水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK2及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK2及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。

权利要求

1.一种培育转基因植物的方法，是将编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；所述目的植物为水稻；所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因通过重组载体导入所述目的植物中；所述重组载体是将编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因插入pCambia1302载体的多克隆位点得到的重组载体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

说明书

水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK2及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK2及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 环境中物理化学因素的变化，如干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等胁迫因素以及病虫害等生物因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐逆性，可以利用传统的育种方法和分子遗传育种方法。目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。在非生物或生物逆境的胁迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外信号变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功能基因，可以启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。

[0003] 植物耐非生物胁迫相关的基因已有很多报道，包括效应分子基因和调控基因。水稻中与耐非生物胁迫相关的调控基因方面，包括转录因子如本实验室克隆的OsbHLH(专利号ZL 03 1 23913.7)、OsDREBL(专利号ZL 02 1 29517.4)等和受体类激酶，如OsSIK1(专利申请号200710176995.7)及其它调控蛋白。上述基因转化模式植物拟南芥或水稻后，其高表达均提高了转基因植株耐非生物胁迫的能力。

[0004] 水稻作为最重要的粮食作物之一，改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。转基因水稻植株的成功和水稻基因组测序工作的完成为研究发现新的耐逆境基因提供了有利条件。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关的蛋白及其编码基因与应用。

[0006] 本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关的蛋白及其编码基因。

[0007] 本发明所提供的蛋白，名称为OsSIK2(Stress Inducible kinase 2)，来源于水稻(Oryza sativa)，是如下(a)或(b)：

[0008] (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0009] (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。

[0010] 序列表中的序列2由837个氨基酸残基组成。

[0011] 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0012] 上述(b)中的OsSIK2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsSIK2的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至2514位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

[0013] 编码所述蛋白的基因(OsSIK2)也属于本发明的保护范围。

[0014] 所述基因是如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

[0015] (1)序列表中序列1所示的DNA分子；

[0016] (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

[0017] (3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

[0018] 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0019] 序列表中的序列1由2514个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第1至2514位脱氧核糖核苷酸为OsSIK2的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第1至3位脱氧核糖核苷酸为OsSIK2的起始密码子ATG，自5’端的第2512至2514位脱氧核糖核苷酸为OsSIK2的终止密码子TAG。

[0020] 含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

[0021] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)。如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

[0022] 所述重组载体具体为将所述基因插入pCambia1302载体的BglI和SalI识别位点间得到的重组载体pCambia1302-OsSIK2。

[0023] 扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0024] 所述引物对具体可为如下(I)或(II)：

[0025] (I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；

[0026] (II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。

[0027] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

[0028] 本发明提供的方法是将所述基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

[0029] 所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的耐逆性性状得到改良。

[0030] 所述基因可先进行进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

[0031] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％；

[0032] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

[0033] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

[0034] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。

[0035] 5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

[0036] 在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。

[0037] 利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的水稻受体类蛋白OsSIK2的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

[0038] 所述基因具体可通过所述重组载体导入所述目的植物中。

[0039] 携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

[0040] 所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

[0041] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。

[0042] 本发明的实验证明，将OsSIK2基因导入水稻，获得了过量表达OsSIK2基因的转基因植株，在盐胁迫后，转OsSIK2基因植株的存活率和生长状态都要明显好于对照植株，而OsSIK2的突变体水稻表现出对盐和旱胁迫的超敏感，说明OsSIK2基因能够显著提高植物的耐盐、耐旱性。本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。

附图说明

[0043] 图1为OsSIK2在4℃、NaCl、干旱和ABA处理下的表达特征

[0044] 图2为植物表达载体pCambia1302-OsSIK2的物理图谱

[0045] 图3为转OsSIK2基因植株的Real time PCR检测

[0046] 图4为OsSIK2过量表达转基因、突变体及对照耐植株盐性比较

[0047] 图5为OsSIK2过量表达转基因植株在0.5％盐田中的表型及存活率

[0048] 图6为OsSIK2突变体植株与其对照NIP的耐旱性比较

[0049] 图7为OsSIK2过量表达转基因植株与对照的耐旱性比较

具体实施方式

[0050] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0051] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0052] 实施例1、水稻耐逆性相关蛋白OsSIK2编码基因OsSIK2的筛选及其cDNA的克隆[0053] 1、OsSIK2的克隆

[0054] 对数据库中的水稻全基因组序列进行BLAST检索，得到受体类激酶(RLK)相关序列片段，经过拼接，得到了267个受体类蛋白基因，经RT-PCR测定，其中一些基因受非生物胁迫诱导，从中选取一个基因作进一步研究。

[0055] 水稻(Oryza sativa var.TP309，记载在Shou-Qiang Ouyang，Yun-Feng Liu，Peng Liu，Gang Lei，Si-Jie He，Biao Ma，Wan-Ke Zhang，Jin-Song Zhang and Shou-Yi Chen，Receptor-like kinase OsSIK1 improves drought and salt stress tolerance in rice(Oryza sativa)plants，The Plant Journal，2010，62(2)：316-29，公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获得。)幼苗培养至两周，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提方法从冷冻的水稻苗中提取RNA。取5μg总RNA用MMLV逆转录酶进行逆转录，获得cDNA一链。

[0056] 以上述cDNA作为模板，所用引物如下，进行PCR扩增：

[0057] 正向5’-ATGCCACCTCCTCTCTATGT-3’(序列3)

[0058] 反向5’-TTATATTGAAGCCACGTCAG-3’(序列4)

[0059] PCR反应体系为25μl，包含：PCR缓冲液、0.2mmol/L dNTPs、两个引物各0.8mmol/L、5μl稀释的cDNA混合液及1单位LA Taq DNA聚合酶(Takara)，PCR的条件为：94℃，30s；58℃，1min；72℃，3min；35个循环。

[0060] 将获得的PCR产物与pGEM-T-easy载体(购自Promega)连接，得到的连接产物命T-RLK1名为P ，测序，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该PCR产物的基因命名为OsSIK2，该基因的编码区为序列表中序列1自5’末端第1-2514位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为OsSIK2，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2所示。序列表中序列1由2514个核苷酸组成，序列表中序列2由837个氨基酸残基组成。

[0061] 2、非生物胁迫和激素处理下水稻OsSIK2基因的表达模式

[0062] 由于OsSIK2基因在水稻幼苗中的丰度很低，因此选用RT-PCR的方法研究了OsSIK2在各种处理时的转录特征。

[0063] 水稻(Oryza sativa TP309)种子种在培养皿中，培养室中生长至两叶一心期时(2周)进行如下胁迫处理：1)低温处理：水稻苗置于4℃中；2)盐处理：水稻苗移入0.6％NaCl水溶液中；3)干旱处理：将水稻苗从MS培养基(购自青岛海博生物技术有限公司。)中取出，吸干水分，置于空气中；4)ABA处理：将水稻苗移入100μm脱落酸(ABA)水溶液中；分别在上述各种处理后0、0.5、1、5、12和24小时分别收集新鲜叶片1g提取总RNA，将每个样品的总RNA(5μg)用MMLV逆转录酶(Gibco)在42℃下逆转录50min，取1/20的cDNA混合物用于Northern分析，探针为OsSIK2 cDNA，以检测OsSIK2的表达丰度。以18srRNA为内标。实验重复三次，得到相似的结果。

[0064] 结果具体如图1所示，OsSIK2基因的表达明显受低温、盐、干旱和ABA诱导。

[0065] 实施例2、培育耐盐和耐干旱胁迫的水稻

[0066] 一、OsSIK2超表达水稻植株的获得和鉴定

[0067] 1、OsSIK2超表达水稻植株的获得

[0068] 1)OsSIK2超表达载体pCambia1302-OsSIK2的构建

[0069] 以水稻品种TP309的总RNA反转录得到的cDNA为模板，以正向BglII：5’-AGATCTATGCCACCTCCTCTCTATGT-3’，反向SalI：5’-GTCGAC TTATATTGAAGCCACGTCAG-3’为引物，得到PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列1的自5′末端第1-2514位脱氧核糖核苷酸，即为OsSIK2全长cDNA；将该PCR产物经过BglI和SalI双酶切，回收酶切后片段与经过同样酶切的pCambia1302( KP，Moyle RL，Putterill J，Walter C.，Expression analysis of four Pinus radiata male cone promoters in the heterologous host Arabidopsis，Planta，2003，217(6)：858-67，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)载体片段连接，得到连接产物，转化大肠杆菌，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列1的自5′末端第1-2514位脱氧核糖核苷酸插入到载体的BglI和SalI酶切位点间得到的载体，该质粒命名为pCambia1302-OsSIK2，即为重组表达载体，该重组表达载体的结构示意图如图2所示。

[0070] 2)OsSIK2超表达载体pCambia1302-OsSIK2的转化和转OsSIK2基因的水稻植株的获得

[0071] <1>转化农杆菌

[0072] a、感受态细胞的制备

[0073] 参照Sambrook等(A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press)的方法：挑取根癌农杆菌AGL1(He Y，Jones HD，Chen S，Chen XM，Wang DW，Li KX，Wang DS，Xia LQ，Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency，J ExpBot.2010，61(6)：1567-81，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)单菌落于10mlLB(10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨)中，28℃振荡培养至对数晚期；取0.5ml菌液加入50ml新鲜LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600≈0.5；转移至50ml离心管中，冰浴20分钟；4℃，4000rpm离心10分钟，收集菌体；沉淀用20ml预冷的10％甘油重悬；4℃，
4000rpm离心10分钟，迅速倒出上清液；用甘油重悬，即为感受细胞，按每管50μl体积分装至1.5ml的离心管中，分装后于-70℃保存待用。

[0074] b、根癌农杆菌电击转化

[0075] 取50μl感受态细胞，加入0.5μg质粒pCambia1302-OsSIK2，轻轻混匀，冰上放置；2500V电击5秒，立刻加入800μl LB培养基；28℃，150rpm，恢复培养45分钟；涂布细胞于筛选培养基平板上，超净台吹干表层液体；28℃培养两天。从转化后的平板挑取单菌落接种至2ml LB YEB液体培养基(含抗生素：终浓度为50μg/ml的卡那霉素和25μg/ml的利福平)中，28℃振荡过夜，碱裂解法抽提质粒，分别进行PCR和酶切鉴定。

[0076] PCR鉴定的引物为正向BglII：5’-AGATCT ATGCCACCTCCTCTCTATGT-3’(序列5)，反向SalI：5’-GTCGACTTATATTGAAGCCACGTCAG-3’(序列6)，得到2514bp的片段为阳性质粒。

[0077] 酶切采用BglI和SalI双酶切，得到2514bp的片段为阳性质粒。

[0078] 将上述PCR鉴定和酶切鉴定的阳性质粒送去测序，结果为该质粒为pCambia1302-OsSIK2，含有该质粒的菌株命名为AGL1/pCambia1302-OsSIK2。

[0079] <2>农杆菌介导的水稻转化

[0080] A、幼胚愈伤组织的诱导

[0081] 取水稻品种TP309(以下简称野生型水稻。)种子，70％乙醇水溶液消毒1分钟，无菌水冲洗2-3遍；再用2％有效氯的次氯酸钠溶液振荡消毒60分钟以上，无菌水冲洗4-5遍，然后在无菌条件下分离出幼胚，接在N6D2(N6盐分和维生素，500g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)培养基上，于28℃暗培养4天，得到水稻TP309幼胚的愈伤组织。

[0082] B、农杆菌的培养

[0083] 从LB固体培养基上挑取AGL1/pCambia1302-OsSIK2接种至20ml含终浓度为50μg/ml的卡那霉素和25μg/ml的利福平的LB液体培养基中，28℃摇菌培养至对数生长晚期；再从中取0.5ml转接至50ml同样的LB培养基中，同样条件下培养至OD600为0.5左右。

[0084] C、共培养及转化、筛选、分化

[0085] 将OD600为0.5的AGL1/pCambia1302-OsSIK2于4000g离心10分钟后，沉淀用等体积的AAM-AS(AA盐分和氨基酸，MS维生素，100mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，pH5.2)培养基重悬，得到AAM-AS菌液；将预培养4天的来源于水稻TP309幼胚的愈伤组织浸入此AAM-AS菌液中侵染20分钟，用无菌滤纸吸干后转移到N6D2C(N6D2，10g/L葡萄糖，100mM乙酰丁香酮，pH5.2)培养基上(在培养基表面铺一张无菌滤纸)，25℃暗培养3天。

[0086] 将愈伤组织用含300mg/L的头孢霉素(cef)的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1(N6D2，25mg/L潮霉素(Hygromycine)，600mg/L头孢霉素(cefotaxime)，pH5.8)培养基上，筛选一代；两周后，转移至N6D2S2(N6D2，50mg/L潮霉素，300mg/L头孢霉素，pH5.8)培养基上筛第二代(2周/代)。

[0087] 取出经过两次筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(MS盐分和维生素，300g/L水解酪蛋白，50mg/L潮霉素，3g/L 6-BA，2.5mg/L KT，0.2mg/L ZT，2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)上，在分化培养箱(12小时光照/12小时黑暗，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗；再生的植株在生根壮苗培养基(1/4MS盐分，MS维生素，1mg/L多效唑，0.5mg/LNAA，6.5g/L琼脂粉，pH5.8)上生根壮苗；待小苗长至10cm左右时打开容器封口膜，炼苗2-3天，将阳性小苗移至人工气候室栽培，共得到了541株筛选阳性T0代转OsSIK2水稻，筛选抗生素为：终浓度为50μg/ml的卡那酶素和25μg/ml的利福平。

[0088] T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株。

[0089] 采用上述方法，将空载体pCambia1302转入水稻品种TP309中，得到T0代转空载体水稻，提取RNA，反转录获得cDNA为模板，引物为正向BglII：5’-AGATCTATGCCACCTCCTCTCTATGT-3’，反向SalI：5’-GTCGACTTATATTGAAGCCACGTCAG-3’，结果没有得到目的片段。

[0090] 2、转OsSIK2水稻植株的鉴定

[0091] 分别提取水稻品种TP309植株(野生型水稻)、T0代转空载体水稻、T0代转OsSIK2水稻的总RNA进行Real-time PCR鉴定分析，其中，Real-time PCR所用的引物如下：

[0092] 正向5’-ATGCCACCTCCTCTCTATGT-3’

[0093] 反向5’-TTATATTGAAGCCACGTCAG-3’

[0094] 结果如图3所示，可以看出，在41株T0代转OsSIK2水稻中，有21株T0代转OsSIK2水稻的OsSIK2基因表达量高于野生型水稻，是野生型水稻的3-10倍。这些OsSIK2基因表达量高于野生型水稻的T0代转OsSIK2水稻即为OsSIK2基因过表达植株。野生型水稻和转空载体水稻结果无显著差异。

[0095] 挑选出74-3、72-1、1-43和1-18四个株系的T0代转OsSIK2水稻用同样的方法进行进一步鉴定，以野生型水稻TP309植株和T0代转空载体水稻(42-1)为对照，进行RT-PCR，结果如图3所示，从图中可以看出，TP309植株和42-1的OsSIK2的相对转录数分别约为1.5和1.0，74-3和72-1的OsSIK2的相对转录数分别约为3.8和8.5，1-43和1-18的OsSIK2的相对转录数分别约为4.5和6.0。

[0096] 收获74-3株系T0代转OsSIK2水稻、72-1株系的T0代转OsSIK2水稻和T0代转空载体水稻的种子，播种得到74-3株系T1代转OsSIK2水稻、72-1株系的T1代转OsSIK2水稻和T1代转空载体水稻。

[0097] 三、转OsSIK2基因水稻耐逆性检测

[0098] 1、耐盐性试验：

[0099] 1)0.6％NaCl水溶液耐盐性试验

[0100] 同时进行如下两组处理：

[0101] 0.6％NaCl水溶液组：将上述2个OsSIK2基因过表达株系(74-3株系T1代转OsSIK2水稻和72-1株系的T1代转OsSIK2水稻)的2周龄苗移入0.6％(0.6g/100ml)NaCl水溶液中处理18天，室温(25℃)，自然光照。以TP309水稻(野生型水稻)和T1代转空载体水稻为对照。

[0102] 0.5％NaCl水溶液组：将OsSIK2的T-DNA插入突变体sik2(购于日本水稻基因组研究中心，Rice Genome Research Center(RGRC))及其对照NIP(Shou-Qiang Ouyang，Yun-Feng Liu，Peng Liu，Gang Lei，Si-Jie He，Biao Ma，Wan-Ke Zhang，Jin-Song Zhang and Shou-Yi Chen，Receptor-l ike kinase OsSIK1 improves drought and salt stress tolerance in rice(Oryza sativa)plants，2010，The Plant Journal，62(2)：316-29.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)的2周龄苗移入0.5％(0.5g/100ml)NaCl水溶液中处理18天，室温(25℃)，自然光照。

[0103] 观察两组盐胁迫处理植株的表型并照相。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株均为30株。

[0104] 结果如图4所示，74-3株系T1代转OsSIK2水稻和72-1株系的T1代转OsSIK2水稻盐胁迫后的长势均明显优于对照TP309水稻(野生型水稻)，在0.6％NaCl处理18天后，对照(TP309)和转基因植株(74-3、72-1)均表现萎蔫，但是对照萎蔫程度较转基因植株显著，野生型水稻和T1代转空载体水稻结果无显著差异；

[0105] 当用0.5％NaCl处理OsSIK2突变体(sik2，该突变体为T-DNA插入突变体，其中OsSIK2基因不表达)和其对照NIP(sik2来自日本水稻基因组研究中心，突变的原始材料是日本晴NIP，NIP的OsSIK2基因是正常表达的)18天时，NIP略显萎蔫，而sik2则明显萎蔫。表明OsSIK2的过量表达增加了转基因植株的耐盐性，而在该基因的突变体中由于OsSIK2其表达下降或不表达，则导致植株的耐盐性下降。因此OsSIK2参与植物对盐胁迫的应答反应(上述实验的目的是要说明OsSIK2基因过量表达提高了转基因植株的耐逆性，而其不表达的突变体则与其对照比较，盐敏感。进一步说明OsSIK2与植物耐逆性相关)。

[0106] 2)0.5％NaCl水溶液的盐池中耐盐性鉴定

[0107] 在0.5％NaCl水溶液的盐池中进行了耐盐性鉴定。所有盐池实验均在自然温度和光照下进行，在抽穗前完成，具体如下：

[0108] 将65棵74-3株系T1代转OsSIK2水稻和65棵72-1株系的T1代转OsSIK2水稻在北京6月的自然温度和光照育秧一个月，后移至清水池中。在北京7月自然条件下缓秧7天之后灌盐水至0.5％(质量百分含量)NaCl，67天后复水42天，以91棵对照TP309水稻(野生型水稻)和91棵T1代转空载体水稻为对照。

[0109] 在盐池中受盐胁迫后所有的水稻植株生长均受到严重抑制。在盐胁迫(灌盐水)后的第23天、30天、37天、50天和70天时分别统计对照和转基因植株的存活率，结果见表1所示，在盐胁迫23、30和37天时，转基因转系(74-3株系T1代转OsSIK2水稻和72-1株系的T1代转OsSIK2水稻)的成活率均为100％，而对照(TP309水稻)23、30和37天时成活率分别下降至76％、64％和36％；当盐胁迫至50天和70天时，转基因转系72-1和74-3分别下降至81％、75％和76％、73％，而对照分别急剧下降至20％和4％。野生型水稻和T1代转空载体水稻结果无显著差异。

[0110] 拍照如图5所示，可以看出，盐胁迫67天和复水42天后对照(TP309水稻)和转基因植株(72-1和74-3)的生长情况，在复水前对照和转基因植株均严重萎蔫，但是转基因植株明显好于对照，复水后，大部分转基因植株开始反绿，而对照继续萎蔫，仅极少数对照苗有绿色。

[0111] 上述结果与盆栽的耐盐性(上述1)0.6％NaCl水溶液耐盐性试验)鉴定结果一致表明，OsSIK2的过量表达植株有较强的耐盐性。

[0112] 表1 OsSIK2转基因转系与对照在0.5％NaCl盐池中的存活率比较

[0113]

[0114] 2、耐旱性试验：

[0115] 将OsSIK2的突变体和其对照NIP的2周龄苗以分子量为6000的20％(体积百分含量)聚乙二醇(PEG)处理2天，观察其表型。以不进行聚乙二醇(PEG)处理的正常条件为对照。培养条件为室温(25℃)，自然光照。

[0116] 结果如图6所示，从图中看出，与正常条件下生长对比，干旱胁迫下突变体明显萎蔫，而对照NIP虽长势受到抑制，但是明显优于突变体。

[0117] 将74-3株系的T1代转OsSIK2水稻和72-1株系的T1代转OsSIk2水稻2周龄苗停止浇水18天后，观察并照相(图7A)之后复水13天后统计存活率(图7B)。以TP309水稻(野生型水稻)和T1代转空载体水稻为对照。每次重复中，所有被测试株系均为30株。实验重复三次，结果取平均值±标准差。

[0118] 结果如图7A所示，从图中看出，旱处理18天后对照TP309植株明显萎蔫，而转OsSIK2基因株系74-3的T1代和72-1的T1代植株虽然生长受到抑制，但萎蔫不明显。

[0119] 恢复13天后的存活率如图7B所示，对照TP309(对照)、转OsSIK2基因水稻株系74-3T1代植株(74-3)和转OsSIK2基因水稻株系72-1的T1代植株(72-1)的存活率分别为3％±3％、96％±11％和98％±14％。野生型水稻和T1代转空载体水稻结果无显著差异。

[0120] 进行了74-3株系的T1代转OsSIK2水稻和72-1株系的T1代转OsSIK2水稻的水分损失率计算，以TP309水稻(野生型水稻)和T1代转空载体水稻为对照。分别取0.3克野生型水稻和各转基因植株叶片5份，分别在旱处理0min(停止浇水第一天起记作0min)、60min、80min、100min、120min、140min时称重，计算其水分减少的百分数，公式为水分损失率＝旱处理前叶片重/旱处理前叶片重。实验重复三次，结果取平均值。

[0121] 结果如图7C所示，从图中看出，野生型水稻(CK，TP309)在60min、80min、100min、120min、140min的水分损失率分别约为35％、46％、54％、62％和69％，而74-3株系的T1代转OsSIK2水稻(74-3)和72-1株系的T1代转OsSIK2水稻(72-1)在60min、80min、100min、
120min、140min的水分损失率分别为18％、23％、34％、41％、46％和20％、24％、31％、
39％、43％。表明，对照TP309在每个旱处理的时间点的水分损失率均高于转基因株系74-3和72-1株系的T1代植株。野生型水稻和T1代转空载体水稻结果无显著差异。

[0122] 以上实验均表明OsSIK2基因过表达植株的耐旱性明显高于对照植株，而OsSIK2的突变体植株其耐旱性明显劣于对照植株。

[0123] 上述实验表明，OsSIK2参与植物对逆境的应答，与植物的耐逆性相关。