降解原油的微生物和用组合的微生物降解原油的方法

摘要

本发明涉及降解原油的微生物和用组合的微生物降解原油的方法。具体地，本发明公开了用于降解原油的假单胞菌和芽孢杆菌，以及用它们的组合来降解原油，将原油的重组分降解为轻组分的方法。该方法包括用上述两种微生物组合后用加入原油中进行降解。

权利要求

1.保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SWS-0603。

2.用组合的微生物来降解原油的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3608的枯草芽孢杆菌SWS-0501组合加入原油中进行降解。

3.根据权利要求2所述的方法，其中加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3608的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是1:2－2:1。

4.根据权利要求2所述的方法，其中加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3608的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是1:2。

5.根据权利要求2所述的方法，其中加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3608的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是1:1。

6.根据权利要求2所述的方法，其中加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3608的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是2:1。

7.根据权利要求2－6的任一项所述的方法，其特征在于原油是在以下条件下降解的：摇床培养，30℃，180rpm，降解时间为4天。

8.保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3608的枯草芽孢杆菌SWS-0501的组合物在降解原油中的用途。

说明书

降解原油的微生物和用组合的微生物降解原油的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及降解原油的微生物和用组合的微生物降解原油的方法。具体地，涉及用假单胞菌和芽孢杆菌的组合来降解原油，将原油的重组分降解为轻组分。

背景技术

[0002] 原油是非常重要的资源，目前原油已成为影响各国经济发展建设的一重大因素。如何更有效地、更科学地、更切合实际地利用好目前现有的原油能源，已成为各国科学研究竞相解决的热门课题。

[0003] 原油是一个多组分的复杂混合物，其沸点范围很宽，从-161.5℃(甲烷)一直到800℃以上。所以，无论是对原油进行研究或进行加工利用，都必须对原油进行分馏。分馏就是按照组分沸点的差别将原油“切割”成若干“馏分”。原油的馏分主要有汽油、煤油、柴油、润滑油、渣油等。在加工分馏的过程中各国都十分重视提高轻质馏分油的收率，因此采用了物理、化学等不同的方式对原油进行处理，以提高收率。最常用的方法除常减压蒸馏外，还有催化裂化、加氢裂化、延迟焦化、催化重整、烷基化和调合。提高组分中轻组分含量、减少重组分含量，是提高石油利用率的关键。

[0004] 近年来，随着现代生物技术的发展，科学家利用现代生物修复技术对石油对环境的污染进行了深入的研究。大量的研究结果证明：自然界中存在能降解石油烃的微生物，能将原油部分分解，将重组分降解为较轻的组分，甚至降解为二氧化碳和水。但此项技术目前主要应用于治理原油污染，解决因原油污染而造成的环境问题和微生物强化采油技术，如海洋原油泄露、土壤原油污染和三次采油等。

发明内容

[0005] 本发明是利用微生物对原油的降解作用，将不同种的微生物进行组合来处理原油，将原油中的重组分部分降解成较轻的组分，部分芳香烃开环转化为直链烃。将此技术应用于原油的加工，可提高轻组分油的产出率，从而提高现有原油产品的经济效益。

[0006] 本发明将原油经过复合微生物降解后，进入蒸馏塔进行蒸馏，可以获得更多的短链烃，即轻组分馏分变多，而重组分馏分变少，使轻组分油的产出率提高，重组分油的产出率降低。将本发明应用于现代石油化工中，具有非常好的应用前景和经济效益。

[0007] 本发明的一方面涉及保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SWS-0603。

[0008] 本发明的另一方面涉及保藏号为CGMCC No.3608的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SWS-0501。

[0009] 本发明的另一方面涉及用组合的微生物来降解原油的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3608的短小芽孢杆菌SWS-0501组合加入原油中进行降解。

[0010] 在一个具体实施方案中，加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3607的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是1∶2-2∶1。

[0011] 在一个具体实施方案中，加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3607的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是1∶2。

[0012] 在另一个具体实施方案中，加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3607的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是1∶1。

[0013] 在另一个具体实施方案中，加入的保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3607的短小芽孢杆菌SWS-0501的比例是2∶1。

[0014] 在一个具体实施方案中，原油是在以下条件下降解的：摇床培养，30℃，180rpm，降解时间为4天。

[0015] 此外，本发明还涉及保藏号为CGMCC No.3607的铜绿假单胞菌SWS-0603和保藏号为CGMCC No.3607的枯草芽孢杆菌SWS-0501的组合在降解原油中的用途。

附图说明

[0016] 图1原油气相色谱图。

[0017] 图2复合微生物降解后原油的气相色谱图(菌A∶菌B为2∶1)。

[0018] 图3复合微生物降解后原油的气相色谱图(菌A∶菌B为1∶1)。

[0019] 图4复合微生物降解后原油的气相色谱图(菌A∶菌B为1∶2)。

具体实施方式

[0020] 获得降解原油的微生物的方法和降解原油的基本方法概述如下：

[0021] 1、原油降解菌筛选

[0022] 对取自扬子石化炼油厂的原油污泥和含油污泥浸泡搅拌预处理，吸取上清液作为分离目的菌株的菌悬液。将菌悬液在原油平板上涂布培养96小时，挑取菌落到牛肉膏蛋白胨基础培养基上纯化，将分离到的菌株在原油平板培养基复筛，能继续生长的菌株为能利用并降解原油的目的菌株。共筛选到原油降解菌78株，保种。

[0023] 2、原油降解

[0024] 选取筛选的两株微生物作为降解原油配伍菌。菌株A：铜绿假单胞菌SWS-0603；菌株B：芽孢杆菌SWS-0501。将菌株A和菌株B接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，分别培养，培养条件为：30℃，180rpm，48小时。将菌液分装于40mL离心管中，8000rpm离心，除去上清液，将菌体转移到50mL原油液体培养基中，降解条件为30℃，180rpm，降解时间为4天。

[0025] 3、气相色谱分析

[0026] 将降解后的发酵液以8000rpm的速度离心，除去菌体，上清液采用二氯甲烷萃取四次，0.22μm膜过滤，蒸发溶剂后，采用GC进行分析，并加入外标进行定性，积分定量。

[0027] 具体实验方法和结果见下述实施例。

[0028] 实施例一：

[0029] 1、原油降解菌的筛选

[0030] 取自扬子石化炼油厂的原油罐底部沉积的污泥2～3克，置于250mL烧杯中，加入蒸馏水150mL，置于磁力搅拌器上，温度为室温20～30℃，搅拌速度180rpm，搅拌处理2.5～3小时，然后用无菌双层纱布过滤，除去上层漂浮物和下层沉淀物，上清液作为分离目的菌株的菌悬液，并将其置于无菌三角瓶中备用。整个操作过程在无菌操作台上完成。分别取1mL菌悬液在原油(扬子石化鲁宁管原油)平板涂布培养96小时，挑取菌落到牛肉膏-1
蛋白胨固体培养基(配方(L )：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g)上纯化三次，将纯化后的菌株在原油平板复筛，30℃，培养72小时，能继续生长的菌株为能利用并降解原油的目的菌株。共筛选到原油降解菌78株，鉴定后保种备用。

[0031] 原油筛选和复筛时原油平板的组成如下：在离子培养基中加入原油0.5％(w/v)，琼脂4％(w/v)。

[0032] 离子培养基组成为：NaNO3 1g，KH2PO4 2g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl 0.1g，CaCl2 0.01g，FeSO4 0.01g，微量元素液0.025mL。微量元素液组成：硼酸0.25g，五水硫酸铜0.25g，硫酸锰0.5g，钼酸钠0.05g，硫酸锌0.7g，水1000mL。

[0033] 2、原油降解

[0034] 选取筛选的两株微生物，分别标为SWS-0603和SWS-0501。其生理生化实验结果如下

[0035]

[0036] 注：+表示阳性；-表示阴性；——表示未测定。

[0037] 显微镜形态学观察

[0038] 菌株0501为革兰氏阳性，显微镜观察菌株为短杆状、有芽孢，菌落呈土黄色、表面干燥、有褶皱；

[0039] 菌株0603为革兰氏阴性，显微镜观察菌株为短杆状，菌落光滑，产铜绿色素；

[0040] 根据上述结果，SWS-0603命名为铜绿假单胞菌SWS-0603(下文称作菌株A)；SWS-0501命名为短小芽孢杆菌SWS-0501(下文称作菌株B)。将所述菌株A，即铜绿假单胞菌SWS-0603，于2010年1月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路3号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码
100101)，保藏号为CGMCC No.3607。将所述菌株B，即短小芽孢杆菌SWS-0501，于2010年1月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路3号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.3608。

[0041] 将菌株A和菌株B(接种量均为接种环3环)分别接种于60mL牛肉膏蛋白胨液体培养基(其配方(L-1)：牛肉膏5g；蛋白胨10g；NaCl5g)中扩增培养，摇床培养条件为：30℃，180rpm，48小时。将培养得到的菌液分装于40mL无菌离心管中，8000rpm离心，除去上清液，无菌操作，将菌体转移到50mL原油液体培养基中(菌株A与菌株B按照2∶1的比例加入)，降解条件为：摇床培养、30℃、180rpm，降解时间为4天。

[0042] 原油液体培养基组成为(L-1)：原油10g，NaNO31g，KH2PO42g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.1g，CaCl20.01g，FeSO40.01g，微量元素液0.025mL。微量元素液组成：硼酸0.25g，五水硫酸铜0.25g，硫酸锰0.5g，钼酸钠0.05g，硫酸锌0.7g，水1000mL。

[0043] 3、GC分析

[0044] 将降解后的发酵液以8000rpm的速度离心，除去菌体。上清液及其残留油采用二氯甲烷萃取四次，总萃取剂加入量20mL。经0.22μm膜过滤，蒸发溶剂后，采用GC进行分析，以原油中的植烷(2，6，10，14-四甲基十六烷)为内标，积分定量。GC测试前采用60μl二氯甲烷溶解。GC分析条件为：检测器：FID；柱类型：SE-30；灵敏度：2；柱规格：0.25μm×30m；氢气：0.14MPa；载气类型：N2；空气：0.14MPa；进样器温度：320℃；检测器温度：320℃；进样量：0.4μl。程序升温：初始温度80℃，初始保留时间5分钟；升温速率20℃/分钟；终止温度320℃。

[0045] 分析发现原油经过降解后，轻组分含量升高，而重组分含量降低，小于C30的馏分增加1.32％，在C19和C25之间多出四种轻质馏分。单一重组分最多减少18％(介于C30和C31之间)，原有单一组分最多增加27.1％(C18)。见图2。

[0046] 实施例二：

[0047] 1、原油降解菌的培养

[0048] 同实施例一。

[0049] 2、原油降解

[0050] 将培养好的菌体转移到50mL原油液体培养基中(菌株A与菌株B按照1∶1的比例加入，菌株B接入量不变)。原油液体培养基组成同实施例一。降解条件同实施例一。

[0051] 3、GC分析

[0052] 同实施例一。

[0053] 分析发现原油经过降解后，降解趋势与实施例一相同，轻组分含量升高，而重组分含量降低，小于C30的馏分增加1.17％，增加的四种轻组分介于C21和C26之间。单一轻组分增加最多的仍为C18，为25.3％。这种变化的主要原因在于，在降解时加入的能降解原油的铜绿假单胞菌sws-0603的量减少一倍。见图3。

[0054] 实施例三：

[0055] 1、原油降解菌的培养

[0056] 同实施例一。

[0057] 2、原油降解

[0058] 将培养好的菌体转移到50mL原油液体培养基中(菌株A与菌株B按照1∶2的比例加入，菌株B接入量不变)。原油液体培养基组成同实施例一。降解条件同实施例一。

[0059] 3、GC分析

[0060] 同实施例一。

[0061] 同实施例一和实施例二相比，本实施例的效果中原油经过降解后，轻组分种类增加更多，小于C30的轻组分含量增加1.43％。单一组分增加最多的为新增组分(介于C19和C20之间)。GC图见图4。