一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法

摘要

本发明公开了一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，其包括以下步骤：将金福菇烘至恒重，粉碎，过筛；然后将所得粉末热水浸提，提取液旋转蒸发浓缩，离心取上清液；最后将所得上清液浓缩，醇沉，离心，取沉淀物，冷冻干燥，得金福菇粗多糖。提取获得的金福菇多糖是抗氧化活性较高的天然产物，对邻苯三酚自氧化体系产生的•O2-有明显的清除作用，特别是组分TL-3，当浓度为500μg/mL时，清除率可达到75.6%，仅比Vc低15.4个点，可作为天然无毒抗氧化剂，应用于食品、医药和化妆品等领域。

权利要求

1.一种天然抗氧化剂金福菇多糖TL-3的制备方法，其特征在于包括以下步骤： （1）将样品金福菇烘至恒重，粉碎，过0.55mm筛；

（2）称取步骤（1）所得粉末，在80-90℃温度的热水中浸提2-4h，料液比1:10-40，提取液浓缩后，3300-3800r/min离心18-22min，取上清液；

（3）将步骤（2）所得上清液浓缩至原体积的1/9-1/10，然后加入3.8-4.2倍体积的无水乙醇沉淀过夜，3300-3800r/min离心18-22min，收集沉淀物，冷冻干燥，得金福菇粗多糖；

（4）将步骤（3）所得金福菇粗多糖加入到18-22倍质量的蒸馏水溶解，按体积比1:1加入Sevag试剂，剧烈震荡25-35min，3300-3800r/min离心18-22min，取上清液，浓缩、冷冻干燥得固体金福菇多糖；

（5）将步骤（4）所得固体金福菇多糖配成10%的溶液，用DEAE-Sephorase F.F凝胶柱纯化，上样量为10ml，0—1mol/LNaCl溶液梯度洗脱，流速为1ml/min，自动部分收集器收集3

洗脱液，苯酚—硫酸法跟踪检测，经3.5×10Da的透析袋透析后，浓缩、冷冻干燥得到纯化的金福菇多糖TL-1；

（6）将步骤（5）所得固体金福菇多糖配成0.1%的溶液，过0.22um的过滤膜，用Superdex 200层析柱分离，0.02mol/L PBS洗脱，流速1ml/min，波长215nm紫外检测，同时3

用苯酚-硫酸跟踪检测，收集的含糖组分用3.5×10Da的透析袋透析脱盐，透析液浓缩、冷冻干燥得两个金福菇多糖组分TL-2和TL-3；HPLC法测定其金福菇多糖TL-3分子量为3

4.22×10Da；经HPLC测定其单糖组成及摩尔比为阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=15.1﹕2.3﹕3.7﹕1.8。

2.根据权利要求1所述的天然抗氧化剂金福菇多糖TL-3的制备方法，其特征在于：金福菇纯多糖TL-3对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基有清除作用，当浓度为

500μg/mL时，清除率为75.6%；金福菇多糖TL-3对小鼠红细胞溶血MEH和丙二醛MDA的产生也有抑制作用。

说明书

一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，属于食品加工领域。

背景技术

[0002] 真菌因其营养和药用价值一直备受关注，目前已有多种具有药理作用的化合物从真菌中分离出来(如香菇多糖)。多糖在机体免疫调节、增强细胞抗肿瘤、抗氧化活性等方面具有重要的生物活性。大量研究证明，真菌多糖大多具有抗氧化活性，如：木耳多糖(Mau，2001)，冬虫夏草多糖(S.P.Li，2006)，灵芝多糖(Jing Xu，2009)等。真菌多糖的研究与应用已渗入到医药、食品、化妆品和饲料等多种领域，多糖研究已成为目前生命科学中最活跃的研究热点之一。

[0003] 金福菇(Tricholoma lobayense Heim.)又名大白口蘑，属担子菌亚门层菌纲伞菌属口蘑科(白蘑科)，是一种发生于炎热季节的高温型正处于开发中的珍稀食用菌。金福菇在国内商品名称有洛巴伊口磨、洛巴口磨、大口磨等，法国真菌学家Heim最早发现于非洲，并于1970年定名。其子实体肥厚嫩白，味微甜、脆嫩而鲜美，耐贮性好，适于鲜销和干制加工，深受市场青睐，具有较好的开发价值。

[0004] 目前这种食用菌在台湾售价不菲；日本近年也开始批量试种并投入市场，其商品名为白色松茸，金福菇子实体硕大，菌肉肥厚嫩白。有关专家指出，近年内金福菇将会发展成我国食用菌的主导产品。国外专家也认为：“在热带、亚热带国家，金福菇的商业性栽培有光明的前景”。

[0005] 金福菇营养丰富，据分析每公斤干品中含蛋白质27.56％、总糖38.44％、粗脂肪9.58％、粗纤维8.20％。F.Liu(Gen.Pharmac.1996)通过体内外抑瘤实验表明金福菇糖蛋白具有免疫调节及抗肿瘤活性；H.X.Wang(Comp.Biochem.Physiol.Part B.2000)阐述了金福菇提取物30kDa蛋白具有抑制体外翻译的活性；而有关金福菇多糖抗氧化活性的研究尚未见有文献报道。本发明是从金福菇中提取得到了几种天然多糖组分，对其进行抗氧化活性研究发现：其中一个金福菇天然多糖组分TL-3具有很高的抗氧化活性，对超氧阴离子的清除能力与Vc几乎在同一个水平，具有重要的学术价值和广阔的商业化应用前景。

发明内容

[0006] 本发明目的在于提供了一种天然抗氧化剂金福菇多糖的提取方法，并对其抗氧化活性进行检测，发现一个抗氧化活性高的金福菇多糖组分，可作为一种天然的抗氧化剂，广3
泛应用于食品、医药和化妆品等领域。经HPLC检测，其分子量为4.22×10Da，单糖组成及摩尔比为阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝15.1∶2.3∶3.7∶1.8。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

[0009] (1)将金福菇烘至恒重，粉碎，过0.55mm筛；

[0010] (2)称取步骤(1)所得粉末，在80-90℃温度的热水中浸提2-4h，料液比1∶10-40，提取液浓缩后，3300-3800r/min离心18-22min，取上清液；

[0011] (3)将步骤(2)所得上清液浓缩至原体积的1/9-1/10，加入3.8-4.2倍体积的无水乙醇沉淀过夜，3300-3800r/min离心18-22min，收集沉淀物，冷冻干燥，得金福菇粗多糖；

[0012] (4)将步骤(3)所得金福菇粗多糖加入到18-22倍质量的蒸馏水溶解，按体积比1∶1加入Sevag试剂，剧烈振荡25-35min，3300-3800r/min离心18-22min，取上清液，浓缩、冷冻干燥得固体金福菇多糖；

[0013] 抗氧化活性检测：

[0014] a：将步骤(4)所得多糖配成10％溶液，用DEAE-Sephorase F.F凝胶柱纯化，上样量为10mL，0-1mol/LNaCl溶液梯度洗脱，流速为1mL/min，自动部份收集器收集洗脱液，苯3
酚-硫酸法跟踪检测，经3.5×10Da的透析袋透析后，浓缩、冷冻干燥得到纯化的金福菇多糖(TL-1)；

[0015] b：将步骤a所得多糖配成0.1％的溶液，过0.22μm的过滤膜，用Superdex200层析柱分离，0.02mol/L PBS(pH7.2，含0.15mol/L NaCl)洗脱，流速1mL/min，波长215nm紫外3
检测，同时用苯酚-硫酸跟踪检测；收集的含糖组分用3.5×10Da的透析袋透析脱盐，透析液浓缩、冷冻干燥得两个金福菇多糖组分(TL-2和TL-3)；

[0016] c：对得到的多糖(TL-1、TL-2和TL-3)进行体外抗氧化活性实验，结果表明：提取-得到的金福菇多糖，尤其是TL-3，具有很高的清除超氧阴离子自由基(·O2)及抑制小鼠红细胞溶血(MEH)和丙二醛(MDA)的产生的活性。

[0017] 经HPLC检测，TL-3的分子量为4.22×103Da，单糖组成及摩尔比为阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝15.1∶2.3∶3.7∶1.8。色谱图见图1和图2。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 提取获得的金福菇多糖是抗氧化活性较高的天然产物，对邻苯三酚自氧化体系产-生的·O2 有明显的清除作用，特别是组分TL-3，当浓度为500μg/mL时，清除率能够达到
75.6％，仅比Vc低15.4个点；可以作为天然无毒抗氧化剂，TL-3在食品、医药和化妆品中有广阔的应用前景。

[0020] 目前我们所查阅资料中未发现高于此抗氧化活性的天然多糖，王普等专利(CN -101353382A)中，虫草多糖浓度达到10mg/mL时对·O2 的清除率仅为64％；JingXu等-
(Carbohydr.Polym.2009)一文中，灵芝多糖浓度达到10mg/mL时对·O2 的清除率仅为
56％。

附图说明

[0021] 图1TL-3分子量测定HPLC色谱图。

[0022] 图2标准单糖和TL-3水解物的HPLC色谱图(1.Rha 2.Xyl 3.Ara 4.Fru5.Man6.Glc 7.Gal 8.Suc 9.Raffinose)。

[0023] 图3金福菇多糖分子筛层析苯酚-硫酸法跟踪检测图谱。

[0024] 图4TL-1、TL-2和TL-3对·O2-的清除作用。

[0025] 图5TL-1、TL-2和TL-3对H2O2诱导的MEH和MAD产生的影响，1.TL-3(MEH)2.TL-3(MDA)3.TL-1(MEH)4.TL-1(MDA)5.TL-2(MEH)6.TL-2(MDA)。

具体实施方式

[0026] 实施例1：以提取率为参考的粗多糖提取工艺的确定

[0027] 根据预试验结果，选取料液比、提取时间、提取温度三个对多糖提取率影响显著的因素，并在单因素试验基础上，通过三因素三水平的响应面分析方法分析出最佳的响应值，试验设计、分析方案及得率结果如表1和表2。

[0028] 表1响应面分析因素与水平表

[0029]

[0030]

[0031] 表2响应面分析方案及得率结果

[0032]

[0033] *：(多糖干品质量/原料质量)×100％。

[0034] 各因素经回归拟合后，解得回归方程为：

[0035] Y＝12.92+0.2625A+0.3625B+0.625+0.075AB+0.55AC-0.05BC-1.2975A2-1.3475B2 2
-1.2225C，式中Y为多糖提取率(％)，A为提取时间(h)，B为料液比(g/mL)，C为提取温度(℃)。

[0036] 根据design expert7.0通过ANOVA分析得到响应值最大时A、B、C对应的编码值分别为A＝0.89、B＝0.15、C＝0.45，对应的金福菇多糖最佳提取条件为：提取温度83℃，料液比1∶35，提取时间2.5h，理论提取率为12.404％。用此优化方案经三次重复试验所得实际平均提取率为12.294％，与理论值基本吻合，表明此方案对金福菇多糖提取条件的优化是可行的。

[0037] 实施例2：金福菇多糖的制备

[0038] 将500g金福菇子实体在46℃恒温烘24小时，再于52℃恒温烘24小时，重为75g，继续于37℃下烘至恒重63g，粉碎，过0.55mm筛。

[0039] 称取20g金福菇粉末，热水浸提(温度83℃，料液比1∶35，时间2.5h)，旋转蒸发仪浓缩提取液后，3500r/min离心20min，取上清液，浓缩至原体积的1/10后，加入4倍体积的无水乙醇沉淀，放置过夜，3500r/min离心20min，收集沉淀物，冷冻干燥，得到2.451g浅褐色金福菇粗多糖，提取率为12.25％。

[0040] 称取0.5g粗多糖，用10mL的蒸馏水溶解，按体积比1∶1加入Sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1，v/v)，室温下剧烈振荡30min，3500r/min离心20min，收集上层液浓缩、冷冻干燥得固体金福菇多糖。

[0041] 将上述金福菇多糖配成10％(w/w)溶液，进行阴离子交换柱层析，凝胶柱为DEAE-Sephorase F.F(2.6cm×50cm)，上样量为10mL，0-1mol/LNaCl溶液梯度洗脱，流速为1mL/min，自动部份收集器收集洗脱液，每管收集，苯酚-硫酸法跟踪检测，将多糖组分合并
3
收集。将多糖溶液装入3.5×10Da的透析袋，自来水流水透析24h，除去小分子杂质，将透析袋溶液减压浓缩、冷冻干燥得到纯化的金福菇多糖(TL-1)。

[0042] 取5mg纯化的金福菇多糖溶于5mL超纯水中，过0.22μm的过滤膜，用HiLoad TM16/60(1.6cm×60cm)Superdex 200 Prep grade(Amersham)层 析 柱 分 离，0.02mol/L PBS(pH7.2，含0.15mol/L NaCl)洗脱，流速1mL/min，波长215nm紫外检测，同时用苯酚-硫酸跟踪检测，以试管数为横坐标，以吸光度为纵坐标，作Superdex 200色谱柱洗脱曲线图。
3
分部收集含糖主峰部分，出现两个峰，见图3。收集的含糖组分分别装入3.5×10Da的透析袋，自来水流水透析脱盐24h，透析液浓缩、冷冻干燥得两个金福菇多糖组分(TL-2和TL-3)。

[0043] 实施例3：体外抗氧化活性测定：

[0044] 1、邻苯三酚自氧化作用的抑制测定

[0045] 取0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2)4mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入不同浓度(50、100、200、400、500μg/mL)的金福菇多糖组分1mL，将上述混合溶液预热到25℃，测前加0.3ml的25℃预热好的45mmol/L邻苯三酚溶液，迅速混匀，吸光度的测定设在
420nm处，对于空白对照组的处理，采用相同体积的蒸馏水代替样品。阳性对照为相同浓度的Vc水溶液。默认为第1分钟的吸光值，在4min内每隔1min读一次吸光值，记录的不同浓度样品不同时间内的吸光值。金福菇多糖的抑制率公式：Y＝(Fo-Fx)/Fo。其中Y是清除率，Fo和Fx分别是空白液和样品被测液随时间变化吸光度变化率。结果见图4。

[0046] 2、小鼠红细胞溶血(MEH)和丙二醛(MDA)产生抑制率的测定小鼠股动脉取血，加入一定量的肝素钠抗凝血，2000r/min离心，去上清获得红细胞，生理盐水离心洗涤两次后，根据红细胞的体积稀释成0.5％红细胞悬浮液，将红细胞悬浮液与不同浓度多糖溶液按照体积比3∶1进行混合，再加入一定量的H202于37℃孵育1h，孵育后在3000r/min转速下离心10min取上清液，其中，基础对照组不加TL-1、TL-2和TL-3，不加H202，用生理盐水补到4.2mL；空白对照组不加TL-1、TL-2和TL-3，加0.2mL 1mol/L H202，用生理盐水补到4.2mL。于540nm处读出吸光度值。按试剂盒说明书的测定方法测定其MDA含量，计算混合溶液的溶血抑制率和丙二醛抑制率。根据公式如下：MEH抑制率(％)＝(A空白-A样品)/(A空白-A基础)×100；MDA抑制率(％)＝(X空白-X样品)/(X空白-X基础)×100，结果见图5。