一种以羟基红花黄色素A、丹参素钠制备而成的注射液

摘要

本发明涉及一种以羟基红花黄色素A、丹参素钠制备而成的注射液及其制备方法，其特征是：它的制备方法包括：步骤1，分别按质量比为1：3的比例取羟基红花黄色素A、丹参素钠，将上述质量比的羟基红花黄色素A、丹参素钠在35℃-45℃的温度下混合，用部分注射稀释液溶解，备用；步骤2，将药用载体等渗剂与步骤1的溶液按质量比7-8：2-3混合，使丹参素钠和羟基红花黄色素A与药用载体完全溶解；步骤3，调步骤2所得溶液的pH值为6.0；步骤4，加注射稀释液至全量；步骤5，用超滤器滤除；步骤6，灭菌消毒；步骤7，罐装。本发明注射液的配方明确合理，稳定性好、且制备方法简单。

权利要求

1.一种以羟基红花黄色素A、丹参素钠制备而成的注射液，其特征是在于它的制备方法包括如下步骤： 步骤1分别按质量比为1：3：4的比例取羟基红花黄色素A、丹参素钠和注射稀释液，将上述质量比的丹参素钠、羟基红花黄色素A在35℃-45℃的温度下混合，用1/3的注射稀释液溶解，备用； 步骤2，将药用载体等渗剂与步骤1的溶液按质量比7-8：2-3混合，使丹参素钠和羟基红花黄色素A与药用载体完全溶解；

步骤3，调步骤2所得溶液的PH值为6.0；

步骤4，加注射稀释液至全量；

步骤5，用超滤器滤除；

步骤6，灭菌消毒；

步骤7，罐装；

所述的载体等渗剂是5%葡萄糖注射液；所述的超滤器是0.45um微孔滤膜；所述的注射稀释液为5%葡萄糖注射液；所述的每1ml所述注射液中羟基红花黄色素A不低于200ug/ml，丹参素钠含量不低于700ug/ml；所述羟基红花黄色素A是采用血清差示色谱法进行确定。

说明书

一种以羟基红花黄色素A、丹参素钠制备而成的注射液

技术领域

[0001] 本发明涉及一种注射液及其制备方法，特别是一种以羟基红花黄色素A、丹参素钠制备而成的化学药品注射液及其制备方法。

背景技术

[0002] 心脑血管疾病是严重威胁人类健康的第一杀手，还被世界医学界称为“时代瘟疫”。随着人们膳食结构的改变，加之老龄人口的不断增加，心脑血管的发病率已明显增多，其致死人数每年约占世界总死亡人数的39.4％，尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，是目前严重危害人类健康和生命的主要疾病之一，也是心血管疾病最常见的致死因素，其发病率和病死率均呈上升趋势。针对该类疾病的发病机理及其新药研发一直是国内外医药学专家研究的热点。

[0003] 中药在防治缺血性心脑血管疾病方面历史悠久，长期广泛的使用产生了许多治疗心脑血管疾病的经典名方、验方。结合现代化研究技术和手段，对这些经典方剂进行深入药效物质基础研究，开发出新型药物，对于中药国际化具有深远意义。

[0004] 丹红注射液是临床广泛应用于缺血性疾病的中成药，大量临床研究表明，其在治疗效各类缺血性疾病方面疗效确定，毒副作用小，对梗塞性供血不足效果尤为显著。该药在2005年获得国家发明专利，2010年11月获得中国专利奖金奖，这是自2001年我国对药品实施专利保护以来，第一个获得中国专利金奖的中药产品。但现有的丹红注射液制备方法复杂，产出率较低，成本较高，尤其丹红注射液尚为中药复方制剂，其成分较为复杂，而且有效成分不确切，所以造成临床药效不好、有一定副作用。

[0005] 由于丹红注射液为水提醇沉制备而成，所以主要有效成分为水溶性物质。文献研究表明，丹参中主要水溶性成分是丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛，且主要有效物质为丹参素；而红花中主要有效物质只能确定到红花提取物，尚不能最终确定具体成分。在此研究基础上，我们采用我们首创的“血清差示色谱法”实验证实：在缺血再灌注疾病的治疗中，红花中的羟基红花黄色素A为主要药效成分；通过正交试验和药效学实验，我们发现羟基红花黄色素A和丹参素组合治疗效果较其他成分组合疗效更佳。所以，我们最终选择了羟基红花黄色素A和丹参素钠为注射剂的制备原料药。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种以羟基红花黄色素A、丹参素钠制备而成的化学药品注射液及其制备方法，它具有的特点：配方明确合理，稳定性好、药效好、副作用小，且制备方法简单。

[0007] 本发明的目的是这样实现的，一种以羟基红花黄色素A、丹参素钠制备而成的注射液，其特征是在于它的制备方法包括如下步骤：

[0008] 步骤1分别按质量比为1： 3：4的比例取羟基红花黄色素A、丹参素钠和注射稀释液，将上述质量比的羟基红花黄色素A、丹参素钠在35℃-45℃的温度下混合，用1/3的注射稀释液溶解，备用；

[0009] 步骤2，将药用载体等渗剂与步骤1的溶液按质量比7-8：2-3混合，使丹参素钠和羟基红花黄色素A与药用载体完全溶解；

[0010] 步骤3，调步骤2所得溶液的PH值为6.0；

[0011] 步骤4，加注射稀释液至全量；

[0012] 步骤5，用超滤器滤除；

[0013] 步骤6，灭菌消毒；

[0014] 步骤7，罐装。

[0015] 所述的载体等渗剂是5%葡萄糖注射液。

[0016] 所述的超滤器是0.45um微孔滤膜。

[0017] 所述的注射稀释液为5%葡萄糖注射液。

[0018] 所述的每1ml所述注射液中羟基红花黄色素A不低于200ug/ml，丹参素钠含量不低于700ug/ml。

[0019] 所述的丹参素钠的英文名：Sodium danshensu、分子式：C9H9NaO5、分子量：220.16 [0020] 结构式：

[0021]

[0022] 所述的羟基红花黄色素 A的英文名：Safflomin A、别名：Hydroxysafflor yellow A、分子式：C27H32O16、分子量：612.53、结构式：

[0023]

[0024] 本发明的优点是：中医理论认为，急性心肌梗死应归于《灵枢·厥论》中的真心痛范畴，多数中医认为本病病机是本虚标实，气虚血疲。丹红注射液中丹参性微寒，味苦，有活血化淤，养血安神，调经止痛的作用。红花性温，味辛，归肝心经，有活血祛瘀通经作用。丹参为沉降之物，红花为升浮之品，二药同用，一升一降内外通和，行气活血之功尤为显著。羟基红花黄色素A和丹参素钠分别为红花和丹参中的主要药效物质，在秉承红花丹参药对配比优点的基础之上，成分更加明确，从而大大减小了临床副作用的发生。

[0025] 羟基红花黄色素A的确定：

[0026] 血清差示色谱法是以药效指标为导示确定中药药效物质基础的药效差示血清色谱法。即用产生最大药效和最小药效时的血清物质谱之差捕捉伴随着药效消失而消失的物质，并最大程度地分离、纯化、鉴定出这些药效物质是原方剂中含有的还是机体的代谢产物。将初步判定的药效物质用于对证模型，以药效验证结果反馈性调整差示色谱条件，直至确认药效物质，最后结合质谱及核磁共振波谱动态地定性、定量中药体内药效物质的变化，并与相应的药效指标结合分析，进一步确认中药的药效物质基础。

[0027] 首先， 建立系列全成分指纹图谱

[0028] 确定红花提取物中有效物质，拟取红花提取物血清，红花提取物最大、最小药效时间点的血清，空白血清等，经预处理，采用液质联用、高效液相色谱法等分别建立各指纹图谱色谱条件，建立最大、最小药效点的血清及对照指纹图谱。同时利用蒸发光散射检测器（ELSD）检测，确保无紫外吸收物质不遗漏，以最大限度地获得样品信息，并监测系统洗脱的所有色谱峰，确保组份不被遗漏，最终建立全成分图谱集。

[0029] 其次， 差示比对锁定药效物质

[0030] 依据药效差示血清色谱法原理，对各种指纹图谱集进行比对分析，确定药效物质。我们在药效差示血清色谱理论的指导下对红花进行了研究，并成功确定其在治疗血瘀证方面的主要药效成分为羟基红花黄色素A（Cardiovasc Diabetol, 2011; Neurochem Res,
2010; J Ethnopharmacol, 2010; J Chromatogr B, 2008）。我们首先确定了正常大鼠给予红花提取物的最大、最小药效点（见表1，2），在血瘀证模型上成功完成了对红花中药效物质的植化分离、药效学考察；成功确定了红花注射液治疗血瘀证的药效物质为羟基红花黄色素A（见图1~4）。

[0031] 最大、最小药效时间点的确认

[0032] 表1 红花提取物对正常大鼠血液流变学的影响（ , n=8）

[0033]

[0034] 与0h 比较 *p﹤0.05，**p﹤0.01

[0035] 表2 红花提取物对血瘀大鼠血液流变学的影响（ , n=8）

[0036]

[0037] 与正常组大鼠0h 比较，Δp﹤0.05，ΔΔp﹤0.01；与模型组大鼠0h比较，*p﹤0.05，**p﹤0.01。

[0038] 确定红花治疗血瘀证的药效物质为羟基红花黄色素A（HSYA）

[0039] 根据药效差示血清色谱法理论，以血流动力学等指标的变化为依据，确定了红花在对证机体内的最大、最小药效时间点，发现红花改善血瘀大鼠血液流变学的主要药效物质基础为HSYA。动物实验研究表明，HSYA能显著改善正常大鼠和血瘀大鼠的血液流变学全血粘度，其效能相当于红花提取物的80%。人体试验研究表明，HSYA单次静脉给药能改善健康受试者的血液流变学指标并延长凝血时间，增加受试者肝、肾、子宫动脉的血液灌注量，但无降低血脂的作用；HSYA多次给药也能改善健康受试者的血液流变学指标，但对患者的凝血时间、肝、肾、子宫动脉的血液灌注量和血脂无显著影响。药代动力学研究表明，无论HSYA还是红花提取物在血瘀大鼠体内的药代动力学参数与正常大鼠相比均存在显著差异。成功确定了红花在治疗缺血性再灌注疾病中的有效物质为HSYA。

[0040] 该注射液在缺血性疾病的治疗中能明显地改善胸闷、胸痛、心悸气短症状，改善心肌缺血、降低血液黏稠度。用药过程中未发现明显毒副作用，有着西药无法比拟的优点，配方明确合理，稳定性好、且制备方法简单。尤其是作为化学药品注射剂解决了中药注射剂的“三不明”问题：成分明确，比例明确，靶点和作用机制亦明确(相关文章已被《中国药房》、《中国药师》收录)。

附图说明

[0041] 下面结合实施例附图对本发明做进一步说明：

[0042] 图1是红花提取物灌胃后血瘀大鼠血清样品HPLC图（275nm）（图中a.HSYA对照品; b.红花提取物;c最大药效时刻（4h）; d.最小药效时刻（6h）;e.空白血清）；

[0043] 图2是红花提取物灌胃后血瘀大鼠血清样品HPLC图（403nm）（图中a.HYSA对照品; b.红花提取物;c.空白血清;d.最大药效时刻（4h）;e.最小药效时刻（6h）;f.差示色谱）；

[0044] 图3是 HSYA 质子扫描图；

[0045] 图4是 HSYA 分子结构式。

具体实施方式

[0046] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但是不作为对本发明的限制： [0047] 实施例1：

[0048] 以注射稀释液全量1000ml为例

[0049] 步骤1，将250mg羟基红花黄色素A和 750mg丹参素钠在35℃-45℃的温度下混合，用1/3注射稀释液溶解，备用；

[0050] 步骤2，将5%葡萄糖注射液与步骤1的溶液按质量比7.5：2.5混合，使羟基红花黄色素A和丹参素钠完全溶解；

[0051] 步骤3，调步骤2所得溶液的PH值为6.0；

[0052] 步骤4，加注射稀释液至全量1000ml；

[0053] 步骤5，用超滤器滤除，即：用0.45um微孔滤膜滤除；

[0054] 步骤6，以110℃-120℃高温灭菌消毒，20-40 min；

[0055] 步骤7，罐装。

[0056] 所述的注射稀释液为5%葡萄糖注射液。

[0057] 该注射液有效成分的测定：每ml液体中羟基红花黄色素A不低于200ug/ml，丹参素钠含量不低于700ug/ml。

[0058] 实施例2：

[0059] 同样以注射稀释液全量1000ml为例

[0060] 步骤1，将250mg羟基红花黄色素A 和750mg丹参素钠在35℃ -45℃的温度下混合，用1/3注射稀释液溶解，备用；

[0061] 步骤2，将5%葡萄糖注射液与步骤1的溶液按质量比7：2混合，使丹参素钠和羟基红花黄色素A完全溶解；

[0062] 步骤3，调步骤2所得溶液的PH值为6.0；

[0063] 步骤4，加注射稀释液至全量1000ml；

[0064] 步骤5，用0.45um微孔滤膜滤除；

[0065] 步骤6，以110℃-120℃高温灭菌消毒，20-40 min；

[0066] 步骤7，罐装。

[0067] 所述的注射稀释液为5%葡萄糖注射液。

[0068] 该注射液有效成分的测定：每ml液体中羟基红花黄色素A不低于200ug/ml，丹参素钠含量不低于700ug/ml。

[0069] 实施例3：

[0070] 同实施例1基本相同，不同之处是：步骤２中，将药5%葡萄糖注射液与步骤1的溶液按质量比８：３混合。

[0071] 上述实施例1-3中的羟基红花黄色素A和丹参素钠是从市场直接购得。 [0072] 实施例4：

[0073] 同实施例1基本相同，不同之处是：所述的丹参素钠采用如下制备方法制得：取丹参药材1kg，以8倍量0.5mol/L盐酸水溶液加热回流2次，每次1.5小时，合并药液，过滤，滤液浓缩至5L。打入多极逆流萃取器，用正己烷-乙酸（1：3）混合溶剂进行3极萃取，取下相溶液，加入201×1型强碱性阴离子交换树脂柱进行吸附，用1mol/L NaOH溶液洗脱液，浓缩，冷藏，析出结晶，分离结晶即得。

[0074] 药效学试验资料

[0075] 动物实验采用对SD大鼠进行冠状动脉结扎法建立MI/R模型，在缺血5min后颈静脉给予注射液；假手术组只穿线不结扎，给予生理盐水。分别观察心肌梗死面积（MIS）、血清中肌酸激酶-同工酶（CK-MB）含量、血清中乳酸脱氢酶（LDH）含量、血清中一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）含量等指标的变化。

[0076] 1.红花、丹参中最佳药对的选择

[0077] 1）根据对红花、丹参中药效成分的含量测定结果，我们设立了羟基红花黄色素A+丹参素钠（A +D）组，羟基红花黄色素A+丹酚酸B组（A + B），羟基红花黄色素A+原儿茶醛（A +Y）组三个组，配比均为1:3。实验结果表明，A+D组治疗效果最佳。

[0078] 表3不同药对制备注射液对缺血再灌注大鼠的影响( ,n=12)组别 MIS/% CK-MB/(U·L-1) LDH/(U·L-1) NO/(μmol·L-1) NOS/(U·mL-1)
假手术组 4.3±1.1 990±75 210±46 35.3±3.5 6.8±0.9
模型组 30.2±5.9* 1231±103* 311±53* 43.7±5.6* 8.4±1.1*
A+D 21.5±4.7# 1088±71# 240±35# 36.5±3.1# 7.0±0.8#
A+B 23.2±5.1## 1130±101## 263±51## 38.9±4.2## 7.1±1.2##
A+Y 25.7±6.0## 1135±111## 268±45## 39.1±4.0## 7.2±1.3##

[0079] 与假手术组比较：*P<0.01，与模型组比较：,#P<0.01，##P<0.05[0080] 2）丹参素钠和丹酚酸B制备工艺对比：

[0081] 丹参素钠的提取工艺：取丹参药材，以8倍量0.5mol/L盐酸水溶液加热回流2次，每次1.5小时，合并药液，过滤，滤液浓缩至5L。打入多极逆流萃取器，用正己烷-乙酸（1：1-5）混合溶剂进行多极萃取，取下相溶液，加入201×1型强碱性阴离子交换树脂柱进行吸附，用1mol/L NaOH溶液洗脱液，浓缩，冷藏，析出结晶，分离结晶即得。

[0082] 丹酚酸B制备工艺：步骤1，先向丹参药材饮片加入丹参饮片质量8-18倍、质量浓度为35%-60%的乙醇和体积为乙醇体积1%-4%、浓度为1mol/L的盐酸浸泡1-2小时，然后回流提取1.5-3小时，滤出丹参药液，再向药渣加入药渣质量6-16倍、质量浓度为35%-60%的乙醇和体积为乙醇体积1%-4%、浓度为1mol/L的盐酸，回流提取1-2小时，滤出丹参药液，合并两次提取的丹参药液，再减压浓缩成相对密度为1.16-1.24的丹参清膏；步骤2，向丹参清膏中加入丹参清膏重量3-5倍的水，边加水边搅拌，室温下静置12-24小时，再过滤，丹参滤液用盐酸调节pH值为2.8-3.2，得到丹参酸化滤液；步骤3，将大孔吸附树脂柱用pH值为2.8-3.2的盐酸酸化，将步骤2得到的丹参酸化滤液上样于大孔吸附柱上，用5-7倍树脂体积pH值为2.8-3.2的盐酸冲洗杂质，再用质量浓度为35%-55%的乙醇洗脱，收集1.5-2.5倍树脂体积的丹参洗脱液，用氢氧化钠溶液调节丹参洗脱液的pH值为4.0-4.2，减压浓缩至相对密度为1.08-1.25的丹酚酸清膏，即得丹酚酸B。

[0083] 从上述制备工艺可以得出，丹参素钠的提取工艺要比丹酚酸B提取工艺简单。如果从市场上直接购买丹参素钠或丹酚酸B时，丹参素钠的价格要比丹酚酸B的价格低的多。 [0084] 结果表明，羟基红花黄色素A+丹参素钠（A+D）组不仅治疗效果最佳，而且制备工艺简单，成本低。

[0085] 3.以实施例1制备的药物进行试验。

[0086] 表4 缺血再灌注大鼠MIS，血清CK-MB和LDH水平的影响( ,n=12)组别 MIS/% CK-MB/(U·L-1) LDH/(U·L-1)
假手术组 4.3±1.1 990±75 210±46
模型组 30.2±5.9* 1231±103* 311±53*
丹红注射液组 21.6±5.2# 1118±128# 275±39#
#,## #,## #,##
注射液组 17.2±3.8 1000±117 238±38

[0087] 与假手术组比较：*P<0.01，与模型组比较：,#P<0.01，与丹红注射液组比较：##
P<0.05

[0088] 表5 缺血再灌注大鼠血清NO水平和NOS活性的影响( ,n=12)组别 NO/(μmol·L-1) NOS/(U·mL-1)
假手术组 35.3±3.5 6.8±0.9
模型组 43.7±5.6* 8.4±1.1*
丹红注射液组 38.9±3.9# 7.5±0.8#
注射液组 35.6±2.4#,## 6.9±0.6#,##
,#

[0089] 与假手术组比较：*P<0.01，与模型组比较：P<0.05，与丹红注射液组比较：##
P<0.05

[0090] 表6 不同比例配比注射液对缺血再灌注大鼠的影响( ,n=12)组别 MIS/% CK-MB/(U·L-1) LDH/(U·L-1) NO/(μmol·L-1) NOS/(U·mL-1)
假手术组 4.3±1.1 990±75 210±46 35.3±3.5 6.8±0.9
模型组 30.2±5.9* 1231±103* 311±53* 43.7±5.6* 8.4±1.1*
1:1 23.1±4.7# 1180±99# 279±44# 40.8±4.4# 7.8±1.7#
# # # # #
1:2 21.6±4.2 1130±101 263±51 38.0±5.0 7.5±1.8
1:3 19.2±4.8# 1090±117# 250±48# 37.0±5.4# 7.2±1.5#
1:4 19.0±5.1#，## 1101±98#，## 258±55#，## 37.4±4.9#，## 7.2±1.7#，##[0091] 注：表中比例为羟基红花黄色素A：丹参素钠；

[0092] 与假手术组比较：*P<0.01，与模型组比较：,#P<0.01，与3:1射液组比较：##P>0.05

[0093] 由此表可以得出结论：

[0094] 四种比例的注射液均有治疗效果，而且随着比例的加大治疗效果明显增加，但1:3组和1:4组相比较无统计学意义。从经济学角度考虑，为了节省原料药，我们最终选择的比例为1：3。

[0095] 4. 临床效果

[0096] 本发明的注射液在临床应用效果的统计数据如下：

[0097] 临床病例共有133例，其中治疗组80例，男51例，女29例；年龄最大78岁，最小45岁，平均年龄66岁。

[0098] 丹红注射液对比组53例，男31例，女22例，年龄最大80岁，最少43岁，平均年龄68岁。

[0099] 疾病的诊断标准：

[0100] 中医诊断及有效评定标准：《胸痹心痛的诊断标准及疗效评定标准》[0101] 治疗方法及观察指标：

[0102] 治疗方法：治疗组应用本发明注射液200ml，静脉注射，每日1次，7天为一个疗程。对比组使用丹红注射液4ml，加入5%葡萄糖注射液20ml稀释后缓慢注射，每日1次，7天为一个疗程。

[0103] 观察指标：两组病例分别治疗1疗程后，临床观察记录临床主要症状为胸闷或胸痛，心悸，气短并检查心电图以及血常规，肝肾功能。

[0104] 治疗效果：

[0105] 治疗组80例，痊愈53例，好转25例，无效2例，总有效率97.5%。

[0106] 对比组53例，痊愈37例，好转10例，无效6例，总有效率88.7%。 [0107] 治疗组的临床有效率和对照组相比较无统计学意义（P<0.05）。 [0108] 采用实施例2-3制得的注射液进行的动物试验和临床效果和采用实施例制得的注射液基本相同。

[0109] 本发明注射液的成分明确、疗效显著，解决了现今丹红注射液等类似复方制剂中成分不明确导致的药物不良反应，甚至发生严重不良反应等问题；本发明的注射液原料药羟基红花黄色素A是通过我们首创的“血清差示色谱法”实验证实为红花中治疗冠心病的主要药效物质，而丹参素已是当今治疗缺血性疾病的首选药物；本发明的注射液原料药均可市场购买，不仅价格低廉，而且纯度较高（>98%），这既解决了丹红注射液等类似复方制剂生产成本较高的问题，同时也解决了产率较低的问题；本发明注射液的制备方法简单，易于操作，且制剂的质量可控性强，稳定性佳。