抑制肿瘤转移的siRNA及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制肿瘤转移的siRNA及其应用。本发明提供了一种双链核酸，为如下(a)或(b)：(a)由序列表的序列1所示单链核酸和序列表的序列2所示单链核酸形成的双链核酸；(b)由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA成的双链核酸。体外和体内试验结果均表明，本发明提供的siRNA可以特异高效地抑制NKCC1基因表达，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、浸润。本发明可以应用于HCC转移机理和肿瘤转移的生物标志物和临床治疗的药物靶点的研究，具有重大价值。

权利要求

1.如下的双链核酸在制备抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的产品中的应用；

所述癌细胞为肝癌细胞MHCC97H细胞株；

所述双链核酸，为如下（a）或（b）：

（a）由序列表的序列1所示单链核酸和序列表的序列2所示单链核酸形成的双链核酸；

（b）由序列表的序列5所示的单链DNA和序列表的序列6所示单链DNA形成的双链核酸。

2.如下的重组质粒，在制备抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的产品中的应用；

所述癌细胞为肝癌细胞MHCC97H细胞株；

所述重组质粒为在PGPU6/GFP/neo RNAi载体的多克隆位点插入由序列表的序列5所示的单链DNA和序列表的序列6所示单链DNA形成的双链核酸得到的重组质粒。

3.一种抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的药物，它的活性成分为如下的双链核酸；

所述癌细胞为肝癌细胞MHCC97H细胞株；

所述双链核酸，为如下（a）或（b）：

（a）由序列表的序列1所示单链核酸和序列表的序列2所示单链核酸形成的双链核酸；

（b）由序列表的序列5所示的单链DNA和序列表的序列6所示单链DNA形成的双链核酸。

4.一种抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的药物，它的活性成分为如下的重组质粒；

所述癌细胞为肝癌细胞MHCC97H细胞株；

所述重组质粒为在PGPU6/GFP/neo RNAi载体的多克隆位点插入由序列表的序列5所示的单链DNA和序列表的序列6所示单链DNA形成的双链核酸得到的重组质粒。

5.抑制NKCC1蛋白表达的抑制剂在制备抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的产品中的应用；

所述NKCC1蛋白为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述抑制NKCC1蛋白表达的抑制剂为如下的双链核酸；

所述双链核酸，为如下（a）或（b）：

（a）由序列表的序列1所示单链核酸和序列表的序列2所示单链核酸形成的双链核酸；

（b）由序列表的序列5所示的单链DNA和序列表的序列6所示单链DNA形成的双链核酸；

所述癌细胞为肝癌细胞MHCC97H细胞株。

6.抑制NKCC1蛋白表达的抑制剂在制备抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的产品中的应用；

所述NKCC1蛋白为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述抑制NKCC1蛋白表达的抑制剂为如下的重组质粒；

所述重组质粒为在PGPU6/GFP/neo RNAi载体的多克隆位点插入由序列表的序列5所示的单链DNA和序列表的序列6所示单链DNA形成的双链核酸得到的重组质粒；

所述癌细胞为肝癌细胞MHCC97H细胞株。

说明书

抑制肿瘤转移的siRNA及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抑制肿瘤转移的siRNA及其应用。

背景技术

[0002] RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)机制，是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。通过内源性或外源性的能与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)在细胞内特异降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程。目前研究表明RNAi过程分4步进行：首先dsRNA被剪切成siRNA；随后这些siRNA被组装成无活性的蛋白复合体；在ATP供能下该复合体被激活；激活的复合体以siRNA为指导，识别并切割互补的靶RNA，从而阻止mRNA发挥作用。RNAi技术已成功应用于多种生物基因功能的研究。针对目的基因构建siRNA，利用RNAi技术关闭该基因的表达，根据表型的改变可以分析基因的功能。基因敲除技术需要较长时间永久性地关闭某个基因的表达，而RNAi技术则可在1周内，甚至2天内可控性地关闭10个基因。但通过这种方法进入细胞内的siRNA无法持久地沉默基因表达。要获得持续长久沉默基因的效果，必须通过质粒把shRNA转染到细胞中，使shRNA融合到细胞基因组中，利用细胞基因组的复制而复制，持续产生siRNA，这样才能长久地降解目的基因的mRNA。只有这样，RNAi技术才能被广泛用于疾病发病机制的研究中。

[0003] 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的、致死率极高的恶性肿瘤，每年约650,000人死于HCC，且其发病率有增高的趋势。该病多发于东南亚和非洲，其中约有50％以上发生于中国，位居我国癌症死亡率的第二位。HCC早期诊断较难，病情进展快，预后水平低。手术切除一直被认为是HCC获得根治的最佳手段，但即使是根治性切除，5年内仍有60-70％的病人会出现转移复发而危及生命，而局部治疗的转移复发率则更高。

[0004] HCC的转移是影响治疗效果和预后的最大障碍，是导致其高死亡率的主要原因。HCC的转移是一个连续、渐进的多步骤动态过程，HCC的转移过程与肿瘤细胞的黏附运动、细胞增殖、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成等多因素有关。尽管对HCC转移进行了大量研究，但目前HCC转移的分子机制仍不明确，尚未发现预测HCC复发转移的分子标志物和有效的治疗靶标。

[0005] 质膜作为细胞的表面结构，在细胞的黏附、运动、信号传导、物质运输等方面发挥重要的功能。质膜蛋白在肿瘤细胞从原发瘤部位脱落、细胞迁移运动、黏附并穿过血管着床于靶器官、与靶器官组织相互作用等多个环节中发挥重要作用，与肿瘤的转移密切相关。目前已发现的药物靶标大部分定位于细胞质膜，许多与肿瘤发生发展相关的质膜蛋白可作为重要的药物靶标。此外，部分质膜蛋白可从细胞表面脱落进入体液，成为潜在的生物标志物，如检测消化道肿瘤的癌胚抗原。因此针对HCC细胞质膜蛋白的研究不仅能促进HCC转移机理的揭示，还有利于发现检测肿瘤转移的生物标志物和临床治疗的药物靶点。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种抑制肿瘤转移的siRNA及其应用。

[0007] 本发明保护双链核酸，为如下(a)或(b)：

[0008] (a)由序列表的序列1所示单链核酸和序列表的序列2所示单链核酸形成的双链核酸；

[0009] (b)由序列表的序列5所示单链DNA和序列表的序列6所示单链DNA成的双链核酸。

[0010] 含有(b)所述的双链核酸的重组质粒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

[0011] 所述重组质粒可为在PGPU6/GFP/neo RNAi载体的多克隆位点插入所的双链核酸得到的重组质粒。

[0012] 所述双链核酸或任一所述重组质粒均可用于制备抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的产品。所述癌细胞可为肝癌细胞，优选为MHCC97H细胞株。

[0013] 本发明还保护一种抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的药物，它的活性成分为所述双链核酸或任一所述重组质粒。所述癌细胞可为肝癌细胞，优选为MHCC97H细胞株。

[0014] 本发明还保护抑制NKCC1蛋白表达的抑制剂在如下(A)或(B)中的应用：

[0015] (A)在制备治疗癌症的产品中的应用；

[0016] (B)在制备抑制癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭的产品中的应用。

[0017] 所述抑制NKCC1蛋白表达的抑制剂可为所述双链核酸或任一所述重组质粒。

[0018] 所述NKCC1蛋白为如下(I)或(II)：

[0019] (I)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0020] (II)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭相关的由序列3衍生的蛋白质。

[0021] 所述NKCC1蛋白的编码序列如序列表的序列4所示。

[0022] 所述癌细胞可为肝癌细胞，优选为MHCC97H细胞株。

[0023] 所述癌症可为肝癌，具体可为MHCC97H细胞株引起的肝癌。

[0024] 体外和体内试验结果均表明，本发明提供的siRNA可以特异高效地抑制NKCC1基因表达，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、浸润。本发明可以应用于HCC转移机理和肿瘤转移的生物标志物和临床治疗的药物靶点的研究，具有重大价值。

附图说明

[0025] 图1为实时荧光定量PCR检测三株细胞中NKCC1mRNA水平的差异。

[0026] 图2为Western blot检测三株细胞中NKCC1蛋白水平的差异。

[0027] 图3为明胶酶谱法检测三株细胞中基质金属蛋白酶MMP-2的表达量。

[0028] 图4为实时荧光定量PCR检测转染siRNA后MHCC97H细胞中NKCC1的表达水平。

[0029] 图5为Western blot检测转染siRNA后MHCC97H细胞中NKCC1的表达水平。

[0030] 图6为实时荧光定量PCR检测shNKCC1质粒载体敲低效果。

[0031] 图7为Western blot检测shNKCC1质粒载体敲低效果。

[0032] 图8为敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞体外增殖能力的影响。

[0033] 图9为敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞体外迁移能力的影响(划痕愈合模型)。

[0034] 图10为明胶酶谱法检测转染shNKCC1质粒载体后基质金属蛋白酶MMP-2的表达量。

[0035] 图11为敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞体外侵袭能力的影响(Transwell)。

[0036] 图12为敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞裸鼠体内成瘤能力影响。

[0037] 图13为裸鼠体内肿瘤的石蜡包埋切片的H&E染色。

具体实施方式

[0038] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0039] 肝癌细胞株MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所，肝癌细胞株MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3转移能力依次增强。鸡抗人NKCC1一抗购自GenWay Biotech公司。抗鸡IgG二抗购自Abcam公司。鼠抗人GAPDH一抗购自ProteinTech Group。抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥公司。SYBR GREEN REAL TIMEMASTER Mix购自TOYOBO公TM
司。Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)购自株式会社同仁化学研究所。BD BioCoat TM
Matrigel Invasion Chamber购自美国BD公司。BCA法蛋白测定试剂盒购自Thermo。
TM
Lipofectamine 2000购自Invitrogen。化学发光剂为Supersignal West Pico，购自Thermo。引物由Invitrogen公司合成(PAGE纯化)。

[0040] NKCC1-F(上游引物)：5’-ATCAATTTTTCAGTATTCCATGCATC-3’；

[0041] NKCC1-R(下游引物)：5’-ACGCCATCCTGGAGATTTTG-3’。

[0042] GAPDH-F(上游引物)：5’-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’；

[0043] GAPDH-R(下游引物)：5’-TTGAGGTCAATGAAGGGGTCA-3’。

[0044] 实施例1、NKCC1siRNA的发现

[0045] 一、比较不同转移能力肝细胞癌细胞株中NKCC1的mRNA和蛋白表达水平[0046] 1、比较不同转移能力肝细胞癌细胞株中NKCC1的mRNA水平

[0047] 分别将MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3进行如下操作：

[0048] (1)提取细胞总RNA，反转录为cDNA；

[0049] (2)以步骤(1)中的cDNA为模板，采用NKCC1-F和NKCC1-R组成的引物对进行实时荧光定量PCR(靶序列为NKCC1基因片段，约50bp)；以GAPDH基因为内参基因(采用GAPDH-F和GAPDH-R组成的引物对，靶序列118bp)。

[0050] 设置三次重复实验，结果取平均值。以MHCC97L中靶序列的表达量为1，计算MHCC97H和HCCLM3中靶序列的相对表达量(Ratio)，见图1。随着转移能力的增强，NKCC1的mRNA水平在细胞中逐渐增高，说明NKCC1可能参与了HCC的转移过程。

[0051] 2、比较不同转移能力肝细胞癌细胞株中NKCC1的蛋白表达水平(Western blot)[0052] 分别将MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3进行如下操作：

[0053] (1)将细胞接种于添加10％FBS(澳大利亚PAA公司)的DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)中，37℃、5％CO2条件下培养，待细胞生长至80％汇合度时，收集细胞。

[0054] (2)用细胞裂解液[4％SDS，2％DTT，120mM Tris-Cl(pH6.8)，5mM氟化钠，1mM矾酸钠，10mM焦磷酸钠，蛋白酶抑制剂(Cocktail)]裂解细胞，然后4℃、10000g离心15min，收集裂解液上清，即为细胞总蛋白。

[0055] (3)将细胞总蛋白在95℃下煮5min，然后进行12％SDS-PAGE电泳，蛋白充分分离后转移到NC膜上，于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温封闭1h，取出膜用TBST溶液洗涤3min×5次，将膜在合适的分子量处剪开，用鸡抗人NKCC1一抗(1∶1000稀释)室温孵育2h，然后TBST洗膜3min×5次，与抗鸡IgG二抗(1∶10000稀释)室温孵育1h，将膜与化学发光试剂孵育5min进行显色反应，在暗室中压X胶片曝光，洗胶片；内参为GAPDH，采用鼠抗人GAPDH一抗(1∶10000稀释)和抗鼠IgG二抗(1∶2000稀释)。

[0056] (4)对条带进行光密度扫描，检测各组NKCC1蛋白和内参GAPDH蛋白所对应条带A值，然后将ANKCC1/AGAPDH的比值进行统计学分析(Quantity One软件)。

[0057] 结果见图2。随着转移能力的增强，NKCC1的蛋白水平在细胞中逐渐增高，表明NKCC1与HCC的转移相关。

[0058] 二、比较不同转移能力的肝细胞癌细胞株中基质金属蛋白酶MMP-2的表达量(明胶酶谱法)

[0059] 分别将MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3进行如下操作：

[0060] (1)用无血清的DMEM高糖培养基培养细胞24h后，得到无血清细胞培养上清液。

[0061] (2)将无血清细胞培养上清液与2×上样缓冲液(0.125mol/L Tris-HCl、pH6.8、20％甘油、4％SDS、0.002％溴酚蓝)按1∶1的体积比混合后静置10分钟。

[0062] (3)将步骤(2)的混合液进行恒压125V的10％SDS-PAGE(含0.1％明胶)电泳，结束后将凝胶置1×复性缓冲液(Invitrogen)室温振荡洗脱2次，每次40分钟；弃复性缓冲液，加1×孵育缓冲液(Invi trogen)室温振荡平衡30分钟；将凝胶置新鲜1×孵育缓冲液中，37℃孵育至少4h；考马斯亮蓝染液染色30分钟；用脱色液脱色至亮带出现。

[0063] 设置三次重复实验，结果取平均值。

[0064] 电泳结果见图3B。以MHCC97L中MMP的表达量为1，计算MHCC97H和HCCLM3中MMP-2的相对表达量(Ratio)，见图3A。结果显示随着转移能力的增强，MMP-2的分泌量依次增高。

[0065] 三、NKCC1 siRNA的发现

[0066] 通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中获取人NKCC1 mRNA的全长序列(NM_001046.2)，设计干扰NKCC1基因的siRNA(siNKCC1-2)和阴性对照siRNA(siNKCC1-NC)。

[0067] siNKCC1-2是由正义链和反义链组成的双链核酸，序列如下：

[0068] 正义链：5’-CGAUUUAGAUACUUCCAAAtt-3’(序列表的序列1)；

[0069] 反义链：3’-AGGCUAAAUCUAUGAAGGUUU-5’(序列表的序列2)。

[0070] siNKCC1-NC是由正义链和反义链组成的双链核酸，序列如下：

[0071] 正义链：5’-UUCUCCGMCGUGUCACGUtt-3’；

[0072] 反义链：3’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5’。

[0073] 实施例2、siNKCC1-2在体外对MHCC97H细胞NKCC1基因表达的影响[0074] 一、分组转染

[0075] 将MHCC97H细胞均匀铺在24孔板中常规培养12h，然后分为3组分别进行如下转染：

[0076] MHCC97H组(Control)：每孔加入500微升含有10％(体积百分含量)灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基；每孔加入2微升TMLipofectamine 2000。

[0077] siNKCC1-NC组：每孔加入500微升含有10％(体积百分含量)灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基；每孔加入2微升TMLipofectamine 2000；每孔加入1微升siNKCC1-NC。

[0078] siNKCC1-2组：每孔加入500微升含有10％(体积百分含量)灭活的胎牛血清、TM100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基；每孔加入2微升Lipofectamine
2000；每孔加入1微升siNKCC1-2。

[0079] 转染12h后更换为DMEM高糖培养基，继续培养36h后进行步骤二的检测。

[0080] 培养条件：37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱。

[0081] 二、siNKCC1-2对NKCC1基因的敲低效果

[0082] 1、mRNA水平检测

[0083] 各组分别进行如下处理：

[0084] (1)收集细胞，提取RNA，反转录为cDNA；

[0085] (2)以cDNA为模板，采用NKCC1-F和NKCC1-R组成的引物对进行实时荧光定量PCR(靶序列为NKCC1基因片段，约50bp)。

[0086] 设置三次重复实验，结果取平均值。

[0087] 以MHCC97L组中靶序列的表达量为1，计算siNKCC1-NC组和siNKCC1-2组中靶序列的相对表达量(Ratio)，结果见图4。与MHCC97L组及siNKCC1-NC组相比，siNKCC1-2组中NKCC1的mRNA水平显著降低。结果表明，转染siNKCC1-2后抑制了NKCC1基因的表达。

[0088] 2、蛋白水平检测

[0089] 各组分别收集细胞，提取蛋白，进行Western blot。采用鸡抗人NKCC1一抗(1∶1000稀释)和抗鸡IgG二抗(1∶10000稀释)检测NKCC1蛋白。内参蛋白为GAPDH蛋白，采用鼠抗人GAPDH一抗(1∶2000稀释)和抗鼠IgG二抗(1∶10000稀释)检测。

[0090] 结果见图5。与MHCC97L组及siNKCC1-NC组相比，siNKCC1-2组中NKCC1蛋白水平显著降低。结果表明，转染siNKCC1-2后抑制了NKCC1基因的表达。

[0091] 实施例3、稳定敲低NKCC1的细胞株的构建及其相关参数的鉴定

[0092] 一、稳定敲低NKCC1的细胞株的构建

[0093] 1、重组质粒的构建

[0094] 将siNKCC1-2的编码DNA插入PGPU6/GFP/neo RNAi载体(上海吉玛制药技术有限公司)的BamH I酶切位点和Bbs I酶切位点之间，得到重组质粒shNKCC1。

[0095] siNKCC1-2的编码DNA序列如下：

[0096] 正义链：5’-CGATTTAGATACTTCCAAAtt-3’(序列表的序列5)；

[0097] 反义链：3’-AGGCTAAATCTATGAAGGTTT-5’(序列表的序列6)。

[0098] 经测序证实克隆的RNAi打靶序列100％正确；重组质粒shNKCC1可同时表达GFP，用于判断转染效率。

[0099] 2、稳定敲低NKCC1的细胞株的构建

[0100] 将重组质粒shNKCC1用LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)转染到MHCC97H细胞中，转染后的细胞于添加10％FBS(澳大利亚PAA公司)的DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)中培养，然后加入0.4mg/ml G418进行筛选，待细胞形成单克隆后，挑取带有荧光的单克隆进行培养，得到稳定敲低NKCC1表达水平的细胞株shNKCC1-2。

[0101] 3、对照细胞株的构建

[0102] 将siNKCC1-NC的编码DNA插入PGPU6/GFP/neo RNAi载体(上海吉玛制药技术有限公司)的BamH I酶切位点和Bbs I酶切位点之间，得到对照质粒。

[0103] siNKCC1-NC的编码DNA序列如下：

[0104] 正义链：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTtt-3’；

[0105] 反义链：3’-ACGTGACACGTTCGGAGAATT-5’。

[0106] 将对照质粒用LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)转染到MHCC97H细胞中，转染后的细胞于添加10％FBS(澳大利亚PAA公司)的DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)中培养，然后加入0.4mg/ml G418进行筛选，待细胞形成单克隆后，挑取带有荧光的单克隆进行培养，得到对照细胞株shNKCC1-NC。

[0107] 二、NKCC1质粒载体敲低效果的检测

[0108] 分别收集MHCC97H(Control)、shNKCC1-2和shNKCC1-NC的细胞，提取RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，在NKCC1-F和NKCC1-R的引导下进行实时荧光定量PCR。以MHCC97H细胞中目的基因片段(约50bp)的表达量为1，计算shNKCC1-2和shNKCC1-NC中目的基因片段的相对表达量(Ratio)。设置三次重复实验，结果取平均值。结果见图6。结果显示，与MHCC97H细胞及shNKCC1-NC相比，shNKCC1-2中NKCC1的mRNA水平显著下调，约60％。

[0109] 分别收集MHCC97H(Control)、shNKCC1-2和shNKCC1-NC的细胞，提取蛋白，进行Western blot。分别采用鸡抗人NKCC1一抗(1∶1000稀释)和抗鸡IgG二抗(1∶10000稀释)。内参为GAPDH，采用鼠抗人GAPDH一抗(1∶2000稀释)和抗鼠IgG二抗(1∶10000稀释)。结果见图7。结果显示，与shNKCC1-NC及MHCC97H细胞相比，shNKCC1-2中NKCC1的蛋白表达水平显著下调。

[0110] 三、稳定敲低NKCC1的细胞株的表型检测

[0111] 1、稳定敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞体外增殖能力的影响

[0112] 分别取对数生长期(70％-80％汇合度)的MHCC97H(Control)、shNKCC1-2和shNKCC1-NC的细胞，0.25％胰酶(Hyclone公司)消化成细胞悬液，将细胞稀释为大约1000个/μl接种于含有10％FBS的DMEM高糖培养基的96孔板中，37℃、5％CO2培养12小时，采用CCK-8试剂盒分别在0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天在酶标仪OD450nm处测量各孔的吸光值。设置三次重复实验，结果取平均值。结果如图8所示，shNKCC1-2组细胞的体外增殖能力与MHCC97H组细胞相比有显著的下降，而shNKCC1-NC组的细胞则与MHCC97H组细胞无显著差异，说明降低NKCC1的表达后MHCC97H细胞的增殖能力显著下降，即NKCC1参与了MHCC97H的增殖过程。

[0113] 2、稳定敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞体外迁移能力的影响(划痕愈合模型)[0114] 首先用记号笔在六孔培养板背面沿直尺划平行线，每条线之间间隔1cm；5
MHCC97H(Control)、shNKCC1-2和shNKCC1-NC的细胞分别以2×10 个/ml接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱培养；待细胞生长至60-70％汇合度后，用200μl枪头沿直线做划痕，划痕与记号笔所画直线垂直，一般做三道，然后用PBS清洗细胞三次，再加入含有1％灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基继续培养；分别在划痕后0h、24h和48h拍照。测量细胞划痕宽度。设置三次重复实验，结果取平均值。结果如图9所示(A为照片，B为细胞划痕愈合率)。shNKCC1-2组细胞的划痕愈合速率与MHCC97H组细胞相比有显著的下降，而shNKCC1-NC组的细胞则与MHCC97H组细胞无显著差异，说明降低NKCC1的表达后MHCC97H细胞的迁移能力显著下降，即NKCC1参与MHCC97H的迁移过程，进而影响了MHCC97H细胞的转移过程。

[0115] 3、稳定敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞对MMP分泌量的比较

[0116] 分别检测MHCC97H(Control)、shNKCC1-2和shNKCC1-NC的细胞中基质金属蛋白酶MMP-2的表达量(明胶酶谱法)，方法同实施例1的步骤二。设置三次重复实验，结果取平均值。电泳结果见图10B。以MHCC97L中MMP的表达量为1，计算shNKCC1-2和shNKCC1-NC中MMP-2的相对表达量(Ratio)，见图10A。图10显示与shNKCC1-NC及正常MHCC97H细胞相比，shNKCC1-2细胞的MMP分泌量明显减少，说明NKCC1参与了MHCC97H的浸润过程。

[0117] 4、稳定敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞体外侵袭能力的影响(Transwell实验)[0118] 制备细胞悬液前先让细胞无血清饥饿24h；分别取对数生长期(70-80％汇合度)的MHCC97H(Control)、shNKCC1-2和shNKCC1-NC三组细胞，消化后，离心弃去培养基，用6
PBS清洗，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度为1×10/ml；把小室从-20℃取出，放置至室温；在小室和24孔板中加入预温的无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱孵育2小时；下室加入750μl含10％FBS的DMEM培养基，用无菌镊将Transwell小室放入有培养基的孔内，必须确认膜下没有气泡，并避免小室在液体中形成角度。分别取三组细胞悬液500μl加入Transwell小室中，每组细胞设3个平行复孔实验。置于培养箱中常规培养24h；24h后从培养箱中取出Transwell小室，用棉签蘸无血清的DMEM培养基擦拭除去Transwell小室上层的胶和细胞；将Transwell小室置于甲醇中固定10min，PBS清洗5min×3次；将Traswell小室移入0.1％结晶紫中，染色30min，PBS清洗5min×3次；取出Transwell小室，底面朝上，置于光镜下，膜上滴一滴水，上置盖玻片；每个滤膜随即选取
5个视野，计数穿膜细胞数，以穿膜细胞的数目表示细胞的相对侵袭能力。结果如图11所示(B为照片；A为每个视野中的细胞数量，5个视野的平均值)。shNKCC1-2的穿膜细胞数与MHCC97H相比有显著的下降，而shNKCC1-NC与MHCC97H无显著差异，说明降低NKCC1的表达后MHCC97H细胞的侵袭能力显著下降，即NKCC1参与MHCC97H的侵袭过程，进而影响了MHCC97H细胞的转移过程。

[0119] 5、稳定敲低NKCC1表达对MHCC97H细胞体内成瘤能力的影响(裸鼠荷瘤实验)[0120] 分别用生理盐水、MHCC97H(Control)、shNKCC1-2和shNKCC1-NC分别接种小鼠(BalB/C-nu/nu小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每种处理5只小鼠。

[0121] 收集约5×106个对数生长期的细胞于200μl生理盐水中重悬，尽快接种到6周龄的雄性裸鼠脾脏中，术后8周解剖小鼠，肉眼观察肝脏成瘤情况。肝脏照片见图12B。肝脏重量见图12A。然后取其肝脏用4％福尔马林固定，用石蜡包埋切片后采用H&E染色观察肿瘤细胞的浸润情况。石蜡包埋切片的H&E染色结果见图13，箭头标注肿瘤细胞侵袭区域。shNKCC1-2处理组的成瘤情况与MHCC97H处理组相比较明显减弱，而shNKCC1-NC处理组与MHCC97H处理组相比无显著差异。shNKCC1-2处理组的肝脏重量与MHCC97H处理组相比有显著下降，而shNKCC1-NC处理组与MHCC97H处理组相比无显著差异。shNKCC1-2处理组的肿瘤细胞侵袭区域与MHCC97H处理组相比有显著下降，而shNKCC1-NC处理组与MHCC97H处理组相比无显著差异。这些体内实验结果说明降低NKCC1的表达后MHCC97H细胞的侵袭能力显著下降，即NKCC1参与MHCC97H的侵袭过程，进而影响了MHCC97H细胞的转移过程。