一种蟾蜍噻咛的提取方法

摘要

本发明公开了一种提取蟾蜍噻咛的方法，具体包括如下步骤：取干蟾皮洗净，加水5～8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。水提物上大孔树脂柱，用水洗脱，之后用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱：乙醇、甲醇和丙酮，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，经硅胶柱层析、ODS柱层析分离，合并蟾蜍噻咛流份，结晶，得蟾蜍噻咛纯品。本发明所得蟾蜍噻咛纯度和收率较高，且工艺简单，易于大量生产。

权利要求

1.一种蟾蜍噻咛的提取方法，其中所述蟾蜍噻咛的分子式：C12H14N2O4S，分子量：

282.07，所述蟾蜍噻咛的结构式如下：

所述蟾蜍噻咛采用如下的提取方法获得：

（1）取干蟾皮洗净，加水5～8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至85±5℃下相对密度为1.1～1.2，冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏；

（2）将所得的粗提物上大孔树脂柱，用水洗脱，之后用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱：乙醇、甲醇和丙酮，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，经硅胶柱层析、ODS柱层析分离，合并蟾蜍噻咛流份，结晶，得蟾蜍噻咛纯品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的蟾皮原料为中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的大孔树脂为下述类型的大孔树脂：SP207、SP825、HP-20、HP-2MG、XAD1600、D-101、AB-8、MCI或HPD。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的大孔树脂的径长比为1:5～1:50；大孔树脂的用量为上样量的30～130倍。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将粗提物上大孔树脂柱的上样方法为湿法上样，以0.1～5倍柱体积/小时的流速上样进柱，上样温度为10～60℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用水洗脱时，水的用量为1～8倍柱体积，用水洗脱的流速为1～5倍柱体积/小时，梯度洗脱的温度为10～60℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的梯度洗脱的洗脱梯度在体积比0%有机溶剂和体积比为100%有机溶剂的浓度范围内选择，每个梯度的洗脱液的用量为5～20柱体积，洗脱的流速为1～5倍柱体积/小时，梯度洗脱的温度为10～60℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述的大孔树脂为SP825大孔树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依次为5%乙醇水溶液，40%乙醇水溶液，纯乙醇，收集40%乙醇水溶液的洗脱部分；

或者，所述的大孔树脂为D101型大孔树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依次为5%丙酮水溶液，40%丙酮水溶液，纯丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脱部分；

或者，所述大孔树脂为HP-20大孔树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依次为20%甲醇水溶液，40%甲醇水溶液，纯甲醇，收集20%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脱部分；

或者所述大孔树脂为SP207大孔树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依次为10%甲醇水溶液，50%甲醇水溶液，纯甲醇，收集10%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部分50%甲醇水溶液的洗脱部分；

百分比为体积百分比。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述硅胶柱层析为，所得大孔树脂洗脱液经硅胶柱层析，收集以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ODS柱层析分离为，所得硅胶柱层析洗脱液经ODS柱层析，依次用纯水，5%～10%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集

5%～10%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

说明书

一种蟾蜍噻咛的提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提取方法，具体涉及一种蟾蜍噻咛的提取方法。

背景技术

[0002] 蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo garfgarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufomelanostictus Schneider的干燥全皮。干蟾皮具有清热解毒、消肿止痛、活血化瘀、软坚散结的作用，主要含有蟾毒灵(buffalin)、脂蟾毒配基(resibufogenin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)等内酯类成分，蟾蜍色胺(bufotenldine)、5-羟色胺(serotonine)、蟾蜍噻咛(bufothionine) 、去氢蟾蜍色氨氢溴酸(dehydrobufoteinine hydrobromide) 等水溶性蟾毒色胺类成分，蟾蜍环酰胺B、蟾蜍环酰胺C、蟾蜍环酰胺D等其他胺类成分，胆甾醇、7α-羟基胆甾醇、7β-羟基胆甾醇、β-谷甾醇、麦角甾醇及菜油甾醇等甾族化合物、以及氨基酸、有机酸、肾上腺素、吗啡、多肽及多糖等其他成份。目前，以蟾皮水溶性成分为主开发的制剂主要有华蟾素注射液、华蟾素片剂、华蟾素口服液等。

[0003] 这些制剂在提取分离纯化的过程中，许多内酯类成分都被除去了，而含量较高的蟾蜍噻咛可能是华蟾素起作用的主要成分。以往华蟾素仅仅对总生物碱进行含量控制，而大量蟾蜍噻咛并没有进行有效控制。采用高效液相色谱法测定蟾蜍噻咛的含量，作为华蟾素的成分控制指标，不失为一种较好的方法。由于采用高效液相色谱法测定蟾蜍噻咛的含量需要用蟾蜍噻咛作为对照，因此如何提取蟾蜍噻咛单体并达到含量测定对照品的要求已成为关键。在干蟾皮药材中，蟾蜍噻咛的得率是较高的，大约20kg药材中可以提取500mg，远远超过蟾蜍环酰胺B(10 mg)、蟾蜍环酰胺C(6mg)、去氢蟾蜍色氨氢溴酸盐((20 mg)等其他成份。我们进行了相关文献检索发现，从蟾皮中提取分离蟾蜍噻咛单体的方法尚未进行报道，本发明提供了一种蟾蜍噻咛单体的提取分离方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种从蟾皮中提取蟾蜍噻咛的方法，该方法产品纯度和收率较高，工艺成熟，成本低，易于大量提取蟾蜍噻咛。

[0005] 本发明提供的所述蟾蜍噻咛分子式：C12H14N2O4S，分子量：282.07，所述蟾蜍噻咛结构式如下：

[0006] [0007] 所述蟾蜍噻咛采用如下提取方法获得：

[0008] 取干蟾皮洗净，加水5～8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。粗提物用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行大孔树脂梯度洗脱：乙醇、甲醇和丙酮，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，经硅胶柱层析、ODS柱层析分离，合并蟾蜍噻咛流份，结晶，得蟾蜍噻咛纯品。

[0009] （1） 水提醇沉

[0010] 取干蟾皮10kg，洗净，加水8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0011] （2）大孔树脂柱层析

[0012] 本发明中，所述的大孔树脂可为极性或非极性大孔树脂。经大量试验摸索，本发明特别优选下述类型的大孔树脂：SP207、SP825、HP-20、HP-2MG、XAD1600、D-101、AB-8、MCI或HPD。采用上述优选的大孔树脂，产品纯度和收率可得到尤为显著的提高。层析柱的径长比较佳为1:5～1:50。优选层析柱规格为φ50×500mm或φ70×1000mm。大孔树脂的用量较佳的为上样量的30～120倍。

[0013] 步骤（1）结束后，将所得的粗提取上大孔树脂柱。上样方法可为常规的湿法上样或干法上样，优选湿法上样。采用湿法上样时，优选以0.1～5倍体积/小时的流速上样进柱。上样温度优先10～60℃。

[0014] 上样后，用水作洗脱剂进行洗脱，水的用量较佳的为1～8倍柱体积，用水洗脱的流速较佳的为1～5倍柱体积/小时，用水洗脱的温度较佳的为10～60℃。

[0015] 之后用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱：乙醇、甲醇和丙酮。根据所选用的大孔树脂的极性，在体积比0%有机溶剂（即纯水）和体积比为100%有机溶剂的浓度范围内选择洗脱梯度。每个梯度的洗脱液的用量较佳的为5～20倍柱体积。洗脱的流速较佳的为1～5倍柱体积/小时。选择不同的洗脱剂和洗脱梯度时，收集的洗脱梯度范围有所不同，以收集用体积比为80：20：2.5的氯仿、甲醇、和水的混合液为展开剂，硅胶薄层层析板（TLC）上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分为准。梯度洗脱的温度较佳的为10～60℃。

[0016] 本发明一较佳实例中，选择D101大孔树脂，洗脱梯度依次为5%乙醇水溶液，40%乙醇水溶液，纯乙醇，收集40%乙醇水溶液的洗脱部分；

[0017] 本发明另一较佳实例中，选择AB-8型大孔树脂，洗脱梯度依次为5%丙酮水溶液，40%丙酮水溶液，纯丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脱部分；

[0018] 本发明另一较佳实例中，选择HP-20大孔树脂，洗脱梯度依次为20%甲醇水溶液，40%甲醇水溶液，纯甲醇，收集20%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脱部分；

[0019] 本发明另一较佳实例中，选择SP207大孔树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依次为10%甲醇水溶液，50%甲醇水溶液，纯甲醇，收集10%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部分50%甲醇水溶液的洗脱部分；

[0020] 上述较佳实例中，百分比为体积百分比。

[0021] （3）硅胶柱层析

[0022] 经（2）大孔树脂柱层析后，浓缩液要进行硅胶柱层析，以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集体积比为4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液静止分层的上层溶液为展开剂，胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

[0023] （4）ODS柱层析

[0024] 经（3）硅胶柱层析后，浓缩液要进行ODS柱层析，依次用纯水，5%～10%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集5%～10%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

[0025] 实施例1

[0026] 1）取干蟾皮10kg，洗净，加水8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0027] 2）层析柱尺寸为φ50×500mm，内部装填SP207大孔树脂（上样量120倍）。下述操作中，温度控制在45℃。将水提液以0.5倍床层体积/小时的流速通入层析柱中。进料完成后先用5倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速1倍床层体积/小时，然后分别用10%、50%的甲醇水溶液和纯甲醇依次梯度洗脱，每个梯度用量为8倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集收集10%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部分50%甲醇水溶液的洗脱部分。

[0028] 3）所得大孔树脂洗脱液经硅胶柱层析，以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集体积比为4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液静止分层的上层溶液为展开剂，胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

[0029] 4）所得硅胶柱层析洗脱液经ODS柱层析，依次用纯水，10%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集10%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

[0030] 实施例2

[0031] 1）取干蟾皮10kg，洗净，加水8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0032] 2）层析柱尺寸为φ70×1000mm，内部装填SP825大孔树脂（上样量50倍）。下述操作中，温度控制在25℃。将水提液以0.1倍床层体积/小时的流速通入层析柱中。进料完成后先用5倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速2倍床层体积/小时，然后分别用5%、40%的乙醇水溶液和纯乙醇依次梯度洗脱，每个梯度用量为5倍柱体积，流速为2倍床层体积/小时。收集40%乙醇水溶液的洗脱部分。

[0033] 3）所得大孔树脂洗脱液经硅胶柱层析，以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集体积比为4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液静止分层的上层溶液为展开剂，胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

[0034] 4）所得硅胶柱层析洗脱液经ODS柱层析，依次用纯水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集5%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

[0035] 实施例3

[0036] 1）取干蟾皮10kg，洗净，加水8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0037] 2）层析柱尺寸为φ50×500mm，内部装填HP-20大孔树脂（上样量100倍）。下述操作中，温度控制在25℃。将水提液以0.5倍床层体积/小时的流速通入层析柱中。进料完成后先用8倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速1倍床层体积/小时，然后分别用20%、40%的甲醇水溶液和纯甲醇依次梯度洗脱，每个梯度用量为10倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集收集20%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脱部分。

[0038] 3）所得大孔树脂洗脱液经硅胶柱层析，以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集体积比为4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液静止分层的上层溶液为展开剂，胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

[0039] 4）所得硅胶柱层析洗脱液经ODS柱层析，依次用纯水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集5%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

[0040] 实施例4

[0041] 1）取干蟾皮10kg，洗净，加水8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0042] 2）层析柱尺寸为φ70×1000mm，内部装填HP-2MG大孔树脂（上样量60倍）。下述操作中，温度控制在25℃。将水提液以5倍床层体积/小时的流速通入层析柱中。进料完成后先用8倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速1倍床层体积/小时，然后分别用20%、40%的甲醇水溶液和纯甲醇依次梯度洗脱，每个梯度用量为10倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集收集20%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脱部分。

[0043] 3）所得大孔树脂洗脱液经硅胶柱层析，以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集体积比为4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液静止分层的上层溶液为展开剂，胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

[0044] 4）所得硅胶柱层析洗脱液经ODS柱层析，依次用纯水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集5%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

[0045] 实施例5

[0046] 1）取干蟾皮10kg，洗净，加水8倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0047] 2）层析柱尺寸为φ50×500mm，内部装填XAD1600大孔树脂（上样量80倍）。下述操作中，温度控制在25℃。将水提液以2倍床层体积/小时的流速通入层析柱中。进料完成后先用8倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速4倍床层体积/小时，然后分别用15%、35%的乙醇水溶液和55%乙醇依次梯度洗脱，每个梯度用量为20倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集35%乙醇水溶液的洗脱部分。

[0048] 3）所得大孔树脂洗脱液经硅胶柱层析，以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集体积比为4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液静止分层的上层溶液为展开剂，胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

[0049] 4）所得硅胶柱层析洗脱液经ODS柱层析，依次用纯水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集5%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

[0050] 实施例6

[0051] 1） 取干蟾皮10kg，洗净，加水5倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0052] 2） 层析柱尺寸为φ50×500mm，内部装填D101大孔树脂（上样量50倍）。下述操作中，温度控制在30℃。将水提液以0.5倍床层体积/小时的流速通入层析柱中。进料完成后先用4倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速2倍床层体积/小时，然后分别用5%、40%的乙醇水溶液和纯乙醇依次梯度洗脱，每个梯度用量为5倍柱体积，流速为2倍床层体积/小时。收集40%乙醇水溶液的洗脱部分。

[0053] 3） 所得大孔树脂洗脱液经硅胶柱层析，以体积比为80:20:2.5的氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集体积比为4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液静止分层的上层溶液为展开剂，胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分。

[0054] 所得硅胶柱层析洗脱液经ODS柱层析，依次用纯水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脱，收集5%乙腈水溶液洗脱部分，结晶，得到蟾蜍噻咛纯品。

[0055] 实施例7

[0056] 1）取干蟾皮10kg，洗净，加水6倍，煎煮二次，第一次45分钟，第二次30分钟，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（85±5℃），冷却至40℃，加乙醇使含醇量达60%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，加乙醇使含醇量达85%，搅匀，静置48小时，滤过，回收乙醇至稠膏。

[0057] 2）层析柱尺寸为φ50×500mm，内部装填AB-8大孔树脂（上样量80倍）。下述操作中，温度控制在30℃。将水提液以0.3倍床层体积/小时的流速通入层析柱中。进料完成后先用6倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速5倍床层体积/小时，然后分别用5%、40%