, P<0.05）。LID
3 3
大鼠损伤侧GRK6表达为（3.53±0.71）×10，与正常大鼠的（6.20±0.59）×10 相比，
明显降低（t=12.63, P<0.01）。随着左旋多巴治疗时间的延长，GRK6表达进一步减少至
3
（2.45±0.58）×10，但与LID组大鼠比较，无统计学差异（P>0.05）。而加用大、中、小剂
3
量中药组合物治疗的大鼠，各组纹状体损伤侧GRK6表达分别升高至（3.57±0.81）×10、
3 3
（3.80±0.84）×10、（3.34±0.98）×10 均比西药组大鼠有所升高，差异有统计学意义
（t=3.23、t=3.23、t=4.17, 均P<0.05）。大、中、小剂量组之间比较，差异不显著（见图7）。
3 3
大鼠损伤侧GRK6表达为（3.53±0.71）×10，与正常大鼠的（6.20±0.59）×10 相比，
明显降低（t=12.63, P<0.01）。随着左旋多巴治疗时间的延长，GRK6表达进一步减少至
3
（2.45±0.58）×10，但与LID组大鼠比较，无统计学差异（P>0.05）。而加用大、中、小剂
3
量中药组合物治疗的大鼠，各组纹状体损伤侧GRK6表达分别升高至（3.57±0.81）×10、
3 3
（3.80±0.84）×10、（3.34±0.98）×10 均比西药组大鼠有所升高，差异有统计学意义
（t=3.23、t=3.23、t=4.17, 均P<0.05）。大、中、小剂量组之间比较，差异不显著（见图7）。
[0086] Western结果与免疫组化基本一致。就每只大鼠而言，检测结果以损伤侧/未损伤侧的比值表示，β-actin作为内参。PD大鼠GRK6表达量为（81.42±5.94）%，较假手术组的（100.88±5.57）%降低（t=7.37, P<0.01）；左旋多巴长期治疗发展为异动症时， GRK6表达量进一步降低至（73.66±3.43）%，差异有统计学意义（t=3.11, P<0.05）；异动症大鼠继续使用西药治疗后，GRK6表达量为（56.32±4.45）%，比异动症大鼠使用生理盐水治疗的对照组减少，差异有统计学意义（t=6.56, P<0.01）。而加用中药组合物治疗后，小剂量组大鼠纹状体GRK6表达量为（79.12±3.15）%，与使用西药治疗的大鼠比较无统计学差异，中剂量组（83.98±4.50）%较西药组GRK6表达量明显增多，差异有统计学意义（t=3.06, P<0.05），大剂量组表达量为（80.56±4.74）%，大、中剂量之间比较，GRK6表达量差异无统计学意义（见图8）。
[0087] 4. 中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区β-arrestin1的影响
[0088] 免疫组化显示β-arrestin1表达于细胞膜，各组损伤侧均值差异显著（F=12.34,4
P<0.05）。LID对照组大鼠β-arrestin1蛋白IOD值为（2.54±0.49）×10，低于sham组
4
大鼠的（4.54±0.63）×10，差异有统计学意义（t=5.95, P<0.01）。左旋多巴长期治疗
4
后，β-arrestin1表达进一步降低至（1.90±0.33）×10，但差异无统计学意义。加用中
4
药组合物治疗后，大、中、小剂量组β-arrestin1蛋白IOD值分别为（2.34±0.45）×10、
4 4
（2.28±0.58）×10、（3.4±1.01）×10，逆转了大鼠纹状体损伤侧β-arrestin1表达的下降，特别是大剂量组大鼠β-arrestin1表达比西药治疗组大鼠明显增多，差异有统计学意义（t=2.91, P<0.05）（见图9）。
P<0.05）。LID对照组大鼠β-arrestin1蛋白IOD值为（2.54±0.49）×10，低于sham组
4
大鼠的（4.54±0.63）×10，差异有统计学意义（t=5.95, P<0.01）。左旋多巴长期治疗
4
后，β-arrestin1表达进一步降低至（1.90±0.33）×10，但差异无统计学意义。加用中
4
药组合物治疗后，大、中、小剂量组β-arrestin1蛋白IOD值分别为（2.34±0.45）×10、
4 4
（2.28±0.58）×10、（3.4±1.01）×10，逆转了大鼠纹状体损伤侧β-arrestin1表达的下降，特别是大剂量组大鼠β-arrestin1表达比西药治疗组大鼠明显增多，差异有统计学意义（t=2.91, P<0.05）（见图9）。
[0089] Western结果 与免疫 组化 基本一 致，PD大鼠β-arrestin1表 达量 为（76.66±5.12）%，比sham组大鼠的（101.86±6.79）%明显减少（t=11.48, P<0.01）；左旋多巴长期治疗进一步降低至（65.44±6.68）%，差异有统计学意义（t=8.31, P<0.01）；异动症大鼠继续使用左旋多巴治疗的西药治疗组β-arrestin1表达量为（48.7±4.08）%，较LID对照组明显降低（t=5.56, P<0.01）。加用中药组合物治疗后，仅大剂量组异动症大鼠纹状体β-arrestin1表达量（56.54±3.52）%与LID对照组大鼠比较，差异无统计学意义，中、小剂量β-arrestin1表达量分别是（53.74±2.81）%和（51.62±3.26）%，较LID对照组有进一步下降的趋势，但较单用西药的异动症大鼠下降幅度小（见图10）。
[0090] 三、结论
[0091] 综上所述，本发明的中药组合物可以降低异动症大鼠的异常不自主运动评分及大鼠剂峰旋转次数，降低了异动症大鼠纹状体磷酸化ERK1/2表达水平，逆转磷酸化DARPP-32（THr75）表达的进一步下降，逆转了GRK6和β-arrestin1表达量的降低，起到了治疗异动症的作用，可以作为PD运动并发症治疗的有效辅助药物。
[0092] 本发明的中药组合物，其配伍符合中药“君臣佐使”原则，药味数较少，具有疗效高、无毒副作用、价格低等优点，采用治疗原则是益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，从病原根本入手，对症下药，以达到治疗的效果；制备方法简单，成本低，对环境友好，适于长期服用，是一种安全有效的治疗帕金森病运动并发症的中药组合物，具有良好的应用前景。
[0093] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。