58Fe氯高铁血红素、其制备及其在药动学研究中的应用

摘要

本发明涉及药物合成和药动学领域，具体涉及一种含稳定性同位素58Fe的氯高铁血红素及其合成方法。其用下列方法制备：a、将同位素58Fe粉用过量的稀盐酸氧化，生成同位素氯化亚铁溶液，蒸发挥去水分，真空干燥制得同位素氯化亚铁晶体；b、将制得的同位素氯化亚铁晶体与酸化的原卟啉二钠反应，控制反应前体系pH为5～7；c、蒸去大部分反应溶剂后，水洗，加入无机酸调节体系pH为1～2，超声振荡，静置后抽滤，即得。本项发明为内源性物质的体内过程研究提供了一种高准确度，高灵敏度的研究方法，即利用同位素标记的方法对内源性物质的核心骨架部分进行标记，通过测定标记的内源性物质含量来定量研究其体内过程。

权利要求

58

1.一种以 Fe标记的氯高铁血红素I的制备方法，包括： 58

a、将同位素 Fe粉用过量的稀盐酸氧化，生成同位素氯化亚铁溶液，将得到的氯化亚铁溶液旋转蒸发挥去水分，真空干燥制得同位素氯化亚铁晶体； b、将制得的同位素氯化亚铁晶体与酸化的原卟啉二钠反应，控制反应前体系pH为5～7，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺； c、蒸去大部分反应溶剂后，水洗，加入无机酸调节体系pH为1～2，超声振荡，静置后抽滤，即得。 2.权利要求1的制备方法，还包括将抽滤后的产品通过重结晶和柱层析法纯化。 3.权利要求1的制备方法，其中b步骤反应温度为110℃～150℃，反应时间为0.75～11个小时。

4.权利要求1的制备方法，其中同位素氯化亚铁晶体与酸化的原卟啉二钠摩尔比1.2:1～20:1。

5.权利要求1的制备方法，其中原卟啉二钠与N,N-二甲基甲酰胺溶液的用量为1:100～1:200g/ml。 58

6.权利要求1的 Fe标记的氯高铁血红素用于定量测定药物体内代谢过程的标记物的用途。

说明书

58

Fe氯高铁血红素、其制备及其在药动学研究中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物合成和药动学研究领域，具体涉及一种含稳定性同位素58Fe的氯高铁血红素及其合成方法。

背景技术

[0002] 氯高铁血红素是血红素(铁卟啉)的稳定形态。它是国际上公认的防治缺铁性贫血最有效的药物。其主要特点为含铁量高，无胃肠道刺激性，易于为人体所吸收、生物利用度好，进入人体后直接以分子形式在胃肠道中被吸收，吸收速率较快，补铁效果明显；所以很多科研人员都将其看作替代目前市场上占主导地位的无机补铁剂的最优选择。除此之外，氯高铁血红素还广泛的应用于食品行业中，作为多种食品的添加剂，起着治疗缺铁性贫血的功能性作用。

[0003] 目前制备氯高铁血红素纯品的方法主要是从天然的动物血液中提取纯化得到氯高铁血红素；之前已有学者对于金属卟啉及其衍生物的合成做出了研究报导，但这些报道58
大多叙述简单模糊，缺乏严谨，难以重现；同时，关于利用铁的稳定性同位素 Fe进行氯高铁血红素合成的实验尚未见报导。

[0004] 在药动学研究领域，由于铁是人体的内源性物质，随着时间的不同，血液中铁的浓度也会出现较大程度的波动。故在对含铁药物，如氯高铁血红素的补铁效果和体内过程进行研究时，如何尽量排除机体内源性铁的干扰，得到能准确反映外源性铁的体内过程实验数据，便成为了研究人员最为关心的问题。许多学者也曾经对此做出过种种尝试，但至今仍未找到一种有效的研究方法。

发明内容

[0005] 本发明公开了一种利用58Fe合成同位素标记的氯高铁血红素(I)及其制备方法，可用于定量研究氯高铁血红素这种内源性药物，同时也为建立一种新的定量研究其他含铁药物的体内过程提供物质基础。

[0006] 本发明的以58Fe标记的氯高铁血红素，结构式(I)如下：

[0007]

[0008] 本发明的58Fe标记的氯高铁血红素的制备方法，包括：

[0009] a、将同位素58Fe粉用过量的稀盐酸氧化，生成同位素氯化亚铁溶液，将得到的氯化亚铁溶液旋转蒸发挥去水分，真空干燥制得同位素氯化亚铁晶体；

[0010] b、将制得的同位素氯化亚铁晶体与酸化的原卟啉二钠反应，控制反应前体系pH为5～7；

[0011] c、蒸去大部分反应溶剂后，水洗，加入无机酸调节体系pH为1～2，超声振荡，静置后抽滤，即得。

[0012] 上述方法还进一步包括重结晶。

[0013] 其中b步骤反应温度优选110℃～150℃，反应时间优选0.75～11个小时。 [0014] 其中同位素氯化亚铁晶体与酸化的原卟啉二钠摩尔比优选1.2∶1～20∶1。 [0015] 其中b步骤的反应溶剂优选N，N-二甲基甲酰胺。

[0016] 其中原卟啉二钠与N，N-二甲基甲酰胺溶液的用量优选1∶100～1∶200g/ml。 [0017] 更优选的制备方法包括：

[0018] a向装有同位素58Fe粉和无氧水的烧瓶中通入刚生成的HCl气体直至铁粉完全消失，得到58FeCl2溶液；将得到的58FeCl2溶液在N2保护环境中旋转蒸发挥去溶剂，真空干燥12h制得同位素氯化亚铁晶体；

[0019] b以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，将制得的同位素氯化亚铁晶体与酸化的原卟啉二钠进行络合反应，反应前控制体系呈弱酸性pH为5～7，以薄层色谱监测，待原料原卟啉消失或不再减少时，停止反应。

[0020] c反应结束后旋转蒸发仪上除去大部分溶剂，水洗，加入无机酸调节体系pH呈强酸性 pH为1～2，超声振荡30min，静置后抽滤，通过重结晶和柱层析法，纯化得到同位素氯高铁血红素纯品。

[0021] 上述步骤a中同位素氯化亚铁晶体的制备过程，其中盐酸优选由氯化钠/氯化铵和浓硫酸反应生成氯化氢气体溶解于无氧水中而得；在蒸发挥去溶剂过程中，必须以N2保护整个过程以避免亚铁被氧化成高铁。

[0022] 上述步骤b中原卟啉二钠与反应溶剂N，N-二甲基甲酰胺的比例优选为1∶100～1∶200(g/ml)。所述的反应前体系的pH应严格的控制在5～7，回流温度为110～150℃，反应时间为0.75～11h。酸化试剂选择为浓盐酸或者稀盐酸。

[0023] 上述步骤c中水洗后应控制体系pH值为1～2，超声振荡充分以保证多余的无机铁离子的溶解。调节酸性的试剂选择为浓盐酸。

[0024] 为了提高产品纯度和产率，还优选将上述制备的产品进一步包括将抽滤后的产品通过重结晶和/或柱层析法纯化。

[0025] 所述重结晶方法，是以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂重结晶。更优选的方法是将同位素氯高铁血红素粗品溶于DMF中，过滤，滤饼以少量DMF洗涤，合并滤液。按照粗品∶水∶表面活性剂＝1∶100∶13(w∶v∶w)的比例将滤液加入至溶有表面活性剂氯化苄基十二烷基二甲胺的水溶液中，升温至90℃，搅拌10min。向溶液中缓慢滴加20％的盐酸溶液至溶液pH为1～2。静置溶液数小时后，抽滤，洗涤滤饼至中性，干燥，既得高纯度的同位素氯高铁血红素。

[0026] 所述柱层析方法，目的是为了保证重结晶过程中的滤饼中产品的充分回收。取重结晶中过滤粗品后所剩的滤饼，以DMF充分溶解，超声振荡。加入适量硅胶，减压蒸馏除去溶剂。将此待分离的样品转移至层析柱中，先以甲醇∶二氯甲烷＝1∶50的洗脱剂进行分离；不断改变洗脱剂比例，调整极性，收集甲醇∶二氯甲烷＝1∶10的洗脱液，混合浓缩，60℃水浴中以氮气吹干。即可得到纯度＞96％的同位素氯高铁血红素纯品。 [0027] 研究过程中发明人发现：利用同位素铁合成氯高铁血红素的难点主要在于控制反应过程中和后处理时体系的pH值，其次是反应的温度和两种反应原料的摩尔比。之前所有关于金属卟啉类似物的合成报道对反应体系的pH值都未做出详尽的研究。本发明揭示在原卟啉二钠和无机金属盐反应时，若体系pH过酸，则会抑制络合反应的进行；若体系的pH偏碱，原卟啉会重新形成钠盐形式二从溶剂DMF中析出，并且无机金属盐会成碱，溶解性降低；故需要保证体系的pH呈微弱酸性，控制在5～7最优。中国专利CN 1418885A公开了一种铁卟啉钠盐的制备方法，在其后处理过程中仅以质子酸中和至pH＝4时析晶。但本发明揭示，在后处理过程中，需调节体系的pH呈强酸性，以1～2最佳；若酸性不够强，则反应剩余的无 机金属离子会夹杂在产物中，影响产物的纯度。

[0028] 在反应温度选择方面，之前关于金属卟啉类似物的合成报道选择的温度为≤70℃，或叙述含糊不清。中国专利CN 1944434A公开的金属卟啉的合成方法中介绍以混合溶剂在低温条件下进行反应；中国专利CN 1418885A公开的铁卟啉钠盐的制备方法中提供的反应温度为10～70℃。但本发明在单一溶剂和较高的温度范围内进行反应，也得到了纯度很高的产品；本发明选择的温度范围为110～150℃，并且发现反应的温度同原料的投料比共同的影响着产物的纯度。

[0029] 目前通行的金属卟啉合成方法均为投入过量的无机金属盐(通常为原卟啉摩尔量的3～8倍)以保证原卟啉的充分反应；这种情况下，该合成反应的反应程度非常完全，无副产物生成，得到的氯高铁血红素纯度一般在98％以上。但是在本项发明中，考虑到稳定性同位素铁粉的经济成本，必须要尽可能的保证无机铁盐的充分反应，同时兼顾反应主产物的收率。

[0030] 在对反应物的纯化方法选择方面，本发明选择了重结晶与柱层析相结合的方法，这种方法可以保证在得到高纯度产品的同时，最大程度的实现产品的回收利用。关于血红素重结晶的方法，前人已做过很多研究。经典的方法包括：冰醋酸法，酸性丙酮法，碱溶酸沉淀法和表面活性剂法。前几种方法因需要耗费大量的有机试剂，对环境造成较大污染，对生产设备要求较高和得到纯化后的产品晶型不确定而未被本发明采用。在表面活性剂的选择方面，前人多使用壬基苯酚聚乙二醇醚，十四烷基内铵盐，柠檬酸或以上几种混合而组成的表面活性剂。本发明采用的表面活性剂种类为氯化苄基十二烷基二甲胺，使用这种表面活性剂所得到的同位素氯高铁血红素晶体纯度较高，形状规则、一致，呈棕红色窄的平行四边形。收集重结晶过程中溶解于溶液中的剩余产品，以硅胶柱层析的方法梯度洗脱，收集相应洗脱组分，可以回收得到高纯度的产品，实现合成出的粗品最大程度的纯化处理。 [0031] 本项发明为内源性物质的体内过程研究提供了一种新颖，高准确度，高灵敏度的研究方法，即利用同位素标记的方法对内源性物质的核心骨架部分进行标记，通过测定标记的内源性物质含量来定量研究其体内过程。

附图说明

[0032] 图1是58Fe标记的氯高铁血红素的质谱图

[0033] 图2是大鼠单剂量灌胃给予40mg/kg 58Fe氯高铁血红素后的血药浓度-时间曲线 具体实施方式

[0034] 实施例1

[0035] 1.称取0.240g同位素58Fe粉(ISOFLEX USA，San Franciso，No.26-01-58-4030)，转移至单颈烧瓶中，加入25ml无氧水，向单颈瓶液面以下通入刚生成的HCl气体(由氯化58
钠/氯化铵和浓硫酸反应生成)，油浴加热直至 Fe粉彻底消失。氮气保护下，在旋转蒸发仪上挥去反应液中的水分，得到同位素氯化亚铁固体；真空干燥箱中干燥12h，得到同位素氯化亚铁晶体。

[0036] 2.在带有搅拌子，温度计和空气回流冷凝器的500ml三口圆底烧瓶中加入2.0918g原卟啉二钠(东京化成工业株式会社，东京都北区丰岛6-15-9，Lot.GG01)，以约
220ml DMF为溶剂溶解，加入770ul浓盐酸酸化，超声振荡充分溶解，此时体系pH值为6～
7。将步骤1中所得的同位素氯化亚铁晶体加入反应体系中，在搅拌下控制温度为120℃，反应11h，以薄层色谱点板监测原料点的颜色深浅，待到原料点的颜色不再变浅后停止反应。
测定反应终止液的pH以保证其弱酸性，减压蒸馏出大部分DMF，冷却，加入1200ml冷的蒸馏水冲洗。加入12ml浓盐酸酸化，测定其pH为1～2，超声振荡30min，静置悬浊液；抽滤，弃去滤液，干燥后重结晶得到同位素氯高铁血红素的纯品。

[0037] 3.取同位素氯高铁血红素粗品2g，以150ml DMF充分溶解搅拌。过滤，滤饼以5ml DMF洗涤，合并滤液。向滤液中加入500ml水和26g氯化苄基十二烷基二甲胺，升温至90℃，搅拌10min。向溶液中滴加20％的盐酸溶液至溶液pH为1～2。静置溶液数小时后，抽滤，洗涤滤饼至中性，干燥，既得高纯度的同位素氯高铁血红素。

[0038] 4.取上一步中过滤粗品后所剩的滤饼，以DMF充分溶解，超声振荡。加入适量硅胶，减压蒸馏除去溶剂。将此待分离的样品转移至层析柱中，先以甲醇∶二氯甲烷＝1∶50的洗脱剂进行分离；不断改变洗脱剂比例，调整极性，收集甲醇∶二氯甲烷＝1∶10的洗脱液，混合浓缩，60℃水浴中以氮气吹干。RP-HPLC分析，纯度为96.7％，满足同位素氯高铁血红素的纯度要求。

[0039] RP-HPLC：

[0040] Hypersil C18柱4.6mm×200mm，20℃

[0041] 流动相：甲醇∶乙腈∶水∶醋酸∶吡啶＝40∶40∶19∶1∶0.6

[0042] 流速：1ml/min

[0043] 波长：399nm(紫外检测器)

[0044] 产率：9.74min(96.7％)

[0045] 其质谱图见图1，主要离子峰归属解释：

[0046] ①m/z 617.132峰：[M-Cl]+。

[0047] ②m/z 559.194峰：[M-Cl-C2H3O2]+。

[0048] (③m/z 499.983峰：[M-Cl-C2H3O2-C2H3O2]+。

[0049] 实施例2

[0050] 1.称取0.8589g同位素58Fe粉(ISOFLEX USA，San Franciso，No.26-01-58-4030)，转移至单颈烧瓶中，加入20ml无氧水，向单颈瓶液面以下通入刚生成的HCl气体(由氯化58
钠/氯化铵和浓硫酸反应生成)，油浴加热直至 Fe粉彻底消失。氮气保护下，在旋转蒸发仪上挥去反应液中的水分，得到同位素氯化亚铁固体；真空干燥箱中干燥12h，得到同位素氯化亚铁晶体。

[0051] 2.在带有搅拌子，温度计和空气回流冷凝器的100ml三口圆底烧瓶中加入0.4652g原卟啉二钠(东京化成工业株式会社，东京都北区丰岛6-15-9，Lot.GG01)，以约
50ml DMF为溶剂溶解，加入130ul浓盐酸酸化，超声振荡充分溶解，此时体系pH值为5～
6。将步骤1中所得的同位素氯化亚铁晶体加入反应体系中，在搅拌下控制温度为110℃，反应0.75h，以薄层色谱点板监测原料点的颜色深浅，待到原料点的颜色不再变浅后停止反应。测定反应终止液的pH以保证其弱酸性，减压蒸馏出大部分DMF，冷却，加入600ml的冷蒸馏水冲洗。加入10ml浓盐酸酸化，测定其pH为1～2，超声振荡30min，静置悬浊液；抽滤，弃去滤液，干燥后重结晶得到高纯度的同位素氯高铁血红素，以RP-HPLC分析，纯度为
98.68％。

[0052] RP-HPLC：

[0053] Hypersil C18柱4.6mm×200mm，20℃

[0054] 流动相：甲醇∶乙腈∶水∶醋酸∶吡啶＝40∶40∶19∶1∶0.6

[0055] 流速：1ml/min

[0056] 波长：399nm(紫外检测器)

[0057] 产率：9.74min(98.68％)

[0058] 实施例3

[0059] 重复实施例2的过程，改变在于控制同位素铁粉与原卟啉二钠的反应摩尔比分别为1∶10和1∶15。可得到纯度分别为91.89％和94.85％的同位素氯高铁血红素纯品。

[0060] 实施例4

[0061] 重复实施例2的过程，改变在于控制络合反应的温度分别为100℃、110℃和150℃。可得到纯度分别为90.83％，93.26％和95.11％的同位素氯高铁血红素纯品。

[0062] 实施例5

[0063] 取清洁级SD大鼠6只，雌雄各半。取配制好的58Fe氯高铁血红素溶液，按40mg/kg剂量灌胃给药，给药前取空白血，给药后于0.5h、1h、1.5h、2h、4h、8h、15h、24h和36h经 眼底静脉取血300μL置于事先加好肝素的eppendorf管中混匀，迅速于14000rpm离心5min，取血浆150μL，-70℃保存供测试。以电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定血浆样品中58 58
Fe的浓度，便可以得到给予的 Fe氯高铁血红素的血药浓度曲线和相应的药代动力学参数。结果见表1、表2和图2：

[0064] ICP-MS(X SERIES 2，Thermo SCIENTIFIC)测定条件：离子源为ICP源，采用石英玻璃同心雾化器(0.8mL/m)，整体型石英炬管，1.5mm口径喷射。雾化器氩气流量为0.95L/min。检测模式为CCT模式。检测器模拟级电压为1830v，检测器脉冲级电压为3500v，射频功率为1200w，冷却气流量为14.3L/min，样品提升量为1mL/min，样品提升时间为40s，重复次数为3次，分别选择铁Fe(58)，镍Ni(58)，铬Cr(53)，锗Ge(72)为扫描元素，扫描方式为跳峰扫描。

[0065] 表1.大鼠灌胃给予40mg/kg 58Fe氯高铁血红素后的血药浓度(ng/mL) [0066]

[0067] 表2.大鼠灌胃给予40mg/kg 58Fe氯高铁血红素后的药动学参数

[0068]