用于检测庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

摘要

本发明公开了一种能同时识别庆大霉素和西索霉素的特异性单克隆抗体，本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C201145。本发明还公开了特异性单克隆抗体、包被原、免疫原的制备方法和酶联免疫检测方法及酶联免疫分析检测试剂盒。与现有技术相比，本发明制备的单抗可以同时识别庆大霉素和西索霉素，提高了现有技术的检测效率，本发明的试剂盒和方法具有操作简便、灵敏、准确等优点。

权利要求

1.一种能识别庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO:C201145的杂交瘤细胞株EDC/2D5所分泌。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株EDC/2D5，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:C201145。

3.包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒是检测庆大霉素和西索霉素的酶联免疫试剂盒。

5.一种检测庆大霉素和西索霉素的酶联免疫方法，包括包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下：（1）将半抗原庆大霉素与卵清蛋白偶联得到包被原；

（2）用保藏号为CCTCC NO:C201145的杂交瘤细胞株EDC/2D5制备单克隆抗体；

（3）用步骤（1）的包被原包被固相载体；

（4）将待测样品用2%三氯乙酸处理，离心取上清，调pH值，得待测物溶液；

（5）对步骤（4）的待测物溶液进行酶联免疫检测。

6.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测庆大霉素和西索霉素的酶联免疫试剂盒中的应用。

7.权利要求3或4所述的试剂盒在动物组织庆大霉素和西索霉素残留检测中的应用。

说明书

用于检测庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体及酶联免疫方

法与试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种能识别庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体以及用于检测庆大霉素和西索霉素的的酶联免疫分析方法与试剂盒。

背景技术

[0002] 庆大霉素和西索霉素属于氨基糖苷类抗生素(AMGs)，由于这类抗生素易在肾皮质和内耳外淋巴液蓄积而引起耳毒性和肾毒性，以及由氨基糖苷类钝化酶产生的微生物耐药株较为严重，因此其在动物源性食品中的残留检测日益引起人们的重视。酶联免疫分析(ELISA)方法由于简单、快速、灵敏、特异等优点而被逐渐广泛应用于AMGs的快速残留检测领域。但目前的ELISA方法主要集中在单残留检测方面，用一种抗体同时检测结构不同的AMGs的ELISA方法很少。

[0003] 申请号为200710064346.8的发明专利公开了一种检测庆大霉素药物的酶联免疫试剂盒及方法，该专利将庆大霉素和载体蛋白，载体蛋白为：鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，采用戊二醛法或碳二亚胺法进行偶联得到免疫原和包被原，所制备的多克隆抗体和单克隆抗体只能识别庆大霉素，而且其样品的检测时间较长。申请号为200920246849.1的发明专利公开了一种庆大霉素ELISA检测试剂盒，该专利采用直接活化蛋白的方法偶联庆大霉素和牛血清白蛋白(bovine serum albu分钟，BSA)获得免疫原，同样的方法将庆大霉素和甲状腺蛋白偶联获得包被原，所制备的单克隆抗体同样仅能识别庆大霉素，而且其样品处理时间较长，试剂没有进行优化。

发明内容

[0004] 本发明的第一个目的是提供一种能识别庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体。

[0005] 本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能用于庆大霉素和西索霉素检测的酶联免疫方法。

[0006] 本发明的第三个目的是提供一种用于庆大霉素和西索霉素检测的试剂盒。

[0007] 本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测庆大霉素和西索霉素的酶联免疫试剂盒中的应用。

[0008] 本发明的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在动物组织庆大霉素和西索霉素残留检测中的应用。

[0009] 本发明通过以下技术方案实现：

[0010] 一种能识别庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的。

[0011] 上述杂交瘤细胞EDC/2D5，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C201145。

[0012] 所用的免疫原是由半抗原庆大霉素与牛血清白蛋白偶联制备的。

[0013] 进一步，本发明提供了一种用于庆大霉素和西索霉素检测的酶联免疫方法，该方法包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤，具体如下：

[0014] (1)将半抗原庆大霉素与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原；

[0015] (2)将半抗原庆大霉素与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原；

[0016] (3)利用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO：C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5；

[0017] (4)用保藏号为CCTCC NO：C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5制备单克隆抗体；

[0018] (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体(如酶标板)；

[0019] (6)将待测样品用2％三氯乙酸处理，离心取上清，调pH值，即为待测物溶液；

[0020] (7)对步骤(6)的待测物溶液进行酶联免疫检测。

[0021] 步骤(6)中2％三氯乙酸的组分及配比为：准确称取三氯乙酸20.0g，先加少量双蒸水溶解，再定容至1000mL。

[0022] 本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测庆大霉素和西索霉素的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对庆大霉素和西索霉素的酶联免疫检测。

[0023] 本发明的主要优点是：

[0024] 1、本发明制备的单克隆抗体能同时识别庆大霉素和西索霉素，而现有技术仅能单一识别庆大霉素。

[0025] 2、本发明建立的ELISA方法检测时间短，检测效率高。

[0026] 3、本发明涉及的组织样品处理方法简单，无需昂贵的仪器，无需有机试剂，对操作者无健康危害，且仅需要普通离心机即可，适合在基层操作。

附图说明

[0027] 图1为本发明中载体蛋白BSA的基质辅助激光解吸法检测的质谱图。

[0028] 图2为本发明中免疫原的基质辅助激光解吸法检测的质谱图，结合图1用于说明半抗原庆大霉素与BSA的偶联效果。

[0029] 附图3为本发明的单克隆抗体与庆大霉素(GEN)标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为庆大霉素(GEN)标准溶液浓度对数值，Y轴为庆大霉素标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。

具体实施方式

[0030] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。

[0031] 实施例1免疫原和包被原的制备

[0032] 1.1庆大霉素-BSA的合成

[0033] 称取庆大霉素164.0mg和BSA200.0mg溶解在15mL纯水中(pH7.4)，搅拌均匀，然后逐滴加入溶解在5mL纯水中的碳二亚胺(EDC)430.00mg，室温下搅拌反应8小时。最后该反应液转入透析袋中，在PBS液(pH7.4)中4℃透析4天，离心后冷冻干燥。如图1-2所示，经基质辅助激光解吸法(MALDI-TOF-MS)鉴定偶联成功，置-20℃保存备用。

[0034] 1.2庆大霉素-OVA的合成

[0035] 称取庆大霉素148.0mg和OVA240.0mg溶解在12mL纯水中(pH7.4)，搅拌均匀，然后逐滴加入溶解在4mL纯水中的EDC430.00mg，室温下搅拌反应8小时。最后该反应液转入透析袋中，在PBS液(pH7.4)中4℃透析4天。离心后冷冻干燥，置-20℃保存备用。

[0036] 实施例2单克隆抗体的制备

[0037] 杂交瘤细胞的制备：参照杨汉春《动物免疫学》，以实施例1制备的免疫原庆大霉素-BSA免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1月)腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。

[0038] 融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5分钟消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1-2×107个SP2/0与108个免疫脾细胞(1∶10～1∶15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/分钟离心5分钟，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的PEG等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1分钟内加完，持续搅拌30秒。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5分钟内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/分钟5分钟离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4～6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0039] 融合的当天计为0天，前3天尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3天每孔补加1滴HAT完全培养基；第5天每孔吸出1/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2天同上法吸去1/2～3/4培养上清，在7天后换入HT完全培养基。

[0040] 待融合细胞集落长至培养孔1/10～1/5，同时用建立的间接ELISA方法和间接竞争ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆。

[0041] 经过3～4次克隆，直至克隆阳性率为100％，最终筛选出分泌抗庆大霉素和西索霉素的杂交瘤细胞，该细胞株的染色体平均数为101。申请人将该杂交瘤细胞命名为EDC/2D5，并于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：C201145。

[0042] 腹水单抗制备与鉴定：在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO：
6
C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5扩大培养的细胞，并将细胞数调至1×10 个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京：人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。
采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。

[0043] 实施例3庆大霉素间接竞争ELISA检测方法的建立

[0044] 3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)[0045] 碳酸盐缓冲液(pH9.6)：准确称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

[0046] 洗涤液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH2PO4 0.20g，Na2HPO4·12H2O 2.90g，KCl0.20g，少量超纯水溶解，加入Tween20 0.50mL，定容至1000mL。

[0047] 磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)：准确称取NaCl8.00g，KH2PO4 0.20g，Na2HPO4·12H2O2.90g，KCl0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

[0048] 封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入1000mL磷酸盐缓冲液，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。

[0049] 生理盐水：准确称取NaCl 8.50g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

[0050] 抗体稀释液、酶标记抗体稀释液和底物溶液均由武汉飞远科技有限公司提供。

[0051] 终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。

[0052] 3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

[0053] 首先是通过方阵滴定的方法初步选择包被原和抗体工作浓度的组合。使用碳酸盐缓冲液将GEN-OVA包被原倍比稀释成32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL横向包被酶标板；EDC/2D05单克隆抗体使用磷酸盐缓冲液倍比稀释成1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶512000等纵向加入酶标板。方阵滴定结果见表1，初步选择以下包被原浓度和抗体工作浓度组合：(8，
1∶16000)和(8，1∶32000)。

[0054] 3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定

[0055] 最佳包被浓度确定：以方阵滴定选择的包被浓度和抗体稀释度组合分别作抑制曲线，庆大霉素标准品浓度设置为0、5、10、20、40、80μg/mL，其零药物孔与IC50值见表2。抗原抗体的比例是影响其灵敏度的关键，如果出现抗原或抗体过剩都将造成IC50偏高，综合IC50值、零孔OD值和抑制曲线的线性相关系数，最佳包被浓度为8μg/mL，抗体稀释度初步确定为1∶32000。

[0056] 表1EDC/2D5单克隆抗体方阵滴定

[0057]

[0058] 表2最佳包被浓度优化

[0059]包被原浓度(μg/mL) 抗体稀释倍数(1∶X) 0孔OD值 IC50值(μg/L)
8 16000 2.81 27.20
8 32000 2.44 18.55

[0060] 最佳抗体稀释度确定：以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1∶40000为中心浓度等差设计7个稀释梯度，其零药物孔与IC50值见表3。随着抗体稀释度的增加，IC50值降低，并且零药物孔值也降低。综合IC50值、零孔OD值和抑制曲线的线性相关系数，选择1∶48000为最佳抗体稀释度。

[0061] 表3最佳抗体稀释度优化

[0062]抗体系数倍数(1∶X) 0孔OD值 IC50值(μg/L)
16000 2.81 27.20
32000 2.44 18.55
36000 2.3 17.14
40000 2.25 17.7

[0063]44000 2.27 17.12
48000 2.02 13.09
52000 2.45 17.01

[0064] 3.4标准曲线的建立

[0065] 将庆大霉素标准品浓度设置为0、5、10、20、40、80μg/L等6个浓度，按照上面确定的间接竞争ELISA法测定，绘制标准曲线。如图3所示，本发明建立的庆大霉素和西索霉素残留间接竞争ELISA方法的回归方程和线性相关指数分别为：y＝-0.547x+1.166，r＝0.996，IC50值为16.33±1.24μg/L(n＝5)。线性范围为5～80μg/L。

[0066] 3.5特异性

[0067] 分别将各种常用的氨基糖苷类抗生素倍比稀释成梯度浓度进行间接竞争ELISA，计算IC50值，与庆大霉素标准品IC50值对比得到交叉反应率，结果见表4。结果表明，本发明建立的间接竞争ELISA方法对庆大霉素和西索霉素的交叉反应率分别为100％和33.80％，而与其它氨基糖苷类抗生素均无交叉反应。

[0068]

[0069] 表4庆大霉素和西索霉素残留ELISA检测方法的特异性

[0070]竞争物 IC50(μg/L) 交叉反应率(％)
庆大霉素 16.33 100
西索霉素 48.31 33.80
新霉素 ＞10000 ＜0.02
阿米卡星 ＞10000 ＜0.02
巴龙霉素 ＞10000 ＜0.02
新霉胺 ＞10000 ＜0.02
卡那霉素 ＞10000 ＜0.02
链霉素 ＞10000 ＜0.02
双氢链霉素 ＞10000 ＜0.02
核糖霉素 ＞10000 ＜0.02

[0071]壮观霉素 ＞10000 ＜0.02
安普霉素 ＞10000 ＜0.02
奈替霉素 ＞10000 ＜0.02
妥布霉素 ＞10000 ＜0.02
潮霉素 ＞10000 ＜0.03
春雷霉素 ＞10000 ＜0.03

[0072] 实施例4本发明庆大霉素和西索霉素多残留ELISA检测试剂盒的组装[0073] 4.1本发明ELISA试剂盒的组成

[0074] 1)包被有包被原庆大霉素-OVA的固相载体(酶标板)；

[0075] 2)庆大霉素标准溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L；

[0076] 3)庆大霉素单克隆抗体工作液；

[0077] 4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

[0078] 5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH2PO4 2.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl2.0g，加超纯水水至1000mL；

[0079] 6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH2PO4 2.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl 2.0g，吐温20 5mL，加超纯水至1000mL；

[0080] 7)底物液A：由武汉飞远科技公司提供；

[0081] 8)底物液B：由武汉飞远科技公司提供；

[0082] 9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

[0083] 4.2酶标板的制备

[0084] 用包被液将庆大霉素-OVA稀释成8μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被12～16小时；倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液，洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育2小时；倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干后，将酶标板倒置于
37℃培养箱，静置烘干30分钟，酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。

[0085] 实施例5本发明试剂盒的测定程序

[0086] 5.1试剂的配制

[0087] 1)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用超纯水稀释10倍后使用。

[0088] 2)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1∶100混匀，现配现用。

[0089] 3)2％三氯乙酸的组分及配比为：准确称取三氯乙酸20.0g，先加少量双蒸水溶解，再定容至1000mL。

[0090] 5.2组织样品前处理

[0091] 取2g均质组织样品，加2％三氯乙酸8mL，涡旋3分钟，再4000r/分钟离心10分钟，取1mL上清液，加入1M NaOH 75μl调pH，取50μl待用。

[0092] 注：本方法对样品的稀释倍数是4。

[0093] 5.3测定步骤

[0094] 1)加样：向酶标板微孔中加入庆大霉素系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入庆大霉素单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30分钟；

[0095] 2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，静置30秒后，洗涤3次并拍干；

[0096] 3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，37℃湿盒中恒温孵育30分钟；

[0097] 4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，静置30秒后，洗涤3次并拍干；

[0098] 5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，37℃湿盒中孵育15分钟；

[0099] 6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

[0100] 7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

[0101] 5.4结果判断

[0102] 以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，庆大霉素浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。按照公式计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以相应的稀释倍数，即为样品中庆大霉素和西索霉素的残留浓度。

[0103]

[0104] 实施例6本发明试剂盒的灵敏度、精密度和准确度

[0105] 6.1本发明试剂盒的灵敏度

[0106] 以标准曲线的IC50值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将庆大霉素标准品稀释成0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L等6个浓度，每个浓度5个重复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，取5次测定的IC50的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白鸡的肌肉组织的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的庆大霉素浓度，然后计算出庆大霉素浓度的平均值 和标准差(SD)，根据公式 计算出组织中的最低检测限。本发明的IC50值为16.33±1.24μg/L，庆大霉素在鸡肌肉中的最低检测限为34.09μg/L。

[0107] 6.2本发明试剂盒的精密度

[0108] 分别将5、10、20、40、80μg/L等庆大霉素标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表5。结果表明，标准曲线的板内及板间变异系数均＜15％，说明本发明间接竞争ELISA方法具有较好的精密度。

[0109] 表5标准曲线的板内与板间变异系数

[0110]

[0111]

[0112] 6.3本发明试剂盒的准确度

[0113] 在2g的匀浆鸡肌肉组织中加入庆大霉素标准溶液，使其终浓度分别为200μg/kg、100μg/kg和50μg/kg；加入西索霉素标准溶液，使其终浓度分别为200μg/kg、100μg/kg和50μg/kg；每个浓度5个重复，重复测定3次。测定添加组织中的庆大霉素和西索霉素的浓度，按照下述公式计算回收率，考核试剂盒的准确度；计算批内和批间变异系数，考核试剂盒的重复性。准确度和重复性结果见表6和表7，表明该试剂盒具有可靠的准确度，批内和批间变异系数小，重复性好。

[0114]

[0115] 表6鸡肌肉中庆大霉素添加回收率与变异系数

[0116]

[0117] 表7鸡肌肉中西索霉素添加回收率与变异系数

[0118]