家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4及其基因

摘要

本发明公开了如下（a）或（b）的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4，（a）是由SEQIDNo.2中第23位至第245位氨基酸组成的蛋白质；（b）在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与（a）限定的蛋白质具有相同或相似活性的由（a）衍生的蛋白质；还公开了编码BmGSTD4的基因序列及mRNA全长序列，以及重组BmGSTD4蛋白的原核制备方法；研究显示，BmGSDd4基因属于delta类GSTs基因，该基因仅在雄蛾触角中特异高量表达；采用本发明方法制得的重组BmGSTD4蛋白具有GST活性；以BmGSDd4基因为靶点，有望设计出特异性杀灭鳞翅目害虫而对其它有益昆虫无害的生物防治药物。

权利要求

1.家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4，其特征在于，由SEQ ID No.2中第25位至第245位氨基酸组成。

2.编码权利要求1所述的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，由SEQ ID No.1中第163位至第828位核苷酸组成。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，以原核表达载体p28为基础载体，所述原核表达载体p28是将pET28a质粒的多克隆位点进行改造而得，改造后的多克隆位点序列如SEQ ID No.11所示。

6.含有权利要求4或5所述重组表达载体的工程菌。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，以大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株为宿主菌。

8.权利要求1所述家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将由SEQ ID No.1中第163位至第828位核苷酸组成的基因克隆入原核表达载体p28的多克隆位点，获得重组表达载体BmGSTd4-p28，再将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，获得工程菌BmGSTd4-p28-Rosetta(DE3)，用终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于16℃诱导表达20小时，收集诱导表达后的菌体，超声破碎，离心，收集上清，用

2+

Ni -NTA 亲和层析纯化，脱盐，超滤浓缩，即制得由SEQ ID No.2中第25位至第245位氨基酸组成的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4；所述原核表达载体p28是将pET28a质粒的多克隆位点改造而得，改造后的多克隆位点序列如SEQ ID No.11所示。

说明书

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4及其基因

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及一种谷胱甘肽-S-转移酶及其基因。

背景技术

[0002] 由于有机合成杀虫剂具有广谱、高效、快速、使用方便及经济效益显著等特点，在农业生产和卫生防治等领域广泛应用。但随着杀虫剂大量、长期及频繁的使用，昆虫抗药性发展迅速，具有抗药性的害虫种类成倍增长，其中以双翅目和鳞翅目昆虫居多。

[0003] 谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferases, GSTs）是生物体内广泛存在的一类重要解毒酶。昆虫体内的GSTs对杀虫剂有代谢解毒的作用，在昆虫的杀虫剂抗药形成中发挥重要作用。研究发现，与昆虫抗药性相关的GSTs主要是昆虫特异的delta及epsilon类。家蚕作为鳞翅目昆虫模式生物，对家蚕GSTs进行克隆及功能研究，阐明GSTs与杀虫剂抗药性之间的关系，有助于对农业生产中害虫的生物防治提供理论和实践指导。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕谷胱甘肽-S-转移酶，目的之二在于提供所述谷胱甘肽-S-转移酶的基因，目的之三在于提供含有所述谷胱甘肽-S-转移酶基因的重组表达载体，目的之四在于提供含有所述重组表达载体的工程菌，目的之五在于提供所述谷胱甘肽-S-转移酶的制备方法。

[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 1、如下（a）或（b）的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4：

[0007] （a）由SEQ ID No.2中第23位至第245位氨基酸组成的蛋白质；

[0008] （b）在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与（a）限定的蛋白质具有相同或相似活性的由（a）衍生的蛋白质。

[0009] 进一步，（a）限定的蛋白质的N末端还有信号肽序列，所述信号肽序列由SEQ ID No.2中第1位至第22位氨基酸组成。

[0010] 进一步，（b）限定的蛋白质由SEQ ID No.2中第25位至第245位氨基酸组成。

[0011] 2、编码（a）或（b）的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的基因。

[0012] 进一步，编码（a）限定的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的基因由SEQ ID No.1中第157位至第828位核苷酸组成。

[0013] 更进一步，编码（a）限定的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的基因的5’末端还有信号肽编码序列，由SEQ ID No.1中第91位至第156位核苷酸组成。

[0014] 更进一步，编码（a）限定的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的基因mRNA全长序列由SEQ ID No.1中第1位至第1049位核苷酸组成。

[0015] 进一步，编码（b）限定的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的基因由SEQ ID No.1中第163位至第828位核苷酸组成。

[0016] 3、含有上述任一基因的重组表达载体。

[0017] 进一步，所述重组表达载体以原核表达载体p28为基础载体，所述原核表达载体p28是将pET28a质粒的多克隆位点改造而得，改造后的多克隆位点序列如SEQ ID No.11所示。

[0018] 4、含有上述重组表达载体的工程菌。

[0019] 进一步，所述工程菌以大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株为宿主菌。

[0020] 5、（b）限定的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的制备方法，包括以下步骤：将由SEQ ID No.1中第163位至第828位核苷酸组成的基因克隆入原核表达载体p28的多克隆位点，获得重组表达载体BmGSTd4-p28，再将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，获得工程菌BmGSTd4-p28-Rosetta(DE3)，用终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于2+
16℃诱导表达20小时，收集诱导表达后的菌体，超声破碎，离心，收集上清，用Ni -NTA 亲和层析纯化，脱盐，超滤浓缩，即制得由SEQ ID No.2中第25位至第245位氨基酸组成的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4；所述原核表达载体p28是将pET28a质粒的多克隆位点改造而得，改造后的多克隆位点序列如SEQ ID No.11所示。

[0021] 本发明的有益效果在于：本发明根据文献报道的BmGSTd4 基因序列片段进行5’RACE和3’RACE扩增，克隆得到BmGSTd4 基因mRNA全长序列及完整开放阅读框，并利用大肠杆菌原核表达系统对BmGSTd4 基因编码蛋白进行外源表达，成功获得了可溶性的重组BmGSTD4蛋白。研究显示，BmGSTd4基因属于delta类GSTs基因，该基因仅在雄蛾触角中特异高量表达；采用本发明方法制得的重组BmGSTD4蛋白具有GST活性。由于GSTs在昆虫的杀虫剂抗药形成中发挥重要作用，而家蚕为鳞翅目昆虫模式生物，因此，以BmGSTd4基因为靶点，有望设计出特异性杀灭鳞翅目害虫而对其它有益昆虫无害的生物防治药物。

附图说明

[0022] 图1为BmGSTd4 基因在家蚕中的时期表达特征。

[0023] 图2为BmGSTd4 基因在5龄第3天家蚕雌雄幼虫中的组织表达特征。

[0024] 图3为BmGSTd4 基因在家蚕雌雄成虫中的组织表达特征。

[0025] 图4为BmGSTd4基因mRNA全长序列及预测的氨基酸序列，其中黑体标记的ATG和TGA分别为起始密码子和终止密码子，下划线部分为信号肽序列。

[0026] 图5为重组BmGSTD4蛋白的原核表达。

[0027] 图6为重组BmGSTD4蛋白的Ni2+-NTA亲和层析纯化。

[0028] 图7为重组BmGSTD4蛋白的GST活性。

具体实施方式

[0029] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0030] 实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

[0031] 一、BmGSTd4基因在家蚕雄蛾触角中的特异表达

[0032] 根据文献报道的BmGSTd4 基因序列片段（Yu Q., etc al. Identification, genomic organization and expression pattern of glutathione S-transferase in the silkworm, Bombyx mori. 2008, Insect Biochem Mol Biol. 38, 1158-1164）设计特异引物：上游引物：5’-atgctgacagcg- agtgtcttgggag-3’（SEQ ID No.3）；下游引物：5’-tcattcatcatccttatttataaac-3’（SEQ ID No.4）。

[0033] 分别取自1龄眠蚕时期至蛾期第1天的不同时期家蚕个体（5龄第3天后分雌雄个体），以及5龄第3天雌雄幼虫和雌雄成虫的各组织材料，采用TRIzol试剂（Invitrogen公司）提取总RNA，利用M-MLV反转录试剂盒（Invitrogen公司）合成cDNA第一链，再用上述特异引物进行RT-PCR，以家蚕肌动蛋白基因Actin3为内参照。PCR 扩增条件为：95℃预变性10分钟，然后95℃变性40秒、55℃退火30秒、72℃延伸90秒，共25个循环，最后72℃终延伸10分钟。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

[0034] 结果见图1~3，在自1龄眠蚕时期至蛾期第1天的不同时期家蚕个体中，仅在蛾第1天的雄性个体中检测到BmGSTd4基因表达；在5龄第3天雌雄幼虫及雌性成虫的各组织中均未检测到BmGSTd4基因表达，仅在雄性成虫的触角中检测到BmGSTd4基因的高量、特异表达。

[0035] 二、BmGSTd4基因mRNA全长序列的克隆

[0036] 根据文献报道的BmGSTd4 基因序列片段（Yu Q., etc al. Identification, genomic organization and expression pattern of glutathione S-transferase in the silkworm, Bombyx mori. 2008, Insect Biochem Mol Biol. 38, 1158-1164），按照TMGeneRacer 试剂盒（Invitrogen公司）说明书，设计合成5’RACE和3’RACE的基因特异引物和巢氏基因特异引物。引物序列如下：

[0037] 5’ RACE基因特异引物：5’-ctctgcaccggtctggtcgatgt-3’（SEQ ID No.5）；

[0038] 5’ RACE巢氏基因特异引物：5’-gggttcttagggtacaacgcatcgtt-3’（SEQ ID No.6）；

[0039] 3’ RACE基因特异引物：5’-gaatcctcaacataccataccgact-3’（SEQ ID No.7）；

[0040] 3’ RACE巢氏基因特异引物：5’-atcgaccagaccggtgcagaga-3’（SEQ ID No.8）。

[0041] 以雄蛾触角cDNA为模板，采用上述特异引物，按照GeneRacerTM试剂盒说明书依次进行5’RACE和3’RACE。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶回收试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）切胶回收纯化目的片段，再将所得目的片段克隆入载体pEasy-T1 simple（Transgen公司），委托上海生工生物工程有限公司进行测序。

[0042] 所得BmGSTd4 基因mRNA全长序列及预测的氨基酸序列见图4，BmGSTd4 基因mRNA全长1049bp（SEQ ID No.1中第1~1049位核苷酸），包含738bp的开放阅读框（SEQ ID No.1中第91~828位核苷酸），共编码长245个氨基酸的BmGSTD4蛋白（SEQ ID No.2中第1~245位氨基酸），其中蛋白N端包含一个由22个氨基酸组成的信号肽序列（SEQ ID No.2中第1~22位氨基酸）。

[0043] 将BmGSTd4基因开放阅读框序列及预测的氨基酸序列在NCBI上进行BLAST比对，结果显示，BmGSTd4基因属于delta类GSTs基因。

[0044] 三、重组BmGSTD4蛋白的原核表达和纯化

[0045] BmGSTD4蛋白N端的信号肽仅用于指导蛋白质的跨膜转移，当蛋白质到达跨膜转移位置时即被切除，成熟的蛋白质是不含有信号肽序列的，即实际发挥GST活性的是去除信号肽序列后的BmGSTD4蛋白（SEQ ID No.2中第23~245位氨基酸）。因此，在进行重组BmGSTD4蛋白的原核表达时，不需要表达BmGSTD4蛋白N端的信号肽序列。为了改善原核表达效果，本发明用SEQ ID No.1中第163~828位核苷酸所示序列构建BmGSTD4原核表达载体，表达的重组BmGSTD4蛋白实际由SEQ ID No.2中第25~245位氨基酸组成，即去除了信号肽序列并缺失了N端的前2个氨基酸（Gly-Pro, GP）。

[0046] 根据去除信号肽序列的BmGSTd4 基因编码区（SEQ ID No.1中第163~828位核苷酸）设计特异引物：正向引物：5'-gctacatatgaaaaagctagtggcgcctataaaac-3'（SEQ ID No.9，下划线部分为Nde I酶切位点）；反向引物：5'-ccgctcgagtcattcatcatccttatttataaac-3'（SEQ ID No.10，下划线部分为Xho I酶切位点）。以雄蛾触角cDNA为模板，采用上述特异引物进行PCR扩增。PCR 扩增条件为：95℃预变性10分钟，然后95℃变性40秒、55℃退火40秒、72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃终延伸10分钟。

[0047] PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用AxyGen PCR清洁试剂盒切胶回收纯化目的片段。所得目的片段和原核表达载体p28分别用Nde I和Xho I 进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用AxyGen PCR清洁试剂盒切胶回收纯化BmGSTd4基因片段和p28骨架片段。将所得BmGSTd4 基因片段和p28骨架片段按摩尔比为1:3用Solution I（Takara公司）进行连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，筛选阳性克隆，委托上海生工生物工程有限公司进行测序验证，获得重组载体BmGSTd4-p28。原核表达载体p28由由中国科学技术大学周丛照教授惠赠，是将pET28a质粒（Novagen公司）的多克隆位点进行改造而得，改造后的多克隆位点序列为：5'-ccatgggacaccatcaccatcaccatatggccaaaaaggccgcggccgcactcgag-3'（SEQ ID No.11，下划线部分分别为Nde I 和Xho I 酶切位点）。

[0048] 将重组载体BmGSTd4-p28转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株（Novagen公司）感受态细胞，筛选阳性克隆，获得工程菌BmGSTd4-p28-Rosetta(DE3)。挑取阳性单克隆菌落，用含有卡那霉素和氯霉素的2×YT培养基于37℃振荡培养至菌体密度OD600为0.6~1.0，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2mM，进行诱导表达。收集诱导表达后的菌体，用重悬缓冲液（100mM NaCl+20mM Tris, pH8.0）重悬，置冰水混合物上超声破碎，4℃、16000rpm离心30分钟，分别收集沉淀和上清，进行SDS-PAGE分析。结果见图5，用IPTG于16℃诱导表达20小时，工程菌BmGSTd4-p28-Rosetta(DE3)可以高量表达重组BmGSTD4蛋白，该蛋白为可溶性蛋白。

[0049] 将收集的上清进行Ni2+-NTA（GE healthcare公司）亲和层析：将上清加入经结合2+
缓冲液（binding buffer）平衡的Ni -NTA介质中，用结合缓冲液冲洗，再用梯度浓度的咪唑溶液（20mM、50mM、100mM、200mM、500mM、1M）依次洗脱，收集各洗脱峰溶液，进行SDS-PAGE分析，结果见图6。将500mM咪唑溶液洗脱所得的蛋白溶液用HiLoad 16/60脱盐柱（GE healthcare公司）进行脱盐和缓冲液转换，再用超滤管（Millipore Amicon公司）浓缩，浓缩蛋白溶液（含30%甘油和1mM DTT）即为纯化的重组BmGSTD4蛋白溶液，-80℃保存备用。

[0050] 四、重组BmGSTD4蛋白的GST活性测定

[0051] 取纯化 的重组BmGSTD4蛋白，按照文 献方法（Habig, W. H., etc al. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. 1974, J Biol Chem. 249, 7130-7139）测定GST活性，以1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）为模式底物，固定另一底物谷胱甘肽的浓度为1mM。结果见图7，测得的酶活参数值分别为：Km=0.020±0.001 mM，Vmax=176.302±4.943 μmol/mg/min，Kcat=3 -1
(4.760±0.133)×10min ，说明重组BmGSTD4蛋白具有GST活性。

[0052] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。