本发明涉及一种生物组织培养繁育考来木的方法，包括下述步骤：取带腋芽的枝条作为外植体，并对外植体进行清洗，表面消毒处理；将外植体接种到初代培养基中，进行初代培养；将初代培养的无菌苗转入增殖培养基：MS+BA0.1~2.5mg·L-1+NAA0.1~2.5mg·L-1+蔗糖20~40g·L-1+琼脂4~12g·L-1，诱导不定芽；将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；试管苗分切后，转移至生根培养基为：1/2MS+NAA0.5~4.5mg·L-1+IBA0.5~2.5mg·L-1+蔗糖15~35g·L-1+琼脂4~12g·L-1中；将生根试管苗清洗，移至基质中栽种。优点是：年繁殖系数提高到1：1000000，成本降低至每株2~3元，且不受季节限制，环境易控，减少变异植株的产生，种苗品质高，一致性好。
1.一种生物组织培养繁育考来木的方法，选取考来木外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生试管苗，并进行栽种，其特征在于按下列步骤进行：a、所述考来木外植体是选择生长健壮、无病虫害的考来木的带腋芽枝条作为起始外植体，用洗洁精擦洗表面后，流水冲洗20分钟，再进行表面消毒处理；
b、将消毒处理后的外植体接种到初代培养基中，进行初代培养，其中，初代培养基为-1 -1 -1 -1MS+6-BA0.15～0.25mg•L +NAA0.15～0.25mg•L +蔗糖25～35g•L +琼脂4～12g•L ；
c、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+6-BA0.1～-1 -1 -1 -1
2.5mg•L +NAA0.1～2.5mg•L +蔗糖20～40 g•L +琼脂4～12 g•L ，诱导丛生芽；
d、将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，壮苗培养基为-1 -1 -1 -1MS+6-BA0.15～0.25mg•L +IBA0.15～0.25mg•L +蔗糖25～35 g•L +琼脂4～12 g•L ； e、将经壮苗培养生长到2.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生根培-1 -1 -1养基为1/2MS+NAA0.5～4.5mg•L +IBA0.5～2.5 mg•L +蔗糖15～35g•L +琼脂4～-1
12g•L ，其中，所述的1/2MS是指MS培养基配方中NH4NO3、KNO3、 CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O 、KH2PO4用量减半，而其余药品成分以及用量不变； f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土的混合基质中进行栽种。
2.根据权利要求1所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤a中，所述的外植体为带腋芽的枝条切取成长度为0.5～2.5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，进行消毒处理。
3.根据权利要求1或2所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤a中，所述的消毒处理先用72%浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有0.1～0.2%的升汞液浸泡15～30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
4.根据权利要求1所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15小时/天，光照强度1500~2500lx，培养温度为室温，培养周期为22~28天。
5.根据权利要求1所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤c中，-1 -1 -1 -1所述的增殖培养基为MS+6-BA2mg•L +NAA1mg•L +蔗糖30g•L +琼脂6 g•L ，培养条件为无菌室内光周期为10~15小时/天，光照强度1500~2500lx，培养温度为室温，培养周期为
6.根据权利要求1所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤d中，所-1 -1 -1 -1述的壮苗培养基为：MS+6-BA0.2mg•L +IBA0.2mg•L +蔗糖30g•L +琼脂6g•L ，培养条件为无菌室内光周期为10~15小时/天，光照强度1500~2500lx，培养温度为室温，培养周期为
7.根据权利要求1所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤e中，所-1 -1 -1 -1述的生根培养基为1/2MS+NAA1mg•L +IBA1mg•L +蔗糖20 g•L +琼脂6 g•L ，生根率为
85～95％，平均生根数4.5条，根长2～5厘米，培养条件为无菌室内光周期为10~15小时/天，光照强度1500~2500lx，培养温度为室温，生根培养的周期为28~32天。
8.根据权利要求1所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于，步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6～10天，取出洗净根部，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，起始6～10天内保持苗的叶面湿润并适当遮阳，其后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。
9.根据权利要求1所述的生物组织培养繁育考来木的方法，其特征在于步骤f中，所述的混合基质的营养成分为草炭土：珍珠岩＝2:1。
生物组织培养繁育考来木的方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物快繁方法技术领域，具体为生物组织培养繁育考来木的方法。
背景技术
[0002] 考来木（Correa carmen）是芸香科考来木属常绿小灌木。该属有11个种，原产澳大利亚，分布较广泛，从南澳大利亚州东南部，维多利亚州西部，新南威尔士州东南部，并持续到昆士兰州东南部，它包括东部塔斯马尼亚州及南澳大利亚袋鼠岛。考来木生长环境类型多样，从沿海沙地到内陆半干旱山地都有分布，有的生长在林下或靠近溪流的阴凉环境中，有的暴露在海岬或沙丘中。
[0003] 树型不规则，有的直立、有的半匍匐生长。叶片短小，对生，背面多有绒毛，逆光观察时可见半透明的油滴状斑点。花多着生于叶腋处，钟状、灯笼状、长管状或细长管状，长2.5厘米左右，单株花朵数量众多，花瓣顶端多反卷呈星状，花蕊突出花瓣外，花期长，多数品种从夏末开至晚冬、甚至初春。花色多，有火红色、白色、绿色、粉色、橘红色等。在寒冷的冬日，考来木以其浓绿的叶片、纤细可爱的繁花、五彩缤纷的色彩夺人眼球，宛如冬季里的精灵。
[0004] 考来木属是澳大利亚的特有属，其常绿、冬花、耐盐碱、极抗寒、耐干旱等特性，使得其在城市园林绿化中必然大有用途，但每株引种费高达500元，到目前为止，未见国内其它研究机构或种苗企业有引种及繁育研究报道。本技术在单株选优的基础上，采用直接器官发生形式，通过对培养基成分、激素配比以及培养环境因子的确定，建立了考来木完整的再生体系，以芽繁芽进行组培快繁生产出来的试管苗无变异发生，可以保持母本的优良性状，使得这一昂贵的外来物种得以保存和繁育，为后期的推广应用奠定了技术基础和优质种苗。
发明内容
[0005] 本发明目的在于提供一种生物组织培养繁育考来木的方法，在离体条件下快速繁殖考来木，且生产的考来木种苗品质高，一致性好。
[0006] 本发明目的通过下述技术方案实现：一种生物组织培养繁育考来木的方法，选取考来木外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生试管苗，并进行栽种，其按下列步骤进行：
[0007] a、所述考来木外植体是选择生长健壮、无病虫害的考来木的带腋芽枝条作为起始外植体，用洗洁精擦洗表面后，流水冲洗20分钟，再进行表面消毒处理；
[0008] b、将消毒处理后的外植体接种到初代培养基中，进行初代培养，其中，初代培养基-1 -1 -1为MS+6-BA0.15～0.25mg·L +NAA0.15～0.25mg·L +蔗糖25～35g·L +琼脂4～
-1
12g·L ；具体的，在初代培养基中，6-BA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 -1 -1
mg·L ，NAA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L ，蔗糖的浓度可以为25、-1 -1
28、30、32、35 g·L ，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L 。
[0009] c、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+BA0.1～-1 -1 -1 -1
2.5mg·L +NAA0.1～2.5mg·L +蔗糖20～40 g·L +琼脂4～12 g·L ，诱导不定芽，
-1
具体的，BA的激素浓度可以为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·L ，NAA的激素浓度可以-1
为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5 mg·L ，蔗糖的浓度可以为20、25、28、30、32、-1 -1
35、40 g·L ，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12g·L ；
[0010] d、将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，壮苗培养基为-1 -1 -1MS+6-BA0.15～0.25mg·L +IBA0.15～0.25mg·L +蔗糖25～35 g·L +琼脂4～
-1
12 g·L ，具体的，在壮苗培养基中，6-BA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 -1 -1
mg·L ，IBA的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mg·L ，蔗糖的浓度可以为25、-1 -1
28、30、32、35 g·L ，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L ；
[0011] e、将经壮苗培养生长到1.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生-1 -1 -1根培养基为1/2MS+NAA0.5～4.5mg·L +IBA0.5～2.5 mg·L +蔗糖15～35g·L +琼
-1
脂4～12g·L ，具体NAA的激素浓度可以为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.0、4.2、-1 -1
4.5 mg·L ，IBA的激素浓度可以为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L ，蔗糖的浓度可以为15、-1 -1
18、20、22、25、30、35 g·L ，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8、10、12 g·L ；
[0012] f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土的混合基质中进行栽种。
[0013] 其中，步骤a中所述的外殖体为带腋芽的枝条切取成长度为0.5～2.5cm，腋芽位于中间的茎段，可以为0.5、0.7、0.9、1、1.5、2.0、2.5cm等该范围内的任一长度，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，进行消毒处理。
[0014] 在上述方案基础上，所述步骤a中，所述的消毒处理先用72%浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有0.1～0.2%的升汞液浸泡15～30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。具体的，72%浓度酒精消毒时间可以为30s、40s、
50s、60s，升汞液浓度可以为0.1%、0.15%、0.2%，浸泡时间可以为15、18、20、25、28、30分钟。
[0015] 优选的初代培养基为：MS+6-BA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂-16g·L ，在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15小时/天（h/d），优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为22~28天，优选25天。
[0016] 其中，步骤c中所述的最佳增殖培养基为MS+BA2mg·L-1+NAA1mg·L-1+蔗糖-1 -130g·L +琼脂6 g·L ，在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选
12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为28~32天，优选30天，丛生芽增殖率为1：（4～5），由此考来木试管苗的月增殖系数为1:4~5。
[0017] 其中，优选的壮苗培养基为：MS+6-BA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼-1脂6g·L ，在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为18~22天，优选20天，由此试管苗长至2~6cm高，叶片4~8对，比较整齐。
[0018] 其中，步骤e中所述的最佳生根培养基为1/2MS+NAA1mg·L-1+IBA1mg·L-1+蔗糖20 -1 -1g·L +琼脂6 g·L ，生根率为85～95％，平均生根数4.5条，根长2～5厘米，培养条件为无菌室内光周期为10~15h/d，优选12h/d，光照强度1500~2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，生根培养的周期为28~32天，优选30天。由此生根率最高可达95%，平均生根条数为4.5条，根长2~5厘米，诱导生成的根比较粗壮。
[0019] 其中，步骤f中将生根试管苗置于自然环境中6～10天，一般为一周，取出洗净根部，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，起始6～10天（一般为一周）内采用喷雾等手段保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后（约二周后）按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。
[0020] 在上述方案基础上，所述步骤f中生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土：珍珠岩＝2:1。
[0021] 其中所用到的培养基及激素包括：
[0022] MS培养基（Murashing and Skoog medium，以下简称MS），MS配方中的药品成分和培养基的具体配制方法为现有公知技术，、在此不再赘述。
[0023] 1/2MS是指MS培养基配方中NH4NO3、KNO3、 CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O 、KH2PO4用量减半，而其余药品成分以及用量不变。
[0024] 附加的植物激素为6-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，简称为BA)、奈乙酸（naphthylene acetic acid，简称为NAA）、吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid，简称为IBA），基本培养基中所用药剂和各类激素均由sigma公司购得。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 本发明极大加快了考来木的繁殖速度，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导增殖出大量不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系，年繁殖系数为1：1000000，成本由原来的引种每株500元，降低至每株2～3元。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，解决了考来木引种费用高的问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的考来木种苗品质高，一致性好。利用本发明的技术参数和流程，我们已经用上述技术生产了300000株工程苗，受到市场的认可欢迎，并将持续生产。
附图说明
[0027] 图1为本发明繁育品种母本之一；
[0028] 图2为本发明繁育品种母本之一；
[0029] 图3为本发明诱导增殖培养；
[0030] 图4为本发明壮苗培养；
[0031] 图5和图6为本发明生根试管苗；
[0032] 图7和图8为本发明炼苗移栽图。
具体实施方式
[0033] 如图1为本发明繁育品种母本之一、图2为本发明繁育品种母本之一、图3为本发明诱导增殖培养、图4为本发明壮苗培养、图5和图6为本发明生根试管苗，以及图7和图8为本发明之炼苗移栽实样图所示：
[0034] 一种考来木离体培养和快速繁殖的方法，考来木外植体经表面消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得试管苗，进行移栽，包括下述步骤：
[0035] a：考来木叶片多有绒毛，并有半透明的油滴状斑点，枝条上密布黄色的树脂腺体，又长期生长于野外自然条件下，自身附带的污染物较多，表面消毒获得无菌材料具有难度。本技术采用较温和的洗洁精浸泡擦洗，去掉枝条表面的毛并初步降低污染后，再流水冲洗
20分钟，切取成为长度0.5~2.5cm，腋芽位于中间的茎段，切去叶片，保留两片叶柄基部保护腋芽生长点，在超净工作台上，先用72%浓度的酒精消毒30~60s，再用无菌水冲洗3~4次，然后用0.1~0.2%的升汞液浸泡15~30分钟，用无菌水冲洗至消毒液无残留，得到无菌的外植体，平均无菌率80%。其中升汞溶液过滤后可反复加以使用，消毒效果不变，可减少对环境的破坏。
[0036] b：在步骤a中消毒所得到的无菌外植体接种到初代培养基MS+6-BA0.15~0.25mg-1 -1 -1 -1·L +NAA0.15~0.25mg·L +蔗糖25~35g·L +琼脂4~12g·L 上。培养基pH调为5.8左
右，一个试管接种一个，避免交叉感染，于光周期为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为
25℃的无菌室内培养25天。
[0037] 无菌操作室在使用前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，紫外灯在关闭10分钟后，才可进行接种操作；接种用具在121℃条件下高压灭菌35分钟，培养基在121℃条件下高压灭菌18分钟。
[0038] c：将初代培养获得的健壮一致的无菌苗转到增殖培养基MS+BA0.1~2.5mg·L-1+NA-1 -1 -1A0.1~2.5mg·L +蔗糖20~40 g·L +琼脂4~12 g·L ，结果表明，考来木增殖需要浓度较高-1 -1
的细胞分裂素，当BA为1mg·L 时，增殖速度非常缓慢，当BA 浓度为3 mg·L 时，对考来-1
木丛生芽的增殖效果最好，而当浓度达到3.5mg·L 时，考来木又非常容易出现玻璃化的畸形现象，添加生长素对考来木的增殖有促进作用。本发明中所述的增殖培养基最佳的激素-1 -1 -1 -1
组合及浓度为：MS+BA2mg·L +NAA1mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6 g·L ；在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，培养周期优选30天，考来木试管苗的月增殖系数为1:4~5。诱导出的丛生芽发育正常，叶色浓绿，长势旺盛，可以做为考来木扩繁增殖的培养基。
[0039] d：在增殖培养基上，考来木试管苗生长高度参差不齐，将丛生芽分切后，转移至壮-1 -1 -1苗培养基MS+6-BA0.15~0.25mg·L +IBA0.15~0.25mg·L +蔗糖25~35 g·L +琼脂4~12 -1 -1 -1 -1
g·L 。本发明优选的壮苗培养基为：MS+6-BA0.2mg·L +IBA0.2mg·L +蔗糖30g·L +琼脂-1
6g·L ；在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，培养周期优选20天，试管苗长至2~6cm高，叶片4~6对，比较整齐，可以用来诱导生根。
[0040] e：大量元素减半的1/2MS比MS更有利于生根，本发明中生根培养基为1/2MS+NAA-1 -1 -1 -10.5~4.5mg·L +IBA0.5~2.5mg·L +蔗糖15~35g·L +琼脂4~12g·L 。当NAA、IBA浓度低-1 -1
于1 mg·L 时，生根率比较低；当上调至4.5 mg·L 时，生根率虽然可以达到100%，但是-1
在试管苗的基部容易出现愈伤化组织，不利于后期的移栽；蔗糖含量为20 g·L 时，也能够提高生根率及平均生根数。考来木生根培养时最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值-1 -1 -1 -1
为：1/2MS+NAA1mg·L +IBA1mg·L +蔗糖20 g·L +琼脂6 g·L ；培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选2000lx，培养温度优选25℃，生根培养的周期优选30天。
由此生根率最高可达95%，平均生根条数为4.5条，诱导生成的根比较粗壮。
[0041] 第六步：将考来木生根试管苗置于自然环境中6～10天，一般为一周，取出洗净，用500~600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩的混合基质中，本发明中草炭土:珍珠岩＝2:1，起始6~10天（一般为一周）内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后（约二周后）按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照。考来木成活率可以达到90%。
[0042] 采用本发明所提供的方法，对加快考来木的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导出不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。年繁殖系数为1:1000000，成本由原来的引种每株500元，降低至每株2~3元。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，解决了考来木引种费用高的问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的考来木种苗品质高，一致性好。利用本发明的技术参数和流程，我们已经生产了300000株工程苗，受到市场的认可欢迎，并将持续生产。
