柑橘早花基因PtELF5的分离克隆及应用

摘要

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳中分离、克隆得到枳(Poncirus trifoliata)EARLYFLOWERING 5基因，申请人将这个早花基因命名为PtELF5。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；它包含1623bp的开放阅读框，编码540个氨基酸，等电点为9.62，预测的分子量为57.2kD。将本发明所述的基因PtELF5导入到拟南芥中进行功能验证，获得的转基因拟南芥植株明显早花，营养生长期明显缩短。证明PtELF5基因在柑橘成花调控的过程中是正调控因子，可以通过过量表达PtELF5基因培育短童期的柑橘新品种。

权利要求

1.一个分离克隆的柑橘早花基因PtELF5，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的柑橘早花基因PtELF5，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：

2所示。

3.权利要求1或2所述的柑橘早花基因PtELF5在缩短拟南芥童期中的应用。

说明书

柑橘早花基因PtELF5的分离克隆及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个柑橘成花相关基因PtELF5的分离克隆、功能验证及其应用。PtELF5基因是柑橘成花过程中的一个关键的正调控因子，过量表达PtELF5能够显著的缩短童期模式植物拟南芥的童期，导致早花。所以该基因可能是柑橘开花的一个正调控因子，促使柑橘提早开花，进入成年期继而能够为加速柑橘育种奠定基础。

背景技术

[0002] 果树大多为多年生木本植物，从种子播种至首次开花结实要要经历漫长的童期。童期短的如桃、李，3-4年开花，长的如柑橘、核桃，8-12年开花，更长的如银杏、香榧等，童期长达十数年甚至数十年。由于个体体积大、童期长、遗传背景复杂，极大地阻碍了多年生木本植物，特别是以收获花器、果实和种子为主的果树和经济林木的遗传学研究、育种进程和新品种推广。因此，揭示木本果树童期发育和成花机理具有重要的理论和实践意义。

[0003] 柑橘是世界第一大水果，为仅次于小麦和玉米的世界第三大国际贸易农产品。由于柑橘童期较长，一般为6-8年不等。过长的童期使柑橘的遗传育种周期极其漫长，再加上珠心胚干扰、性器官败育以及遗传上高度杂合等因素影响，使得柑橘的常规育种和遗传机制的研究困难重重、进展缓慢。因此揭示柑橘成花机理的分子机理，不仅有助于加速柑橘育种进程、改变柑橘坐果时期和果品成熟期，而且具有重要的理论意义，对于遗传机理研究、育种实践和新生产技术的发展也有潜在的深远意义。

[0004] 我们在前期国家自然科学基金资助下，发掘了对木本植物童期研究有重要价值的早花变异-早实枳(Pang，et al.2006，提供遗传资源来源披露登记表和发放该资源的承诺证明)。早实枳(Precocious trifoliate orange，Poncirus trifoliata L.Raf.)是在湖北宜昌发现的一株变异，在播种当年即有20％开花，第二年即可全部开花，且具有矮化和一年多次开花的特性(Zhang，et al.2008；Zhang，et al.2009；Zhang，et al.2009)。早实枳作为一个天然的枳类早花突变体，只需要经过短暂的营养生长阶段便可以进入生殖生长阶段，故被认为是较好的研究木本植物开花决定的材料。前期通过对早实枳与普通枳分别在童期和成年期的二维抑制差减杂交(2D-SSH)，筛选到与阶段发育相关的532条ESTs和数十条成花相关基因，如PtTFL1、PtFLC、PtFT、PtBAM和PtF-box等。其中PtELF5基因为早实枳中分离到的一个新基因，它因在编码序列与拟南芥的EARLYFLOWERING 5(ELF5)存在一定的同源性而命名但是它们之间的功能是相反的(Noh et al，2004)，在拟南芥中它是一个开花阻遏基因，在柑橘中是一个开花促进基因。通过原位杂交发现，在花芽分化转变阶段表达量明显升高。该基因在成花转变的过程中能够抑制开花阻遏基因PtFLC的表达。此外，在模式植物拟南芥中超表达该基因能够显著缩短植物的童期，提前开花。在过去很多分离的开花基因都是拟南芥的同源基因，而对木本植物的本身特有基因发掘较少，而这个基因虽然与拟南芥ELF5有一定的同源性，但是同源性较低，且功能相反，我们推测该基因为木本植物的特有的早花基因，可能在缩短木本植物童期方面有着更加广泛的应用。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于分离了一个控制柑橘童期发育的基因，这个基因在模式植物和近源物种中都没有同源序列，仅仅与拟南芥的EARLYFLOWERING 5(ELF5)存在一定的相似性，申请人将其命名为PtELF5，但是在拟南芥中ELF5为一个阻遏开花基因，而在本发明中PtELF5是成花促进因子，该基因能够大大缩短植物的童期阶段。所以应用该基因能够培育一种童期大大缩短且经济价值和品质较高的柑橘品种。

[0006] 本发明通过以下技术方案实现：

[0007] 本发明从枳壳(Precocious trifoliate orange，Poncirus trifoliata L.Raf.)中分离得到一个调控植物童期发育的新基因PtELF5，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示(其中137-1759为该基因的编码区)，其编码的的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，它编码540个氨基酸。

[0008] 所述的基因PtELF5与柑橘的童期发育有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与35S启动子结合后直接转入模式植物，转基因植株与野生型对照相比较呈现了极端的早花，且没有花器官异常现象，为进一步利用该基因奠定了基础；并且通过原位杂交发现在成花转变的过程中该基因呈现了很高的表达，说明与成花关系密切。实时定量研究发现该基因能够抑制开花阻遏子PtFLC的表达，继而导致植物早花。

[0009] 本发明为缩短木本植物童期提供了一种新的方法。该方法是通过转基因技术超表达PtELF5，抑制开花抑制子PtFLC的表达进而缩短童期。采用这类转基因技术创造短童期植物是传统育种技术所不能达到的。

[0010] 在本发明的实施例部分，申请人阐述了PtELF5基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。为柑橘育种奠定基础。更详细的技术发明细节由以下实施例给出，但并不是限制该发明的保护范围。

附图说明

[0011] 序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的PtELF5基因的核苷酸序列，序列长度为2271bp，其中137-1759为编码区。

[0012] 序列表SEQ ID NO：2是PtELF5基因编码的氨基酸序列。

[0013] 图1是本发明的技术流程图。

[0014] 图2(A)早实枳童期和成年期总RNA琼脂糖电泳检测结果，M：DNA分子量标准DL20001：童期材料的总RNA；2：成年期材料的总RNA。(B)早实枳童期和成年期分离的mRNA电泳检测结果，M：DNA分子量标准DL2000；1：童期材料的mRNA；2：成年期材料的mRNA。(C)接头连接效率分析，M：DNA分子量标准DL2000；2，4：Tester-1和Tester-2用Actin内部特异引物扩增；1，3：Tester-1和Tester-2分别用Actin内部特异引物与接头引物扩增。(D)随机抽取的用于检测插入片段大小的24克隆。(E)PCR检测差减效率。

[0015] 图3差减文库的反向Northern的筛选，箭头表示阳性克隆。(A)表示反向探针杂交的膜。(B)表示正向探针杂交的膜。

[0016] 图4(A)PtELF5和PtFLC在童期早实枳中的相对定量。(B)PtELF5和PtFLC在成年期早实枳中的相对定量。(C)PtELF5和PtFLC在成年期早实枳不同组织中的相对定量。其中春梢为顶端的分生组织，果实为花后30天。所有基因的表达用Actin均一化，所有的实验进行4次重复。

[0017] 图5通过原位杂交检测PtELF5(a、b、c、d)和PtFLC(e、f、g、h)在早实枳顶端分生组织不同的发育阶段的表达。(a、e)为童期顶端的分生组织。(b、f)为成年期营养时期的顶端分生组织。(c、g)为花分化时期的顶端分生组织。(d、h)为花完全分化时期。(i)为用正义的PtELF5的杂交结果。比例尺为100微米。

[0018] 图6是本发明的其中一个实施例的植物超表达载体35S::PtELF5构建流程。

[0019] 图7PtELF5在哥伦比亚型拟南芥中的表型分析。a：生长在长日条件下野生型拟南芥；b：生长在长日条件下的转基因拟南芥。此外与野生型(c)相比较转基因植株(d)没有呈现出花器官的异常，说明该基因仅仅是成花调控基因。

具体实施方式

[0020] 实施例1：利用抑制性差减杂交分离相关的调控基因

[0021] 1.1植物材料和RNA的分离

[0022] 以枳壳(Poncirus trifoliata L.Raf.)的突变体“早实枳”(张金智等，Identification ofearly-flower-related ESTs in an early-flowering mutant of trifoliate orange(Poncirus trifoliata)by suppression subtractive hybridization and macroarray analysis.Tree Physiology 200828：1449-1457)为起始材料，取早实枳不同发育阶段的春梢和童期不同时期顶端的分生组织为材料，成年期和童期的“早实枳”都种植在华中农业大学国家柑橘育种中心苗圃，成年期早实枳为3-5年的树，并多次开花。因为春梢是早实枳成花的主要部位，所以成年期材料以春梢的顶芽和随后的五个芽为材料，分别在自然年份的1、3、5、7、9、11月份取材。早实枳种子在成功催芽后移栽于自然生长的条件下，期间用营养液浇灌，确保其生长状况良好，童期的材料分别在3、6、9、12月份取顶端分生组织，成年期和童期在取材时分别取三棵树，混合后液氮速冻-80℃保存。

[0023] 不同时期的早实枳组织按照张金智等的方法分离RNA(Zhang，et al.2008)。利TM用Clontech PCR-Select cDNA Subtractive Kit(Clontech，USA)进行抑制性差减杂交，分别构建正反差减的文库。在正向文库中，童期作为驱赶子(Driver)，成年期作为检测子(Tester)，这样在正向差减文库中得到与早花有关的基因；在反向文库中，童期作为检测子，成年期作为驱赶子，具体方法如下：

[0024] 1.2第一链cDNA合成

[0025] 1)对于Tester，Driver各按以下顺序混合于一个0.2ml离心管中；

[0026] mRNA(4μg) 2-4μl

[0027] cDNA synthesis Primer(10μmol/L) 1μl

[0028] 如需要加入无RNA酶的水至总体积5μl；

[0029] 2)PCR仪中70℃2min，置于冰上复性2min；短暂离心；

[0030] 3)每管加入下列组分：

[0031] 表1：第一链反转录的成分(试剂盒提供)

[0032]

[0033] 4)轻轻震荡并简短离心，在PCR仪中，42℃1.5小时；

[0034] 5)置于冰上，终止合成第一条链，并立即进入下一个程序。

[0035] 1.3第二链cDNA合成

[0036] 1.加入以下成分到第一链cDNA合成的反应管中：

[0037] 表2：第二链合成的成分(试剂盒提供)

[0038]

[0039] 2.混匀并简短离心，16℃温浴2小时，加入2μl T4DNA Polymerase混匀；

[0040] 3.16℃30min，加入4μl 20×EDTA/Glycogen Mix终止反应；

[0041] 4.加入100μl酚∶氯仿∶异戊醇(体积比：25∶24∶1)，充分震荡，14000g/min离心10min；

[0042] 5.转移上清至一新管，加入100μl氯仿∶异戊醇(体积比：24∶1)至水相；

[0043] 6.在分离的上清中加入40μl 4mol/L醋酸铵和300μl 95％乙醇，充分振荡混匀，室温14000g/min离心20min；弃上清，加入500μl 80％的乙醇；

[0044] 7.用移液器小心吸打混匀，室温14000g/min离心10分钟；

[0045] 8.小心弃上清液，空气干燥10分钟，用50μl的水溶解，取5μl到另一管子中，保存于-20℃。

[0046] 1.4RsaI的酶切

[0047] 1)加入下列成分到一离心管中：

[0048] 表3：酶切反应的成分(试剂盒提供)

[0049]

[0050] 2)震荡混匀并简短离心，37℃酶切6小时；

[0051] 3)取5μl酶切产物分析酶切效率，加入2.5μl 20x EDTA/Glycogen Mix终止反应；

[0052] 4)加入50μl酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，充分震荡混匀；

[0053] 5)14000g/min离心10min，转移上清液至一新0.5ml离心管；

[0054] 6)加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，充分震荡混匀，14000g/min离心10min，转移上清于一新0.5ml管；

[0055] 7)加入25μl 4mol/L醋酸铵和187.5μl 95％乙醇，充分震荡完全混匀；

[0056] 8)14000g/min离心20min，加200μl 80％乙醇；

[0057] 9)14000g/min离心10min，超净台上风干5-10min，溶于5.5μl无菌水，-20℃保存；

[0058] 10)将留出的5μl酶切产物与上一步存留的双链cDNA利用1.2％琼脂糖进行电泳检测。

[0059] 1.5接头的连接

[0060] 1)从上步5.5μl酶切cDNA中取1μl加入5μl无菌水；

[0061] 2)准备连接接头的混合液(Master Mix)放入一个0.5ml离心管加入以下组分：

[0062] 表4：连接反应的成分(试剂盒提供)

[0063]

[0064] 3)建立连接体系，取稀释后的酶切Tester cDNA分为两管，加入不同接头组成两个连接体系：

[0065] 表5：连接反应的成分(试剂盒提供)

[0066]

[0067] 4)在一个新管中混合2μl Teste1和2μl Tester 2；

[0068] 5)将以上各管简短离心混匀后，并于16℃温浴过夜；

[0069] 6)加1μl EDTA/Glycogen Mix终止反应；

[0070] 7)72℃5min灭活T4连接酶，短暂离心；

[0071] 8)取未差减cDNA稀释于1ml H2O中，用于后面的PCR扩增，保存样品于-20℃。

[0072] 1.6连接效率的检测

[0073] 1)以 连 接 反 应 后 的Tester-1 和Tester-2 为 模 板，分 别 以 持 家 基因 Actin 的 3 ′ (ActinS：5’-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3)、5 ′ 端 (ActinA：5’-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3’)和PCR primerl(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)为引物进行PCR扩增，比较不同引物对应产物的扩增效率，来判断连接效率。

[0074] 2)稀释连接产物(Tester 1和Tester 2)，各取1μl分别加入到100μl的无菌水中，在4个离心管中混合以下组分：

[0075] 表6检测体系的主要引物成份

[0076]

[0077] 3)准备混合反应液(Master Mix)，按顺序加入以下成份：

[0078] 表7检测体系的主要引物成份(试剂盒提供)

[0079]

[0080] 4)充分震荡混匀；

[0081] 5)各取22μl Master Mix到第2步的管中，充分震荡混匀；

[0082] 6)温浴混合反应体系75℃5min，立即开始热循环(不可从PCR仪中拿出)：

[0083] 94℃ 30s

[0084]

[0085] 7)每体系取5μl在2.0％琼脂糖/EB胶中检测。

[0086] 1.7第一次杂交

[0087] 1)差减杂交进行杂交前，先将4×Hybridization buffer室温放置30min，如果出现沉淀，在37℃加热10分钟来溶解沉淀。每个文库分别进行正向和反向差减杂交，正向比较方案如下，反向则为正向检测样本与驱赶样本的互换；

[0088] 表8第一次杂交体系的主要成份(试剂盒提供)

[0089]

[0090] 2)用一滴矿物油覆盖样品，并短暂离心，使矿物油完全覆盖样品的表面；

[0091] 3)样品置于98℃1.5min后；

[0092] 4)68℃PCR仪中杂交8h(注意一定不可超过12h，到时间后立即进入下一阶段)。

[0093] 1.8第二次杂交

[0094] 注意：不要将杂交的样品移出PCR仪。第一次杂交后的两个样本将被混合到一起，立即加入新鲜的变性driver cDNA。

[0095] 1)将下列组分装入一个无菌管：

[0096] 表9第二次杂交体系的主要成份(试剂盒提供)

[0097]

[0098]

[0099] 2)取1μl上述混合物到一个0.5ml管；

[0100] 3)98℃温浴，1.5min；

[0101] 4)进行以下程序以达到使杂交样1，2及新鲜的driver同时混合的目的；

[0102] 5)从PCR仪上取出刚刚变性的driver，通过以下步骤可同时混合driver和杂交样品1和2，这样可以保证两个杂交样品和新变性的driver同时混合；

[0103] a)将移液枪调至15μl；

[0104] b)轻轻将枪头触及矿物油与杂交样2的界面；

[0105] c)将杂交样2全部吸入枪头内；

[0106] d)从管中取出枪头并吸入少量的空气；

[0107] e)重复步骤b-d将新的driver cDNA吸入枪头内；

[0108] f)将枪头内混合的样品全部转入杂交样1所在离心管；

[0109] g)上下反复吸打充分混匀；

[0110] 6)简短离心使样品全部沉于管底，68℃过夜；

[0111] 7)加入200μl溶解液(试剂盒提供)到反应管，反复吸打混匀；

[0112] 8)68℃7min，保存于-20℃冰箱。

[0113] 1.9利用Actin检测消减效果

[0114] 1.分别取未进行消减杂交和消减杂交后的第二次抑制性PCR产物各3μl并加27μl双蒸水作10倍稀释，分别以稀释后的产物为模板，用Actin引物验证抑制性消减杂交效果；

[0115] 2.从以上每管中取1μl分别加入0.5ml离心管；

[0116] 3.按以下顺序配制反应基液(Master Mix)：

[0117] 表10检测消减效果反应的主要PCR成份

[0118]

[0119] 4.充分混匀，向2步中的各管加入反应基液24μl；

[0120] 5.加入一滴石蜡油，简单离心使液体聚于管底；

[0121] 6.PCR扩增，循环参数为：

[0122] 94℃ 30s

[0123]

[0124] 7.在完成18个循环后，分别取消减和未消减PCR产物各5μl置于新离心管中，留作后续的验证。剩余20μlPCR产物重新放回PCR仪按前述条件继续进行循环，同样于23、28及33个循环，分别取消减和未消减产物各5μl留作电泳；

[0125] 8.分别取上述不同循环次数的PCR产物5μl在1XTBE缓冲液2.0％琼脂糖胶上电泳观察产物形成情况。

[0126] 1.10两次PCR扩增

[0127] 1)模板的准备：取1μl稀释的杂交样品和1μl未差减Tester放于0.2ml离心管中；

[0128] 2)按下表顺序在新离心管中加入以下试剂准备PCR Master Mix：

[0129] 表11第一次PCR反应的主要成份

[0130]

[0131] 3)快速离心混匀，在每一个样品中加入24μl MasterMix；

[0132] 4)在每一离心管中加入一滴矿物油，75℃温浴5min延伸接头；

[0133] 5)立即开始PCR：

[0134] 94℃ 5min

[0135]

[0136] 72℃ 10min

[0137] 6)每个样品各取8μl用于分析PCR结果；

[0138] 7)取第一次PCR产物3μl稀释于27μl无菌水中；

[0139] 8)取1μl步骤7的稀释液放于标记好的离心管中；

[0140] 9)在离心管中按下表顺序加入下列成分准备第二次PCR Master Mix：

[0141] 表12第二次PCR反应的主要成份

[0142]

[0143] 10)充分混匀并快速离心，加24μlMaster Mix于步骤10的离心管中；

[0144] 11)开始运行PCR：

[0145] 94℃ 25s

[0146]

[0147] 72℃ 10min

[0148] 12)取8μl用于分析PCR结果；

[0149] 13)保存于-20℃备用；

[0150] 1.11PCR产物的回收与纯化

[0151] 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，用洁净的刀片在紫外灯下将片段小心切下放入2.0ml离心管，操作按上海生物工程技术有限公司凝胶回收试剂盒说明书进行：

[0152] (1)按500μl/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer，置于55℃水浴中，加热溶胶，每2min混匀一次，直至胶彻底融化；

[0153] (2)将含有目的片段的Binding Buffer转移至放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2-3min，12000g/min离心0.5min；

[0154] (3)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500μl的Washbuffer，室温12000g/min离心0.5min；

[0155] (4)重复步骤3次；

[0156] (5)取下UNIQ-10柱，再次将UNIQ-10柱放入收集管中，室温12000g/min离心2-3min；

[0157] (6)将UNIQ-10柱放入一个1.5ml的无菌的离心管中，在柱子膜中央加25μl的无菌水，55℃水浴放置5min；

[0158] (7)室温12000g/min离心2-3min，1.5ml离心管中收集的液体即为回收的DNA片段。

[0159] 1.12感受态细胞的制备

[0160] (1)挑取DH5α大肠杆菌原种菌，用接种环在LB琼脂板上划线培养，挑取白色饱满的新鲜单菌落，接种到100ml LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养至OD600达到0.4-0.5；

[0161] (2)将摇浑浊的菌液转移至一预冷的无菌50ml离心管，冰浴10min，4℃4500g/min离心10min，倒掉上清以回收沉淀；

[0162] (3)加入10ml预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌沉淀，冰浴30min，4℃4500g/min离心10min，倒掉上清再次回收细菌沉淀；

[0163] (4)加入3ml 0.1mol/LCaCl2溶液重新悬浮细菌沉淀；

[0164] (5)加甘油至终浓度15％-20％，混匀分装成每管100μl，冻存于-80℃。

[0165] 1.13目的产物的克隆

[0166] 将纯化的目的产物与pGMT载体(Promega，美国)16℃连接过夜。连接反应体系为：10×Ligation Buffer1.0μl，纯化产物5.0μl，T4DNA ligase 1.0μl，pGMT载体1μl，ddH2O 2μl，总体系为10μl。

[0167] (1)在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，涂抹10μl IPTG(β-半乳糖苷酶，100mg/ml)和40μlX-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，20mg/ml)，在超净台上暗置1h左右；

[0168] (2)取出大肠杆菌的感受态，放置冰上冻融，加入10μl连接产物，用移液枪轻轻吸打混匀，在冰上放置30min；

[0169] (3)热激：将离心管在42℃下水浴90s；

[0170] (4)冰镇：快速将离心管转移至冰浴，2-3min；

[0171] (5)复苏：每管加450μl液体LB培养基，在37℃摇床250转/min摇动1h；

[0172] (6)铺皿：取100μl菌液均匀涂布于已制备好的LB平板上；

[0173] (7)培养：37℃下倒置培养16h左右，即可观察到蓝白相间的菌落。白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色是载体自连的转化子；

[0174] (8)阳性克隆的鉴定：用灭菌牙签挑选白色的单菌落，放入盛有5ml液体LB培养基(50μg/ml氨苄青霉素)的三角瓶中，在37℃摇床上培养过夜(12-16h)。

[0175] 1.14差减文库的构建

[0176] 1)在384孔细菌培养板的每一孔中加入50μl LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)，挑取白色单菌落接种384孔培养板中；

[0177] 2)37℃培养12h，可见培养基变浑浊，在每一培养孔中，加入灭菌的甘油，至终浓度15％；

[0178] 3)将培养板置于4℃下静置2d，待甘油完全混匀后，-80℃保存。

[0179] 1.15杂交探针的制备

[0180] 依据德国Roche公司DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I的说明书，取大约3μg的质量较好的cDNA片段进行标记，共标记2个探针：正向差减产物和反向差减产物探针。为了消除接头共有序列对杂交信号的影响，正向与反向差减产物探针标记前分别用RsaI酶切除去接头序列。

[0181] 1.16插入片段的扩增与点膜

[0182] 以1μl培养过夜的菌液为模板，Nested PCR primer 2R(试剂盒提供，10μmol/L)和Nested PCR primer1(试剂盒提供，10μmol/L)引物各0.5μl，2.5μl 10×PCR2+
reaction buffer(+Mg )，0.5μl dNTP，0.2μl Tap(上海生工)，加水补齐25μl，循环条件为：94℃5min；94℃35s，68℃35s，72℃1.5min；35个循环，72℃10min，25℃保存。扩增完毕后，取8μl的PCR产物在1.2％EB胶上电泳检测，剔除插入太小的片段(小于200bp)以及双带产物。取5μl菌落PCR的产物与5μl新鲜配制的0.6mol/L NaOH充分混匀，取1.0μl的混合物对应点2张拷贝尼龙膜(Nylon membranes，positively charged，Grmany)，点膜完毕后将尼龙膜置于pH7.5的0.5mol/L Tris-HCl中中和5min，然后用双蒸水漂洗，120℃烘箱中烘烤40min。

[0183] 1.17杂交与显色

[0184] 杂交依照罗氏公司DIG试剂盒的说明书进行，杂交液中最终的探针浓度约为35ng/ml，42℃杂交过夜。用2×Saline-Sodium Citrate(SSC)+0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)25℃洗膜两次，每次5min，然后用0.5×SSC(0.1％SDS)洗脱液65℃洗膜两次，每次
15min。免疫反应过后，显色反应采用该试剂盒的NBT(四唑淡蓝)/BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐)体系显色，显色时间为1-16h，显色完毕用TE(pH 8.0)终止显色，利用凝胶成像系统在可见光下扫描显色结果。

[0185] 1.18差异克隆的选取

[0186] 在正向差减文库中对比两张重复膜的杂交信号，选取仅与正向差减探针有信号或者与正向差减探针杂交信号明显强于反向差减探针的克隆(信号强度在1.5倍以上)；在反向文库中与之相反，选出克隆利用T7或SP6引物单向测序在上海生工生物工程技术有限公司。

[0187] 1.19序列同源性检索

[0188] 利 用 VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)除去载体与接头序列得到EST片段。先在GenBank库中通过Blast搜索工具进行序列同源性比较，分析这些EST与那些基因有同源性及其与之匹配的氨基酸序列；然后在利用搜索柑橘数据库进行序列比对(http://harvest.ucr.edu/)；基因功能的判断标准参考水稻、拟南芥等草本模式植物的标准。

[0189] 本实施例的结果呈现出：采用CTAB法分离早实枳不同发育的时期的总RNA，经电泳检测28S和18SRNA的条带清晰，两者之间的比值在1.8-2.0之间，这说明总RNA保持完整，没有发生降解。同时点样孔干净，说明没有多酚、多糖和蛋白质的污染(图2A)。利用紫外分光光度计的检测表明：A260/280值在1.9左右，A260/230值在2.0左右，说明抽提RNA的完整性较好，纯度较高，适合下一步mRNA的分离。本实验中mRNA的纯化采用Oligotex mRNA分离试剂盒，分离的mRNA电泳检测在0.5-4kb之间，说明分离到的mRNA较完整(图2B)，为下一步试验奠定了良好的基础。用分光光度计调整mRNA的浓度到0.5mg/μl左右进行下一步的双链合成。

[0190] 双链cDNA合成及酶切效果cDNA合成的质量及RsaI酶切效果直接影响接头连接TM的效率和最终的差减效率。分别取4μg成年期与童期材料的mRNA，采用PCR-Select cDNA Subtraction Kit试剂盒(Clontech，USA)提供cDNA合成试剂合成cDNA双链，起始材料采用mRNA避免了合成cDNA的过程中由于DNA的存在可能造成的污染。从实验结果可以看出童期和成年期早实枳合成双链的cDNA大小都分布在0.5kb和4kb之间，在大小上基本符合植物转录本的特点，也和mRNA的大小比较一致，说明双链合成的十分成功。

[0191] 接头连接效率是直接影响差减效率的关键环节，连接效率至少要在25％以上，否则差减效率会大大下降。本实验对Tester-1和Tester-2接头连接效率的检测结果显示，Actin内部特异引物与接头引物扩增产物和Actin内部一对特异引物扩增产物亮度相差不大，这说明连接效率至少在70％-80％(凝胶成像系统扫描亮度面积比值)，连接效果良好，可以保证一个较好的差减效率(图2C)。此外，差减杂交的成功与否最终要通过差减效率来体现，差减效率越高，在差减文库中，所富集特异表达的基因丰度也越高。本实施例是通过PCR的方法检测第二次PCR产物中差减与未差减组成型表达基因的丰度来判断差减效率，所用引物为Actin内部一对特异引物。梯度PCR的扩增表明，在未差减产物中，Actin片段在25个循环时已经出现，而在差减产物中Actin片段在35个循环后才出现，要比对照晚10个循环。可见在差减产物中组成型表达基因的丰度已经大大降低，证明差减杂交达到了较为满意的效果(图2E)。

[0192] 两轮PCR扩增完毕后，分别取8μl的第一轮和第二轮PCR产物电泳检测。检测结果显示两轮选择性PCR扩增正常，这也从侧面反映了接头连接的高效率，如果接头连接效率太低，会严重影响两轮PCR的扩增效果。两轮PCR扩增的片段长度分布在0.3-1kb之间，为均匀的Smear状，平均大小约在500bp左右，与试剂盒所要求的期望大小相符。正反差减的第二次PCR产物纯化后，与载体连接并转化到大肠杆菌DH-5α中，各铺3个20cm培养皿，通过蓝白斑筛选，正向和反向文库各得到约5000个克隆。挑取分离良好、清晰饱满的白色克隆2304个置于装有50μlLB(含有Amp)的384空板中，用封口膜封好，在37℃培养箱培养过夜，最后得到正向库容量为2304个克隆和反向库容量为1920个克隆的两个差减杂交文库。每板随机抽取24个克隆，通过用T7与SP6载体引物PCR扩增插入片段对差减文库的质量进行检测，电泳检测的结果显示全部能够扩增出插入片段。插入片段的大小分布在0.2-0.7kb之间，少数克隆的插入片段在1kb以上，平均插入片段大小在0.5kb左右(图2D)，极少数克隆的PCR产物为两条带，可能是挑取白色克隆有误。

[0193] 从正向文库中通过PCR扩增得到的2304个插入片段进行反向Northern杂交，扩增的片段与2个探针的杂交信号存在明显差异，多数片段与未差减材料制备探针杂交信号较弱，与正向差减探针杂交信号较强，通过对比2张拷贝膜杂交信号进行筛选，共得到467个有明显表达差异的克隆，约占所选克隆的17.8％。图.2为编号为10的两张膜分别与正向差减和反向差减探针杂交通过反向Northern斑点杂交筛选的结果，箭头所示为差异表达克隆。同样的方法反向库得到463个有明显差异的克隆，约占所选克隆的24％。

[0194] 实施例2：PtELF5基因的克隆及序列分析

[0195] 在实施例1分离的序列中，有一个出现频率很高的片段，与拟南芥的ELF5呈现一定的相似性，依据这个基因片段，设计了一对基因内部特异引物P1：5′GSP PtELF5 primer (5′-ATGACAGAGCCATCCCCAGAGCCTAAT-3′)和3′GSP PtELF5 prime r(5′-GAAGGGTGAGACTCCAGTCATGTTTAG-3′)，扩增基因的长度分别为300bp。全长基因克隆采用文库与cDNA末端快速扩增结合的策略(Tian，et al.2003)：以文库噬菌体DNA为模板，用载体引物λTripIEx25′LD-Insert screening primer(5′-CTCCGAGATCTGGACGAGCT-3′)与3′GSP Primer扩增cDNA5′端，用5′GSPprimer与载体引物3′λTripIEx2 sequencing primer(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)配对扩增cDNA 3′端，然后利用生物信息学的方法拼接在一起。具体实验方法如下：PCR模板1μl(模板为稀释1000倍的cDNA扩增文库)，载体引物与基因内部特异引物各1μl(10μmol/L)，0.25μl高保真PyrobestDNA polymerase(宝生物工程大连有限公司)，2.5μl 10×Pyrobest DNA polymerase buffer，
0.5μl dNTPs(10mmol/L)，加ddH2O至25μl。PCR循环参数：94℃充分变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物在
1.2％Agarose/EB gel上检测。分别回收5′与3′端PCR扩增片段，取1μl 1000倍稀释液作为PCR扩增模板，用3′GSP primer与5′GSP primer进一步嵌套扩增验证，PCR体系和运行程序同上。确证5′与3′端PCR回收片段能够扩增出期望大小的片段后，将其克隆入pMD18-T(Takara，Japan)载体。菌液送华大基因公司武汉分公司测序。利用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行基因结构的预测和BLAST分析方法(Altschul等，1997)进行基因的同源性分析。

[0196] PtELF5全长的cDNA序列为1800bp，预测包含了1623bp的一个ORF。同时该基因的全长DNA序列也通过染色体步移得到，通过对DNA与cDNA的序列分析表明：在读码框内该基因存在10个外显子和9个内含子，序列分析推导的氨基酸序列包含了540个氨基酸，预测了一个57.2KD的分子量。在这些氨基酸内包含了75个碱性的(K：43，7.96％；R：26，4.81％；H：6，1.11％)和52的酸性氨基酸(D：22，4.07％；E：30，5.56％)，并预测了一个9.62的等电点。利用蛋白质特征的数据库(http://www.expacy.org)鉴定了两个富含赖氨酸的模块(这些编码氨基酸的位置为2-9和123-423)和一个WW domain(7-92)。
通过Blastx同源搜索预测的蛋白质与拟南芥的开花阻遏蛋白ELF5呈现了60％的同源性(NP_201070)，同时与人的NpwBP蛋白也呈现了很高的同源性。

[0197] 实施例三：PtELF5和PtFLC在早实枳中的实时定量分析

[0198] 为了进一步的验证PtFLC和PtELF5基因在早实枳不同组织、不同时期的表达，本研究用Real time PCR技术进行检测。材料收集和RNA的提取按照实施例1。检测所用引物经PrimerExpress软件设计。提取的RNA经DNaseI 37℃处理15min以去除DNA污染。处理后的RNA用MBI公司的反转录试剂盒反转录合成第一链cDNA。采用ABI7500实时定量PCR仪进行Real time PCR扩增。将待检测基因(PtELF5：PtELF5S 5-ATCACCCTACGCTGAATCCT-3，PtELF5A 5-GGTACGGGCAAAGCAACATC-3；PtFLC：PtFLCS5-AAGCGGCGTAGCGGATTGAT-3，PtFLCA5-TGCCTTAGGTGCTCCTGAAG-3)和内参基因的特异引物(ActinS，ActinA)与 GREEN Master Mix(Applied Biosystems，USA)混合，然后加入到含有模板的反应管中，反应体系为10μl。反应程序为：50℃2min，95℃1min，(95℃15s，60℃1min)40个循环。所产生的数据经Sequence Detector Version 1.3.1软件(Applied Biosystems，USA)转化后于Excel中进行分析。

[0199] 本实施例的结果显示，PtFLC和PtELF5在整个早实枳童期的表达量都比较高，当植株进入12月份，PtFLC和PtELF5表达开始增强，说明它们在早实枳早花过程中充当极其重要的角色。然而PtFLC在成年期早实枳1月份的春梢中具有较高的表达量，随着温度的升高，表达量逐渐降低，秋季过后，随着温度的降低，表达量又有所回升，到了11月份，表达量已经升到一个较高的水平，结果表明PtFLC的表达量与温度的关系密切。在成年期的表达调查中，PtELF5在3月份和5月份都具有较高的表达量，而这两个时期是早实枳的花芽分化时期和开花时期，这两时期表达量较高暗示了其表达量与早实枳的季节性开花密切相关。在拟南芥中，FLC是被ELF5抑制的，ELF5抑制FLC的表达继而引起FLC表达量下降。而在早实枳中看到，在3月份和5月份PtFLC的表达量有所降低，可能早实枳中存在与拟南芥春化调控模式类似的成花调控方式(图.4)。

[0200] 实施例四：PtFLC和PtELF5顶端分生组织中的空间表达分析

[0201] 原位杂交参照本实验室前期报道的方法(Li et al，2010)。PtFLC和PtELF5特异探针的制备：利用引物(PtELF5S，PtELF5A；PtFLCS，PtFLCA)扩增出特异片段，然后回收特异片段连接到pGEM-T载体上，为体外转录所用。在转录前，先经过测序确定特异片段在pGEM-T载体上的连接方向，以便确定体外转录时哪种酶转录出来的是正义链和反义链。后将装有PtFLC和PtELF5特异片段的载体进行酶切线性化，线性化的核酸内切酶是ApaI和BstXI。具体的实验操作按照DIGNorthern StarterKit试剂盒说明书(Roche，德国)。

[0202] 本实施例的结果呈现出在童期顶端分生组织和成年期春梢的营养芽的顶端分生组织中，PtFLC在整个顶端分生组织中都呈现了较高的表达量，这些部位是将来进行花芽分化的部位，在叶原基和幼叶的边缘区域也呈现了较高的表达；在花芽分化阶段，PtFLC在顶端分生组织和叶原基中表达较强；在开花阶段，PtFLC在雄蕊中具有较高的表达量，但是在顶端分生组织没有检测到该基因的表达。通过实时定量的表达分析，PtFLC在叶、花中具有较高的表达，在根和果实中表达量较低。

[0203] PtELF5在童期和成年期春梢顶端分生组织中的表达也被通过原位杂交调查(图.5)。从结果可以看出，在童期顶端分生组织中，PtELF5在幼嫩组织中表达量较高，比如幼嫩的叶片、腋芽等部位，但是在顶端分生组织没有检测到PtELF5的表达；在成年期的营养芽中，在整个顶端分生组织和腋芽中都能检测到其表达，没有发现其特异的表达，只是在分裂活跃的部位表达量稍微高一些。在花分化阶段，PtELF5的表达在整个花原基都能检测到，而且表达量较高。在开花阶段，在所有花器官中都能检测到该基因的表达并且雄蕊中表达量很高，与PtFLC具有相似的表达模式。可能两基因在此时期是相互竞争的关系，空间实时定量检测与PtFLC存在类似的表达模式，在叶、花中具有较高的表达量，而在根和果实中表达量较低。

[0204] 实施例五：PtELF5在拟南芥中异位表达分析

[0205] 根据pCAMBIA1301载体(从澳大利亚的CAMBIA公司购买，图6)的多克隆位点和PtELF5基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用Primer Premier 5.0软件设计出扩增PtELF5基因整个编码区的上、下游PCR引物其序列如下所示：

[0206] Forward primer：5’-GCCATGG CGTTTCGTGGTTGCAGTTCG-3’

[0207] Reverse primer：5’-GGGTAACC CTGGCTCTTCATTACCTTGT-3’

[0208] 以PtELF5基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃。25μl的反应体系中包括100ng cDNA，1×缓冲液，2.5mM MgCl2，0.25mM dNTP，0.5U Taq聚合酶(前述缓冲液和Taq聚合酶购自Fermentas公司，Lithuania)加0.5μM上述引物。PCR反应在ABI 9700(Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成：94℃，5分钟，94℃变性30秒，60℃退火50秒，72℃延伸90秒，35个循环；循环完成后72℃延伸15分钟。产生一条单一PCR条带产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用 DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带，提取步骤参照使用说明。双酶切体系：反应总体积为20μl，其中含有PCR的纯化产物10μl，10×G缓冲液(购自MBI公司)2μl，NcoI及BstEII各1μl，双蒸水6μl。在37℃酶切过夜后纯化回收。pCAMBIA1301载体的双酶切体系：反应总体积为20μl，其中含有经过质粒提取获得的pCAMBIA1301载体DNA 8μl，10×G缓冲液(购自MBI公司)2μl，NcoI及BstEII各1μl，加双蒸水8μl。于37℃酶切过夜后纯化回收。连接反应体系中插入PtELF5基因与载体pCAMBIA1301的摩尔比为3∶1，反应总体积为10μl，其中含有10×Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，PtELF5基因的双酶切回收产物4μl，pCAMBIA1301载体的双酶切回收产物2μl，双蒸水2μl。在16℃反应14-16小时。
连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为pCAMBIA1301-PtELF5重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pCAMBIA1301-PtELF5导入到农杆菌EHA105中。拟南芥种植参照本实验室前期报道的方法(Mei et al，2010)。
拟南芥转化采用花序浸染法(Clough and Bent 1998)。拟南芥是一年生草本植物，野生型拟南芥从播种到开花大概需要25d。通过统计拟南芥开花的时间、茎生叶数和莲座叶数，验证与开花相关基因的功能分析。PtELF5的阳性苗在长日照的条件下呈现出不同程度的早花(图7，表.13)。而PtELF5在拟南芥中是阻遏开花的，自身组成型表达呈现了晚花，插入突变后呈现了早花，通过两者不同的结果可以推测在早实枳中PtELF5呈现出了与拟南芥不同的调控方式，可能该基因在长期进化的过程中出现了分化。

[0209] 表13 35S：PtELF5 T2代转基因植株的开花时间分析

[0210]

[0211] a植物生长在温度为22度的长日照的条件下(16小时光照/8小时黑暗)；b天数c的计算是从播种到花序长到1cm左右；叶数是当花序长到1cm时候的总叶数。*代表与野生型有显著差异(P＜0.05)。

[0212] 主要参考文献

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