一种乙酰甲喹人工抗原及其制备的抗体

摘要

本发明公开了一种乙酰甲喹人工抗原及其制备的抗体。本发明提供了一种化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物为将乙酰甲喹进行结构改造得到的化合物，既最大程度保留了乙酰甲喹的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。本发明还保护一种乙酰甲喹人工抗原，为将式(I)所示化合物与载体蛋白欧联得到的偶联物。将所述乙酰甲喹人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。所述人工抗原可用于检测喹噁啉类化合物。所述抗体可用于检测喹噁啉类化合物。式(I)。

权利要求

1.式（Ⅰ）所示化合物；

2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括如下步骤：将乙酰甲喹和羧甲基羟胺反应，获得所述化合物。

3.权利要求1所述化合物与载体蛋白的偶联物。

4.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。

5.权利要求3或4所述偶联物在制备喹噁啉类化合物特异性抗体中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

7.抗乙酰甲喹单克隆抗体杂交瘤细胞1A10，它的保藏编号为CGMCC No.5780。

8.权利要求7所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

9.权利要求3或4所述偶联物，或，权利要求8所述单克隆抗体在检测喹噁啉类化合物中的应用；

所述喹噁啉类化合物为卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、3-甲基喹噁啉-2-羧酸和/或喹噁啉-2-羧酸。

说明书

一种乙酰甲喹人工抗原及其制备的抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及一种乙酰甲喹人工抗原及其制备的抗体。

背景技术

[0002] 喹噁啉类化合物是一类分子中均有喹噁啉-1，4-二氧化物母核结构人工合成的抗菌药，主要成员有喹乙醇(olaquindox，OLA)、卡巴氧(cabadox，CBX)、乙酰甲喹(mequindox，MEQ)和喹烯酮(quinocetone，QCT)等。由于能够抑制多种革兰氏阳性菌和阴性菌，并且对畜、禽、鱼类等具有明显的促生长作用，喹噁啉类化合物被广泛作为饲料添加剂应用。

[0003] 随着研究的深入，发现喹噁啉类化合物有明显的毒副作用，卡巴氧具有遗传毒性和致癌嫌疑，喹乙醇有强的蓄积毒性和致突变性，因此国际上有关喹噁啉类化合物的最高残留限量也有着非常严格的规定，我国出台了相应法规来规范化喹噁啉类化合物的使用。我国禁止将卡巴氧作为饲料添加剂，喹乙醇只能用于仔猪的药物饲料添加剂、严禁用于养禽生产。另外，国内外学者的研究及生产实践表明乙酰甲喹毒性偏大、也不适于用作禽药物饲料添加剂，喹烯酮虽然防病做生长效果好、无毒副作用，但是一种基因毒剂和生殖诱变剂，有致突变、致畸和致癌性。

[0004] 目前，对于饲料中喹噁啉类化合物残留的检测方法研究较少。因此建立一个灵敏、快速、操作简单，适合大量样本筛查的喹噁啉类化合物检测方法是具有重要的经济意义和社会意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种乙酰甲喹人工抗原及其制备的抗体。

[0006] 本发明提供了一种化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物为将乙酰甲喹进行结构改造得到的化合物，既最大程度保留了乙酰甲喹的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。

[0007] 本发明还保护式(I)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：将乙酰甲喹和羧甲基羟胺反应，获得所述化合物。所述反应具体可在无水丙酮与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂(无水丙酮与N，N-二甲基甲酰胺的体积比具体可为1∶1)中进行。所述乙酰甲喹和所述羧甲基羟胺的摩尔比具体可为1∶1.5。

[0008] 本发明还保护一种乙酰甲喹人工抗原，为将式(I)所示化合物与载体蛋白偶联得到的偶联物。所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联比具体可为(8-10)∶1。所述偶联比指的是摩尔比。式(I)所示化合物与所述载体蛋白具体可通过活性酯法偶联。所述乙酰甲喹人工抗原如式(II)所示。所述乙酰甲喹人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。将所述乙酰甲喹人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。将所述乙酰甲喹人工抗原包被酶标板，也可以用于喹噁啉类化合物抗血清的检测。包被原与免疫原结构上的差异可以进一步提高检测的灵敏度和特异性。

[0009]

[0010] 式(I)。

[0011]

[0012] 式(II)。

[0013] 所述乙酰甲喹人工抗原可用于制备喹噁啉类化合物特异性抗体；所述喹噁啉类化合物为乙酰甲喹、卡巴氧、喹乙醇或喹烯酮。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

[0014] 以所述乙酰甲喹人工抗原为免疫原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体具体可为抗乙酰甲喹单克隆抗体杂交瘤细胞1A10分泌的单克隆抗体。

[0015] 本发明还保护一种杂交瘤细胞，命名为抗乙酰甲喹单克隆抗体杂交瘤细胞1A10，简称杂交瘤细胞1A10，已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5780。

[0016] 所述杂交瘤细胞1A10分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

[0017] 所述所述乙酰甲喹人工抗原可用于检测喹噁啉类化合物。

[0018] 所述抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)可用于检测喹噁啉类化合物。

[0019] 以上任一所述喹噁啉类化合物为分子中具有喹噁啉-1，4-二氧化物母核结构的化合物。以上任一所述喹噁啉类化合物为乙酰甲喹、卡巴氧、喹乙醇或喹烯酮。

[0020] 本发明对于喹噁啉类化合物的检测具有重大价值。

附图说明

[0021] 图1为乙酰甲喹的人工抗原紫外光谱图。

[0022] 图2为采用乙酰甲喹制作的标准曲线图。

具体实施方式

[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。乙酰甲喹购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为MO-189。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA。卵清蛋白简称OVA。

[0024] 乙酰甲喹如式(III)所示，分子量为218.21。

[0025]

[0026] 式(III)

[0027] 羧甲基羟胺如式(IV)所示，分子量为77.04。

[0028]

[0029] 式(IV)

[0030] N，N-二甲基甲酰胺(DMF)如式(V)所示。

[0031]

[0032] 式(V)

[0033] N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)如式(VI)所示。

[0034]

[0035] 式(VI)

[0036] 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)如式(VII)所示。

[0037]

[0038] 式(VII)

[0039] 实施例1、制备乙酰甲喹半抗原

[0040] 一、乙酰甲喹半抗原的制备

[0041] 将乙酰甲喹216mg(1mmol)溶于3ml无水丙酮与DMF的混合溶剂(无水丙酮与DMF的体积比为1∶1)中，加入棕色反应瓶中，过程避光，称取羧甲基羟胺116mg(1.5mmol)加入反应瓶，40℃反应16小时，加少量水淬灭反应，用0.1mol/L的NaOH水溶液调pH至10左右，用CH2Cl2萃取，取水相用0.1mol/L的HCl水溶液调pH至3左右，用乙酸乙酯萃取，取油相进行真空干燥，得到56mg产物。

[0042] 二、乙酰甲喹半抗原的表征

[0043] 对步骤一制备的产物进行元素分析，结果如下：

[0044] C：52.06；H：4.32；N：15.10；O：28.38。

[0045] 结果表明，步骤一制备的产物为式(I)所示化合物。

[0046]

[0047] 式(I)。

[0048] 实施例2、乙酰甲喹人工抗原的制备和表征

[0049] 一、乙酰甲喹免疫原的合成和表征

[0050] 1、乙酰甲喹免疫原的合成

[0051] (1)将10mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物溶于2mL N，N’-二甲基酰胺中，加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺和10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液III。

[0052] (2)将30mg牛血清白蛋白加入2mL去离子水中，充分溶解，即为溶液IV。

[0053] (3)将溶液IV加至溶液III中，缓慢搅拌6h后入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，然后于4℃条件下，8000rmp离心30min，取上清，即乙酰甲喹免疫原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存，乙酰甲喹免疫原简称MEQ-BSA，乙酰甲喹免疫原溶液简称MEQ-BSA溶液。

[0054] (4)将MEQ-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白浓度，将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原MEQ-BSA溶液中的MEQ-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。MEQ-BSA溶液中的MEQ-BSA浓度为5.3mg/ml。

[0055] 2、乙酰甲喹免疫原的表征

[0056] 将MEQ-BSA溶液用PBS缓冲液稀释(使MEQ-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL乙酰甲喹的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mL BSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描，紫外光谱扫描结果见图1。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与BSA成功偶联。

[0057] 溶液乙的最大吸收波长值为372nm，溶液丙的最大吸收波长值为280nm。根据公式K＝A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。

[0058] 分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，式(I)所示化合物和BSA的偶联比为8∶1，即8个式(I)所示化合物结合1个BSA。

[0059] 二、乙酰甲喹包被原的制备和表征

[0060] 1、乙酰甲喹包被原的制备

[0061] 用卵清蛋白代替牛血清白蛋白，其它同步骤一的1。

[0062] 乙酰甲喹包被原简称MEQ-OVA，乙酰甲喹包被原溶液简称MEQ-OVA溶液。

[0063] MEQ-OVA溶液中的MEQ-OVA浓度为3.0mg/ml。

[0064] 2、乙酰甲喹包被原的表征

[0065] 用MEQ-OVA代替MEQ-BSA，用OVA代替BSA，其它同步骤一的2。

[0066] 式(I)所示化合物和OVA的偶联比为10∶1，即10个式(I)所示化合物结合1个OVA。

[0067] 实施例3、喹噁啉类化合物单克隆抗体的制备

[0068] Balb/c小鼠：购于北京维通利华实验动物技术有限公司；

[0069] SP2/0骨髓瘤细胞：购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为08060101。

[0070] 一、动物免疫

[0071] 将实施例2制备的MEQ-BSA溶液免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫100μgMEQ-BSA，共免疫4次，每次间隔两周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，后三次的免疫方式为腹膜内注射。

[0072] 二、细胞融合与克隆化

[0073] 1、第四次免疫3天后，取脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。

[0074] 2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到一株可以分泌乙酰甲喹单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为抗乙酰甲喹单克隆抗体杂交瘤细胞1A10(简称杂交瘤细胞1A10)。杂交瘤细胞1A10已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5780。

[0075] 三、细胞冻存和复苏

[0076] 用冻存液将杂交瘤细胞1A10制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

[0077] 四、单克隆抗体的制备与纯化

[0078] 1、增量培养法

[0079] 细胞培养基(7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)。

[0080] 将杂交瘤细胞1A10置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体溶液(-20℃保存)。

[0081] 单克隆抗体中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。

[0082] 采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为21.8mg/ml。

[0083] 2、腹水制备

[0084] Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞5
1A10(5×10 个/只)。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。

[0085] 五、单克隆抗体的鉴定

[0086] 将步骤四的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：

[0087] 1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒(Sigma公司产品，产品目录号为19285)检测单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1。

[0088] 2、抗体效价的测定

[0089] (1)采用实施例2制备的MEQ-OVA溶液(采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100μL/孔；MEQ-OVA的包被浓度为1.0μg/mL。

[0090] (2)4℃孵育16小时。

[0091] (3)封闭并洗板。

[0092] (4)每孔加入100μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液或其稀释液(采用PBS缓冲液进行梯度稀释)。

[0093] (5)室温孵育2h，洗板。

[0094] (6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

[0095] (7)洗板。

[0096] (8)加入TMB显色液，避光显色15min。

[0097] (9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。

[0098] 以OD值达到1.0左右时判定为阳性。抗体效价为1∶320000。

[0099] 3、单克隆抗体灵敏度的计算

[0100] (1)至(3)同步骤2的(1)至(3)。

[0101] (4)每孔加入50μL乙酰甲喹标准品溶液(由乙酰甲喹和PBS缓冲液组成；乙酰甲喹的浓度分别为0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L、24.3μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)；每个浓度设置3个复孔。

[0102] (5)每孔加入50μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液。

[0103] (6)室温孵育2h，洗板。

[0104] (7)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

[0105] (8)洗板。

[0106] (9)加入TMB显色液，避光显色15min。

[0107] (10)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。

[0108] 将采用各个浓度的标准品溶液得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的乙酰甲喹浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图，见图2。

[0109] 对照图2，得到纵坐标数值等于50％对应的乙酰甲喹浓度(μg/L)，即为IC50值。单克隆抗体检测乙酰甲喹的灵敏度(IC50值)为1.2μg/L。

[0110] 4、交叉反应率的计算

[0111] (1)至(3)同步骤2的(1)至(3)。

[0112] (4)每孔加入50μL结构类似物标准品溶液(由结构类似物和PBS缓冲液组成；结构类似物的浓度分别为0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L、24.3μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。

[0113] 结构类似物为：喹乙醇、喹烯酮、卡巴氧、喹赛多、3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)喹噁啉-2-羧酸(QCA)、链霉素、四环素、磺胺喹噁啉、青霉素、莫能菌素、克伦特罗或磺胺嘧啶。

[0114] 喹 乙醇：Dr.Ehrenstorfer GmbH公 司 产 品，货 号C 15716500。 喹 烯 酮：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司产品，货号C 16709000。卡巴氧：sigma公司产品，货号C6770。
链霉素：sigma公司产品，货号85886。四环素：sigma公司产品，货号31741。磺胺喹噁啉：
sigma公司产品，货号45662。青霉素：sigma公司产品，货号46609。莫能菌素：sigma公司产品，货号M5273。克伦特罗：sigma公司产品，货号C5423。磺胺嘧啶：sigma公司产品，货号S8626。

[0115] (5)至(10)同步骤3的(5)至(10)。

[0116] 将采用各个浓度的结构类似物得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的结构类似物浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50％时对应的结构类似物浓度(μg/L)，即结构类似物的IC50值。

[0117] 用下式计算单克隆抗体对其它结构类似物的交叉反应率。

[0118]

[0119] 结果见表1。

[0120] 表1 单克隆抗体特异性

[0121]结构类似物 灵敏度(IC50值) 交叉反应率 结构类似物 灵敏度(IC50值) 交叉反应率[0122]
乙酰甲喹 1.20μg/L 100％ 喹乙醇 1.36μg/L 88％
喹烯酮 0.68μg/L 176％ 卡巴氧 1.87μg/L 64％
喹赛多 3.24μg/L 37％ MQCA 6.67μg/L 18％
QCA 20.3μg/L 6％ 链霉素 无 ＜1％
四环素 无 ＜1％ 磺胺喹噁啉 无 ＜1％
青霉素 无 ＜1％ 莫能菌素 无 ＜1％
克伦特罗 无 ＜1％ 磺胺嘧啶 无 ＜1％

[0123] 单克隆抗体与喹噁啉类化合物中的卡巴氧、喹乙醇和喹烯酮有交叉反应，与喹乙醇残留标志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)及卡巴氧残留标志物喹噁啉-2-羧酸(QCA)分别有18％及6％的交叉反应，与其它结构类似物、催化剂、衍生试剂无交叉反应。

[0124] 5、稳定性

[0125] 将步骤四的1得到的单克隆抗体溶液-20℃放置，不同时间取样，用PBS缓冲液稀释后检测效价，具体步骤如下：

[0126] (1)至(3)同步骤2的(1)至(3)。

[0127] (4)每孔加入50μL单克隆抗体溶液或其稀释液(采用PBS缓冲液进行梯度稀释)。

[0128] (5)至(9)同步骤3的(6)至(10)。

[0129] OD450值见表2。结果表明，在-20℃保存120天单克隆抗体的效价不变。

[0130] 表2 单克隆抗体的稳定性

[0131]

[0132] 6、亲和常数测定

[0133] (1)用MEQ-OVA作为包被原包被酶标板

[0134] 采用实施例2制备的MEQ-OVA溶液(采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100μL/孔；分别设置以下OVA-SAL包被浓度：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。

[0135] (2)4℃孵育16小时。

[0136] (3)封闭并洗板。

[0137] (4)每孔加入100μL单克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释)；稀-1 -2 -2释液中的蛋白质浓度分别为1.25、0.625、0.3125、1.5625×10 、7.8×10 、3.9×10 、-2 -3 -3 -3 -3 -4
1.95×10 、9.75×10 、4.88×10 、2.44×10 、1.22×10 、6.1×10 mg/L；

[0138] (5)室温孵育2h，洗板。

[0139] (6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

[0140] (7)洗板。

[0141] (8)加入TMB显色液，避光显色15min。

[0142] (9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。

[0143] 以单克隆抗体中的蛋白质浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标制作曲线。

[0144] 每个抗原包被浓度得到1条S型曲线，共得到4条S型曲线。找出S曲线的顶部，对应的OD450值设定为ODMAX。分别找出各条曲线50％ODMAX对应的抗体浓度。采用1μg/-12mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为8.9×10 mol/L。采用0.5μg/mL包被浓度，-12
50％ODMAX对应的抗体浓度为27.4×10 mol/L。采用0.25μg/mL包被浓度，50％ODMAX-12
对应的抗体浓度为180.9×10 mol/L。采用0.125μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗-12
体浓度为374.6×10 mol/L。

[0145] 将4个浓度两两一组，根据公式计算单克隆抗体的亲和常数

[0146] Ka＝(n-1)/2(n[Ab]t1-[Ab]t2)

[0147] 公式中，n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab]t1、[Ab]t2分别为每组中两个50％ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。例如：1μg/mL包被浓度50％ OD450对应的抗体浓度为-12 -128.9×10 mol/L，包被0.5μg/mL包被浓度50％ OD450对应的抗体浓度为27.4×10 mol/-12 -12 9 -1
L，Ka＝(2-1)/2(2×27.4×10 -8.9×10 )＝10.8×10M 。依次类推，得到其余5个Ka
9 -1 9 -1 9 -1 9 -1 9 -1
值，分别为1.49×10M 、0.91×10M 、2.1×10M 、1.0×10M 、1.17×10M ，取平均值计
9 -1
算得出单克隆抗体的亲和常数为2.91×10M 。