人类新基因FAMLF特异性抗体的新增免疫表位及抗体制备与应用转让专利
申请号 : CN201210056172.1
文献号 : CN102617710B
文献日 : 2014-05-07
发明人 : 王少元 , 黄源茂 , 李景岗 , 许能文 , 叶美玲
申请人 : 福建医科大学附属协和医院
摘要 :
本发明公开了一种人类新基因FAMLF特异性抗体的新增免疫表位及抗体制备与应用，所述的人类新基因FAMLF是与家族性急性髓系白血病相关的新基因的cDNA及其完整开放读码框的多核苷酸序列，它包含的2个免疫表位对应的氨基酸残基序列分别：一个免疫表位序列代号为SEQIDNO:1，另一个免疫表位序列代号为SEQIDNO:2。本发明公开的免疫表位及其特异性抗体为今后白血病特异性基因诊断抗体、蛋白芯片、基因芯片、基因药物的研发奠定基础。对于开发研制抗白血病新药，提高白血病诊断准确率与治疗效果，提高福建省白血病的治愈率有重要的作用，有潜在重大的社会与经济效益。本发明为白血病及其他恶性肿瘤的基因诊断和基因治疗奠定基础。
权利要求 :
1.一种人类新基因FAMLF的特异性抗体研制所用的免疫多肽表位：CGMNFDRSRITNK-NH2。
2.针对权利要求1所述的免疫多肽表位的特异性抗体。
说明书 :
人类新基因FAMLF特异性抗体的新增免疫表位及抗体制备
与应用
[0001] 本发明专利申请是针对申请日为2010.02.05、申请号为201010107579.3、发明名称为“人类新基因FAMLF在人基因重组、恶性肿瘤基因检测、特异性单克隆抗体的研制与应用”专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种医药领域，尤其涉及人类新基因(FAMLF)的全长DNA序列、构建出该基因全长cDNA的T克隆、设计出针对该基因的序列特异扩增区域的PCR引物、并研制出针对该基因所表达蛋白的特异性单克隆性抗体，细分所属领域如下：
[0003] (一)分子生物学范畴。
[0004] (二)抗体制备研究领域。
[0005] (三)临床血液病研究领域。
背景技术
[0006] 随着人类基因组计划的完成，人类基因组学研究已实现从结构基因组向后基因组的全面转变，人类基因组中24中染色体的绝大部分的序列(除少数间隔外)已经明确。估计人类基因组中大约有20000-25000个基因。完成基因组序列测定成为破解人类遗传奥秘的历史性开端，接下来的任务更加艰巨，目前主要是要完成以下目标：一是识别、分离、鉴定和克隆所有基因(现在只克隆出一万多个)；二是搞清每个基因的功能及基因之间的相互作用和相互关系。有科学家估计，到21世纪晚些时候，基因治疗有可能走向临床应用大舞台，为人类健康做出重要贡献。而恶性肿瘤由于其高发病率和死亡率而成为基因治疗首选病种，肿瘤相关基因的克隆将为恶性肿瘤的基因治疗提供靶点，是基因治疗的重要基础之一。
[0007] 白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤之一，估计我国白血病的发病率每年2.71/10万，每年死于白血病患者近4万人，五年无病生存率仅达20％左右，难治性复发性白血病发生率有上升趋势。白血病的生物学行为复杂多变，发病机制以及发生、发展的分子生物学基础尚未阐明。临床上对白血病的预防、治疗、预后判断尚缺乏有效的手段，骨髓移植患者的治愈率仅40％左右，目前死亡率仍居高不下。
[0008] 近年来的遗传学研究表明白血病是多基因相关肿瘤，国际上对白血病基础研究的主要进展，很大一部分是来自对白血病相关基因的研究。一些研究结果表明，bcr/abl、c-myc、bcl-1、tal-1、RARa、CAN、MLL、NUP98等癌基因与白血病发生发展有密切相关。国外对白血病的研究热点集中于对白血病相关基因的克隆与鉴定，主要通过构建一般的基因组文库或cDNA文库并进行筛选，但其特异性不高，筛选阳性率较低。福建省白血病发病率高于全国，白血病患者人数众多，白血病基因资源丰富，尤其是白血病高发家系多见，其白血病遗传基因具有独特的研究价值。家族性白血病既是一种血液系统的恶性肿瘤，又是一种与遗传因素高度相关的疾病，其遗传基因具有独特的研究价值。我们1981年起对福建省山区一个白血病高发家系(家系图谱见附图一)，进行了遗传学、细胞遗传学等方面研究，目前课题组成员在以往对此急性白血病高发家系遗传机制进行相关研究的基础上，应用抑制消减杂交(SSH)等分子生物学技术，以IV-18患者骨髓作为Tester，正常人骨髓作为Driver，成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA抑制性消减文库，应用Differential Screening技术筛选鉴定文库，确认28个基因为阳性差异表达基因，阳性克隆送交测序，测序结果提交GenBank进行同源性比对分析，发现了17个有差异表达的白血病相关已知基因的EST片断和11个未知的白血病相关新EST片段，11个新的EST片段全部在美国NIH的基因库GENBANK成功注册。通过一步法半定量RT-PCR筛查，发现其中4条新的EST片段在髓系白血病人中高表达，而在正常人中低表达。选取4条中的zywB-87(GenBank注册号：CV973101)，通过电子克隆和SMART-RACE技术，成功克隆了有差异表达的zywB-87所对应的新基因cDNA全长，该基因定位于染色体1q31.3，cDNA全长2313bp，编码82个氨基酸的蛋白质，含有信号肽，富含亮氨酸重复单位(LRR_SD22)，内在固有无序结构域等功能区。Blast检索FAMLF为功能未知的新基因，已被GenBank收录，并被命名为FAMLF，核酸注册号为EF413001，蛋白质注册号为ABN58747。新基因FAMLF在急性髓系白血病病人中的表达明显高于正常人中的表达，差异有统计学意义(P＜0.01)，通过生物信息学分析预测新基因FAMLF很可能定位于细胞膜，参与细胞信息传递途径中某些蛋白的磷酸化；FAMLF的高表达，可能导致细胞增殖信号的持续活化，或者细胞凋亡信号的抑制，从而导致恶性肿瘤的发生。并已经通过T-A克隆的方法成功构建出包含FAMLF基因全长cDNA的T克隆，已经成功研制出针对FAMLF蛋白特异性单克隆性抗体，经过Western Bloting验证出该新基因表达的蛋白质在急性髓系白血病患者中高表达在正常人中低表达，FAMLF基因的相关功能正在进一步研究证实中。
[0009] 本研究成果，充分利用、发挥该家系遗传学资源的独特优势，紧密结合临床潜在的应用前景，对白血病相关基因的克隆进行针对性的探讨研究。为今后开发白血病特异性基因药物、基因诊断芯片、诊断抗体奠定基础。该项目研究对于开发研制抗白血病新药，提高白血病诊断准确率与治疗效果，提高福建省白血病的治愈率有重要的作用，有潜在重大的社会与经济效益。发明内容：
[0010] 本发明的目的在于提出提出一种人类新基因FAMLF特异性抗体的新增免疫表位及抗体制备与应用。
[0011] 本发明所采用的技术方案是：1、人类新基因FAMLF的特异性抗体研制所用的免疫多肽表位：SEQ ID NO：1 CGMNFDRSRITNK-NH2；2、针对上述免疫多肽表位的特异性抗体。3、人类新基因FAMLF的特异性抗体研制所用的免疫多肽表位：SEQ ID NO：2CRINRISELVESIETVYT-NH2；4、针对上述免疫多肽表位的特异性抗体。
[0012] 本发明的内容包括但不限于：家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的全长cDNA序列、FAMLF基因的完整开放读码框序列，还包括克隆FAMLF基因所用的引物、包含FAMLF基因的重组载体、分析FAMLF基因差异表达所需要的FAMLF基因高效特异扩增的序列(检测基因)、其序列特异扩增区域(sequence characterized amplified region，SCAR)的PCR引物、制备FAMLF基因单克隆抗体所用的免疫多肽表位序列SEQ ID NO：1和序列SEQID NO：2、针对FAMLF基因所表达蛋白质的特异性单克隆抗体以及它们在基础研究、基因诊断、基因质量等领域的相关应用。它们是这样实现的：
[0013] 1、应用抑制消减杂交(SSH)等分子生物学技术，以福建省白血病高发家系患者IV-18的骨髓作为Tester，正常人骨髓作为Driver，成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA抑制性消减文库，应用Differential Screening技术筛选鉴定文库，确认28个基因为阳性差异表达基因，阳性克隆送交测序，测序结果提交GenBank进行同源性比对分析，发现了17个有差异表达的白血病相关已知基因的EST片断和11个未知的白血病相关新EST片段，11个新的EST片段全部在美国NIH的基因库GENBANK成功注册。
[0014] 2、通过一步法半定量RT-PCR筛查，发现其中4条新的EST片段在髓系白血病人中高表达，而在正常人中低表达。选取4条中的zywB-87(GenBank注册号：CV973101)通过电子克隆和SMART-RACE技术，成功克隆了有差异表达的zywB-87(GenBank注册号：CV973101)所对应的新基因cDNA全长，该基因定位于染色体1q31.3，cDNA全长2313bp，编码82个氨基酸的蛋白质，含有信号肽，富含亮氨酸重复单位(LRR_SD22)，内在固有无序结构域等功能区。Blast检索FAMLF为功能未知的新基因，已被GenBank收录，并被命名为FAMLF，核酸注册号为EF413001，蛋白质注册号为ABN58747。
[0015] 3、通过生物信息学分析预测新基因FAMLF很可能定位于细胞膜，参与细胞信息传递途径中某些蛋白的磷酸化；FAMLF的高表达，可能导致细胞增殖信号的持续活化，或者细胞凋亡信号的抑制，从而导致恶性肿瘤的发生。新基因FAMLF在急性髓系白血病病人中的表达明显高于正常人中的表达，差异有统计学意义(P＜0.01)。
[0016] 4、从福建省白血病高发家系中的患者IV-18骨髓液的单个核细胞中提取mRNA，根据上述发现的FAMLF基因序列，设计、合成引物，经RT-PCR扩增、T-A克隆，构建出可编码82氨基酸残基的FAMLF全长cDNA序列的T克隆。
[0017] 5、根据上述发现的FAMLF基因的开放读码框序列见，设计、合成该基因所表达的蛋白质的免疫表位多肽，免疫纽西兰白兔，制备出针对该蛋白的特异性单克隆性抗体，并应用Western Bloting验证该抗体的活性。
[0018] 6、FAMLF基因在mRNA水平的表达分析：根据上述发现的FAMLF基因的cDNA序列，设计、合成该基因的引物，通过一步法RT-PCR对该基因的在急性髓系白血病与正常人之间的差异表达进行分析。
[0019] 7、FAMLF基因在蛋白水平的表达分析：应用上述发明的FAMLF特异性单克隆抗体，通过Western Bloting对该基因的在急性髓系白血病与正常人之间的差异表达进行分析。
[0020] 通过一步法RT-PCR、Western Bloting发现FAMLF在急性髓系白血病中的表达水平比其在正常人的表达水平高，其差别有统计学的意义。FAMLF的高表达，可能导致细胞增殖信号的持续活化，或者细胞凋亡信号的抑制，从而导致恶性肿瘤的发生。
[0021] 本发明提供生产基因FAMLF特异性单克隆抗体所用的多肽表位序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2。
[0022] 本发明还涉及与多肽表位序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2相对应的多核苷酸序列。多核苷酸可以是DNA形式或者是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA、人工合成的DNA或通过基因工程所获得的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸序列可以与序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。编码序列表序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成熟多肽所对应的多核苷酸包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。DNA可以是编码链或非编码链。
[0023] 本发明还涉及多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0024] 本发明还涉及在FAMLF序列信息基础上衍生、设计出来的反义RNA(antisense)、siRNA(small interfering RNA)、核酶(ribozyme)、三链DNA形成脱氧寡核苷酸(triple helix-forming oligo-nucleotides，TFO)等基因治疗产品。
[0025] 本发明的编码人重组基因FAMLF的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。
[0026] 本发明的其它多肽涉及免疫特异性地结合序列序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或保藏克隆编码的多肽、它们的多肽片段或变体、和/或本发明表位(通过本领域熟知用于测定特异性抗体-抗原结合的免疫测定法确定的)的抗体和T细胞抗原受体(TCR)。
[0027] 已知此基本抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每一条链的氨基端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每一条链的羧基端部分规定了恒定区，其主要负责效应功能。人类轻链划分为κ和λ轻链，重链划分为μ、δ、γ、α或ε，并分别将抗体的同种型规定为IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。
[0028] 因此，完整的IgG抗体有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体外，这两个结合位点是相同的。
[0029] 这些链均表现出相同的一般结构，即通过三个超变区(又称作互补决定区或CDR)连接起来的相对保守构架区(FR)。来自每对重链和轻链的CDR通过构架区进行排列，使得可以与特异表位结合。从N端至C端，轻链和重链包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。依据Kabat具有免疫意义的蛋白质的序列(National Institutes of Health，Bethesda，Md。
[0030] 双特异性或双功能抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法制备，这些方法包括融合杂交瘤或连接Fab’片段。此外，双特异性抗体可以形成为“diabodies”。
[0031] 本发明抗体包括，但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)片段，通过Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)，细胞内产生的抗体(即，intrabodies)，和上述所有的结合表位的片段。术语“抗体”在本文中用于指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分或片段，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
[0032] 最优选地，抗体是本发明的人类抗原结合性抗体片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH域的片段。抗原结合性抗体片段，包括单链抗体，可以仅包含可变区或还包含以下所有或部分：铰链区、CH1、CH2、和CH3域。本发明还包括包含可变区和铰链区、CHI、CH2和CH3域的任何组合的抗原结合片段。本发明抗体可以来自任何动物来源包括鸟类和哺乳动物类。优选地，该抗体是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。本文中，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库或分离自不表达内源性免疫球蛋白的一或多种人类免疫球蛋白转基因动物的抗体。本发明抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更多的多特异性的。多特异性抗体可以对于本发明多肽的不同表位具有特异性，或可以对本发明多肽以及对异源表位如异源多肤或固体支持材料具有特异性。
[0033] 本发明抗体可以根据其识别或特异结合的本发明表位或多肽部分来描述或规定。该表位或多肽部分可以按本文所述规定，例如通过N端和C端位置、通过连续氨基酸残基的大小来规定。本发明的优选表位包括：序列SEQ ID NO：2编码的多肽的。本发明包括编码这些表位的多核苷酸。本发明的甚至更优选表位包括相应于本发明家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的胞外环或其片段和变体的肽，例如序列SEQ ID NO：2编码的多肽的氨基酸。
[0034] 本发明抗体也可以根据其交叉反应性来描述或规定。包括不结合本发明多肽的任何其它类似物、直向同源物、同系物的抗体。结合与本发明多肽至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％一致(使用本领域已知的和本文描述的方法计算)的多肽的抗体也包括在本发明内。不和与本发明多肽不足95％、不足90％、不足85％、不足80％、不足75％、不足70％、不足65％、不足60％、不足55％、不足50％一致(使用本领域已知的和本文描述的方法计算)的多肽结合的抗体也包括在本发明中。
[0035] 本发明抗体(包括含有抗体片段或其变体、或由其组成的分子)可以免疫特异性地结合人家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)，序列SEQ ID NO：2所编码多肽和/或猴家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的多肽或多肽片段或变体。优选地，本发明抗体免疫特异性地与人类家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)结合。优选地，本发明抗体免疫特异性地与人和猴的家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)结合。而且，优选地，本发明抗体免疫特异性地结合人家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)和鼠家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)更优选地，本发明抗体免疫特异性地与人家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)结合，其中该抗体对人家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)比对鼠家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)具有较高的亲和性。
[0036] 作为非限制性例子，如果抗体与第一抗原结合的解离常数(KD)小于抗体对于第二抗原的KD时，可以认为该抗体优先地结合第一抗原。
[0037] 本发明抗体还可以根据其与本发明多肽结合的亲和性来描述或定义。优选的-2 -2 -3 -3 -4 -4结合亲和性包括具有小于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M的解离常数或-5 -5 -6 -6 -7
Kd的那些。更优选的结合亲和性包括具有小于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8
10 M、5×10 M或10 M的解离常数或Kd的那些。甚至更优选的结合亲和性包括具有-9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
小 于 5×10 M、10 M、5×10 、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、-14 -14 -14 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、或10 M的解离常数或Kd的那些。
Kd的那些。更优选的结合亲和性包括具有小于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8
10 M、5×10 M或10 M的解离常数或Kd的那些。甚至更优选的结合亲和性包括具有-9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
小 于 5×10 M、10 M、5×10 、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、-14 -14 -14 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、或10 M的解离常数或Kd的那些。
[0038] 本发明还提供竞争地抑制抗体与本发明表位结合的抗体，这是通过本领域已知用于确定竞争性结合的任何方法例如本文描述的免疫测定法确定的。该抗体竞争性地抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％的表位结合。
[0039] 本发明抗体可以用作本发明多肽的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包括部分或完全地破坏受体/配体与本发明多肽相互作用的抗体。优选地，本发明抗体与本文公开的抗原表位或其部分结合。本发明的特征在于受体特异性抗体和配体特异性抗体。本发明还以不妨碍配体结合但阻止受体激活的受体特异性抗体为特征。受体激活(即信号传递)可以通过本文所述或其它本领域已知的技术来确定。例如，可以通过使用免疫沉淀及随后的western印迹分析(见上述)检测受体或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)，确定受体激活。
[0040] 本发明还涉及既阻止配体结合又阻止受体激活的受体特异性抗体、以及识别受体一配体复合物并优选地不特异识别未结合的受体或未结合的配体的抗体。同样，本发明还包括与配体结合并阻止配体与受体结合的中和抗体，以及与配体结合由此阻止受体激活但不阻止配体与受体结合的抗体。本发明还包括激活受体的抗体。这些抗体可以作为受体激动剂起作用，即通过例如诱导受体二聚化，增强或激活所有或部分的配体介导的受体激活的生物学活性。这些抗体可以被确定为生物学活性(包括本文公开的本发明肽的特定生物学活性)的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。上述抗体激动剂可以使用本领域已知方法制备。
[0041] 免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的任何一条重链和/或本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的任何一条轻链的氨基酸序列的多肽。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的任何一个重链VH域和/或本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的任何一个轻链VL域的氨基酸序列的多肽。本发明抗体包含本发明单一抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的VH域和VL域的氨基酸序列。本发明抗体包含本发明两种不同抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系所表达的VH域和VL域的氨基酸序列。本发明还包括如下分子，所述分子包含免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的、本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的VH和/或VL域的抗体片段或变体，或由其组成，本发明还包括编码这些VH和VL域、分子、片段和/或变体的核酸分子。
[0042] 本发明还提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由如下多肽组成，该多肽具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的重链中任何一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列。
[0043] 尤其是，本发明提供包含如下多肽或由如下多肽组成的、免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体，所述多肽具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的重链中VH CDR1的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的重链中VH CDR2的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系袁达的重链中VH CDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或抗体片段或其变体、并免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)片段或其变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
[0044] 本发明还提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的轻链中任何一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列。尤其是，本发明提供包含如下多肽或由如下多肽组成的、免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体，所述多肽具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的轻链中VL CDR1的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的轻链中VLCDR2的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系袁达的轻链中VL CDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或抗体片段或其变体、并免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)片段或其变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
[0045] 本发明还提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽片段或变体的抗体(包括含有抗体片段或变体或由其组成的分子)，其中所述抗体包含本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系所表达的重链或轻链中的一个、两个、三个或更多个VH CDR以及一个、两个、三个或更多个VL CDR，或由它们组成。尤其是，本发明提供免疫特异性结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或多肽变体或变体的抗体，其中所述抗体包含本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系所表达的重链或轻链中VH CDR和VL CDR的VH CDR1和VL CDR1、VH CDR1和VL CDR2、VH CDR1和VL CDR3、VH CDR2和VL CDR1、VH CDR2和VL CDR2、VHCDR2和VL CDR3、VH CDR3和VH CDR1、VH CDR3和VL CDR2、VH CDR3和VL CDR3、或它们的任何组合，或由它们组成。这些组合中的一种或多种来自于本发明单一抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系。包含这些抗体的片段或变体或由其组成的、免疫特异性家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的分子也包含在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段或变体的核酸分子也包括在内。
[0046] 本发明还提供编码本发明抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)的核酸分子，一般是分离的核酸分子。本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的重链的任一个VH域的氨基酸序列的VH域和具有本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的轻链的氨基酸序列的VL域，或由它们组成。本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的重链的任一个VH域的氨基酸序列的VH域或具有本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的轻链的氨基酸序列的VL域，或由它们组成。
[0047] 本发明还提供包含本文所述抗体分子(例如VH域和/或VL域)的变体(包括衍生物)或由其组成的抗体，其中该抗体免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体。可以使用本领域技术人员已知的标准技术将突变引入编码本发明分子的核苷酸序列中，这些技术包括例如导致氨基酸替代的定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，该变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸替代、少于40个氨基酸替代、少于30个氨基酸替代、少于25个氨基酸替代、少于20个氨基酸替代、少于15个氨基酸替代、少于10个氨基酸替代、少于5个氨基酸替代、少于4个氨基酸替代、少于3个氨基酸替代或少于2个氨基酸替代(相对于参考VH域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL域、VL CDR1、VL CDR2或VL CDR3而言)。“保守氨基酸替代”是指将氨基酸残基替代为具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族在现有技术中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，可以沿着全部或部分的编码序列，例如通过饱和诱变随机地引入突变，并可以就生物学活性筛选所获突变体以鉴定保留活性(例如结合家族性急性髓系白血病相关新基因的能力)的突变体。
[0048] 免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或其片段或变体的本发明抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，包含如下核苷酸序列编码的氨基酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与互补于本发明一种或多种抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系表达的一个VH或VL域的编码序列的核苷酸序列杂交，所述杂交的条件是严紧条件，倒如与滤膜结合DNA在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，之后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃下作一或多次洗涤；高度严紧条件，倒如与滤膜结合核酸在6×SSC中约45℃下杂交，之后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约68℃下作一或多次洗涤；或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
[0049] 正如本领域熟知的，具有相似氨基酸序列的多肽、或其片段或变体常常具有相似的结构和许多相同的生物学活性。因此，免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VH域或由其组成，所述氨基酸序列与本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系所表达的重链的VH域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％或至少99％的一致性。
90％、至少95％或至少99％的一致性。
[0050] 免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VL域或由其组成，所述氨基酸序列与本发明抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体表达细胞系所表达的轻链的VL域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性。
[0051] 本发明还包括与本文所述一种或多种抗体具有一种或多种相同生物学特征的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)。所谓“生物学特征”是指抗体的体外或体内活性或性质，如结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)(例如表达在细胞表面的家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)、膜嵌合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)、和/或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的片段或变体)的能力；基本上抑制或破坏家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)与家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)配体结合的能力：下调细胞表面上家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽表达的能力；抑制或破坏家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)介导的生物学活性的能力。任选地，本发明抗体与本文具体提及的至少一种抗体结合相同的表位。该表位结合可以使用本领域已知的测定法确定。
[0052] 本发明还提供中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，所述抗体包含本发明抗体VH或VL域的部分(例如VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和/或VL CDR3)、或由其组成。例如，“中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体”的抗体可以是减小或彻底破坏家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体结合其配体的能力的抗体；和/或彻底破坏或抑制家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)信号传递级联的抗体。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体以及本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体，包含具有本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肤，或由其组成。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF))的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VLCDR域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。中和家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR3域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
[0053] 本发明还提供下调家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的细胞表面表达(通过本领域任何已知方法测定，例如FACS分析测定法)的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)。作为一种非限制性假设，该下调可能是抗体诱导的家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)内化的结果。所述抗体包含具有本发明抗体的氨基酸序列的VH或VL域或其片段或变体的部分(例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)、或由其组成。下调家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体和本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。
[0054] 下调家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的细胞表面表达的抗体，包含具有来自本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。下调家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。下调家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。下调家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。下调家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VLCDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
[0055] 本发明还提供增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有本发明抗体的VH或VL域或其片段或变体的部分(例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体和本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有来自本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有VH CDR域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR城或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。增加家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)活性的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
[0056] 本发明还提供包含免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体(包括含有其抗体片段或变体)和异源多肽或由其组成的融合蛋白。优选地，与抗体融合的异源蛋白是对于功能有用的或对于靶向家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)表达细胞有用的。本发明融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列或由它们组成，所述多肽具有本发明抗体任意一个或多个VH域的氨基酸序列或本发明抗体任意一个或多个VL域的氨基酸序列。本发明融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列，所述多肽具有本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列、或本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列。该融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列，其中所述多肽具有本发明抗体VH CDR3的氨基酸序列，而该融合蛋白可以免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)。融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列，其中所述多肽具有本发明抗体至少一个VH域的氨基酸序列和本发明抗体至少一个VL域的氨基酸序列。优选地，融合蛋白的VH和VL域相应于本发明的单一抗体(或scFv或Fab片段)。本发明融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列或由它们组成，所述多肽具有本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列。优选地，这些VH CDR或VL CDR中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个相应于本发明的单一抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明内。
[0057] 本发明抗体可以用于例如但不限于纯化、检测和靶向本发明多肽，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，可以将这些抗体用于免疫测定以定量和定性地测量生物学样品中本发明多肽的水平。
[0058] 本发明抗体可以以被动免疫的方式给予个体。或者，可以使用本发明多肽进行表位作图以鉴定该抗体所结合的表位。以此方式鉴定的表位又可以例如用作疫苗候选物，即用于免疫个体引起针对天然形式的家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)。
[0059] 正如以下更详细描述的，本发明抗体可以单独使用或与其它组合物组合使用。还可以通过重组方式使这些抗体域异源多肽在N或C端融合，或通过化学方式使这些抗体与多肽或其它组合物缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本发明抗体可以通过重组方式与在检测实验中用作标记的分子以及效应分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素融合或缀合。
[0060] 本发明抗体包括例如通过使该抗体共价结合任何类型分子而修饰的衍生物。例如，但不构成限制，该抗体衍生物包括经过修饰的抗体，所述修饰的例子有糖基化、乙酰化、PEG化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白连接等。许多化学修饰都可以通过已知技术进行，包括但不限于特异化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，该衍生物还可以含有一个或多个非经典氨基酸。
[0061] 本发明抗体可以通过本领域任何适当的已知方法产生。针对目的抗原的多克隆抗体可以通过本领域熟知的多种方法制备。例如，可以将本发明多肽施用于多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导含有特异针对该抗原的多克隆抗体的血清产生。根据宿主物种，可以使用多种佐剂增强此免疫应答，这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全的和不完全的)、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油性乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、和潜在有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂是本领域熟知的。
[0062] 单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多种技术来制备，这些技术包括使用杂交瘤、重组、噬菌体展示技术、或它们的组合。例如，可以使用杂交瘤技术，包括本领域已知的和如Harlow等，抗体：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤563-581(Elsevier，N.Y.1981)(所述参考文献完整地并入本文作为参考)中教导的杂交瘤技术制备单克隆抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单一克隆，包括真核、原核、或噬茵体克隆的抗体，而非指其制备方法。
[0063] 使用杂交瘤技术制备和筛选特异抗体的方法是常规的和本领域熟知的。可以使用本发明多肽或表达该肽的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，即在小鼠的血清中检测到特异针对该抗原的抗体后，收获小鼠的脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知技术将这些脾细胞和任何适当的骨髓瘤细胞融合。通过有限稀释筛选并克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法分析杂交瘤细胞，以寻找分泌能够结合本发明多肽的抗体的细胞。可以通过使用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生一般含有高水平抗体的腹水。
[0064] 因此，本发明提供制备单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地该杂交瘤是通过将分离自使用本发明抗原免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合产生，然后筛选融合产生的杂交瘤以寻找分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。
[0065] 制备多克隆和单克隆人类B细胞系的另一熟知方法是使用埃-巴二氏病毒(EBV)进行转化。制备EBV转化的B细胞系的操作方法是本领域通常已知的，例如Current Protocols in Immunology(Coligan等编，1994，John Wiley&Sons，NY)(特此完整地并入本文作为参考)第7.22章所给操作方法。用于转化的B细胞的来源通常是人外周血，但用于转化的B细胞也可以来源于其它来源，包括但不限于淋巴结、扁桃体、脾、肿瘤组织和感染的组织。一般在EBV转化前将组织制成单细胞悬浮液。此外，可以采取步骤以物理除去或失活含B细胞的样品中的T细胞，因为来自抗EBV抗体血清阳性个体的T细胞会抑制EBV造成的B细胞永生化。一般，用EBV接种含有人类B细胞的样品，并培养3-4周。EBV的典型来源是B95-8细胞系的培养物上清液。一般可以在3-4周培养期结束时观察到EVB转化的物理征兆。通过相差显微镜，转化细胞可以表现为大、明亮、多毛并倾向聚集为紧密的细胞簇。最初，EBV系一般是多克隆的。然而，经过长期的细胞培养，EBV系可以由于特定B细胞克隆的选择性快速生长而变位单克隆的或多克隆的。或者，可以将多克隆EBV转化系亚克隆(例如通过有限稀释培养)或使之与适当的融合伙伴融合并有限稀释铺板以获得单克隆B细胞系。对于EBV转化细胞系，适当的融合伙伴包括小鼠骨髓瘤细胞系(例如SP2/O、X63-Ag8.653)、异源杂交瘤细胞系(人×小鼠：例如SPAM-8、SBC-H20和CB-F7)、和人细胞系(例如GM 1500、SKO-007、RPMI 8826和KR-4)。因此，本发明还提供制备针对本发明多肽或其片段的多克隆或单克隆人抗体的方法，该方法包括EBV转化人B细胞。
[0066] 识别特异表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，本发明Fab和F(ab’)2片段可以通过使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)蛋白水解免疫球蛋白分子产生。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1区。
[0067] 例如，本发明抗体也可以使用本领域已知的多种噬茵体展示文库产生。在噬茵体展示方法中，功能性抗体域被展示在带有编码其的多核苷酸序列的噬茵体颗粒的表面。该噬茵体可以用于展示从所有组成成分或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合域。可以使用抗原，例如使用标记的抗原或与固体表面或珠结合或被其捕获的抗原，选择或鉴定表达结合目的抗原的抗原结合域的噬茵体。用于这些方法的噬茵体典型地是丝状噬菌体，包括fd和M13，噬菌体表达的结合域有重组方式与噬菌体的基因III或基因VIII蛋白融合的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体域。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括公开在如下文献中的那些：Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：
41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等，Gene 187：9-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请PCT/GB9I/01134；PCT公开文本WO90/02809；WO
91/10737；WO 92/01047：WO 92/18169；WO 93/11236：WO 95/15982：20 95/20401；和美国专 利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；
5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；所有均完整地并入本文作为参考。
41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等，Gene 187：9-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请PCT/GB9I/01134；PCT公开文本WO90/02809；WO
91/10737；WO 92/01047：WO 92/18169；WO 93/11236：WO 95/15982：20 95/20401；和美国专 利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；
5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；所有均完整地并入本文作为参考。
[0068] 完全的人抗体尤其适合于治疗人类患者。人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库进行的上述噬茵体展示方法。见例如美国专利4,444,887和4,716,111；和PCT公开文本WO 98/46645，WO 98/50433，WO98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；所有均完整地并入本文作为参考。
[0069] 还可以使用不能表达功能性内源免疫枣蛋白但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备人抗体。例如，可以随机地或通过同源重组向小鼠胚胎干细胞中引入人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物。或者，可以向小鼠胚胎干细胞中引入人可变区、恒定区和多变区以及人重链和轻链基因。可以单独地或在通过同源重组引入人免疫球蛋白位点的同时造成小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因的功能丧失。尤其是，JH区的纯合缺失可以阻止内源性抗体产生。扩增该修饰的胚胎干细胞并将其注射至胚泡中以产生嵌合小鼠。然后饲养嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。以正常方式使用所选抗原，例如本发明多肽的全部或部分免疫该转基因小鼠。使用常规杂交瘤技术可以从该免疫的转基因小鼠获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并随后经过类别转换和体细胞突变。由此，使用该技术可以制备治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于制备人抗体的该技术的综述，见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immun01.13：65-93(1995)。
[0070] 对于制备人抗体和人单克隆抗体的此技术的详细讨论和制备这些抗体的操作方法，参见例如PCT公开文本WO 98/24893：WO 92/01047；WO96/33735；欧洲专利O 598877；美 国 专 利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；
5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181；和6,114,598，所有均完整地并入本文作为参考。此外，可以雇用公司例如Abgenix公司(Fremont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)使用类似于上述方法的技术提供针对所选抗原的人抗体。
5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181；和6,114,598，所有均完整地并入本文作为参考。此外，可以雇用公司例如Abgenix公司(Fremont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)使用类似于上述方法的技术提供针对所选抗原的人抗体。
[0071] 识别所选表位的完全的人抗体可以使用称作“导向选择(guided selection)”的技术产生。在此分中所选非人单克隆抗体即小鼠抗体用于指导选择识别相同表位的完全人抗体。(Jespers等，Bio/technology 12：899-903(1988))。
[0072] 而且，使用本领域技术人员熟知的技术，又可以使用本发明多肽的抗体制备“模拟’，本发明多肽的抗独特型抗体。(见例如Greenspan&Bona，FASEB J.7(5)：437-444(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合并竞争抑制本发明多肽的多肽多聚化和/或与配体的结合的抗体可以用于制备“模拟”多肽多聚化和/或结合域的抗独特型抗体，并由此用于结合并中和多肽和/或其配体。该中和抗独特型抗体或该抗独特型的Fab片段可以用于治疗法以中和多肽配体。例如，可以使用该抗独特型抗体结合本发明多肽和/或结合其配体/受体，并由此激活或封闭其生物学活性。
[0073] intrabody是自重组核酸分子表达的并经改造被滞留在细胞内(例如被滞留在细胞质、内质网或周质)的抗体，常常是scFv。Intrabody可以用于例如破坏该intrabody结合的蛋白质的功能。intrabody的表达还可以通过在包含该intrabody的核酸表达裁体中使用诱导型启动子进行调节。本发明intrabody可以使用本领域已知方法制备，例如公开并综述在下列文献中的那些方法：Chen等，Hum.Gene Ther.5：595-601(1994)；Marasco，W.A.Gene Ther.4：11-15(1997)；Rondon 和 Marasco，Annu.Rev.Microbiol.51；
257-283(1997)；Proba 等，J.Mol.Bi01.275：245-253(1998)；Cohen 等，Oncogene 17：
2445-2456(1998)；Ohage和Steipe，J.Mol.Biol.291：1119-1128(1999)；Ohage等，J.Mol.Biol.291：1 129-1134(1999)：Wirtz 和 Steipe，Protein Sci.8：2245-2250(1999)：Zhu等，J.Immunol.Methods 231：207-222(1999)；和其中所引用文献。
257-283(1997)；Proba 等，J.Mol.Bi01.275：245-253(1998)；Cohen 等，Oncogene 17：
2445-2456(1998)；Ohage和Steipe，J.Mol.Biol.291：1119-1128(1999)；Ohage等，J.Mol.Biol.291：1 129-1134(1999)：Wirtz 和 Steipe，Protein Sci.8：2245-2250(1999)：Zhu等，J.Immunol.Methods 231：207-222(1999)；和其中所引用文献。
[0074] XenoMouse技术：根据本发明的抗体优选通过利用如下转基因小鼠制备，所述转基因小鼠插入了人抗体产生基因的实质性部分但在内源性鼠源抗体的产生上具有缺陷(例如可以从Abgenix Inc.，Fremont，CA获得的XenoMouse系)。然后，这些小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体并无法产生鼠源免疫球蛋白分子和抗体。用于实现此目的的技术公开在本文公开的专利、申请和参考文献中。
[0075] 在YAC中克隆和重构兆碱基大小的人类位点和将其引入小鼠生殖系的能力提供了强有力的工具，以阐明极大或粗略作图的位点的功能性成分以及产生有用的人类疾病模型。而且，用人类等价物取代小鼠位点的该技术的应用也可以提供关于发育期间人类基因产物的表达和调节、它们与其它系统的通讯、和它们参与的疾病诱导和进程的独特看法。
[0076] 该策略的一个重要实际应用是小鼠的体液免疫系统“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)位点引入内源性Ig基因已失活的小鼠中，为研究抗体程序化表达和组装的机制以及它们在B细胞发育中的作用提供了机会。而且，该策略可以为制备全人单克隆抗体(Mab)提高了理想的来源，这是朝向实现抗体治疗人类疾病希望的一个重要里程碑。
[0077] 预期全人抗体可以最小化免疫应答和过敏反应，这些是小鼠或小鼠衍生的单克隆抗体所固有的，从而由此增加所施用抗体的效率和完全性。可以预期全人抗体在要求重复施用抗体的慢性和复发性人类疾病(例如癌症)的治疗中能够提供实质性的优点。
[0078] 达到此目的的一种方法是使用大片段的人Ig位点改造在小鼠抗体制备方面有缺陷的小鼠，预期此小鼠将产生大量的人抗体所有组成成分而缺少小鼠抗体。大的人Ig片段将保存大可变基因的多样性以及适当地调节抗体的产生和表达。通过利用小鼠机器使抗体多样化和进行筛选以及缺乏对人类蛋白的耐受性，在这些小鼠中复制的人抗体所有组成成分应产生针对任何目的抗原(包括人抗原)的高亲和性抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地制备和选择具有期望特异性的抗原特异性人单克隆抗体。
[0079] 此一般策略联系1994公开的第一只XenoMouseTM系的制备进行了阐明。见GreenTM等，Nature Genetics 7：13-21(1994)。该XenoMouse 系是利用酵母人工染色体(YACS)改造的，所述YACS分别含有245kb和10190kb大小的人重链位点和κ轻链座位的生殖系构象片段，其含有核心可变区和恒定区的序列。对于抗体的重排和表达而言含有人Ig的YAC证明与小鼠系统相容，并能够替代失活的小鼠Ig基因。这由其诱导B细胞发育、产生全人抗体的成熟样人所有组成成分、以及产生抗原特异性人单克隆抗体的能力得到证实。这些结果还提示，含有较大数量的V基因、附加的调节元件和人Ig恒定区的较大部分人Ig座位的引入可以基本上概括对感染和免疫的人体液应答特征性的所有组成成分。近来，Green等的工作扩展到通过分别引入人重链座位和κ轻链座位的兆碱基大小生殖系构象YAC片TM
段而导入约80％以上人抗体所有组成成分以产生XenoMouse 小鼠.见Mendez等Nature Genetics15：146-156(1997)，Green 和 Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，Green，Journal of Immunological Methods 231：11-23(1999)和1996年12月3日提交的美国专利申请08/759,620，所有这些的公开均特此并入作为参考。
段而导入约80％以上人抗体所有组成成分以产生XenoMouse 小鼠.见Mendez等Nature Genetics15：146-156(1997)，Green 和 Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，Green，Journal of Immunological Methods 231：11-23(1999)和1996年12月3日提交的美国专利申请08/759,620，所有这些的公开均特此并入作为参考。
[0080] 人抗小鼠抗体(HAMA)应答导致制备嵌合或人源化抗体的工业。尽管嵌合抗体具有人恒定区和鼠可变区，但预期会观察到某些人抗嵌舍抗体(HACA)应答，尤其是在长期或多剂量使用抗体时。因此，可能期望提供针对家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的完全人类抗体，以便降低HAMA或HACA应答的影响和/或效果。
[0081] 特异针对家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的单克隆抗体是使用杂交瘤技术制备的。(Kohler等，Nature 256：495(1975)：Kohler等，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；Hammerling等，《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》，Elsevier，N.Y.第571-681页(1981))。简而言之，用家族性急性髓系白血病TM
相关新基因(FAMLF)表达载体转染的细胞免疫XenoMOuse 小鼠。免疫后，提取该小鼠的脾细胞并将其与适当的骨髓瘤细胞系融合。任何适当的骨髓瘤细胞系均可以用于本发明。
融合后，所获杂交瘤细胞在HAT培养基上选择性地维持，然后通过有效稀释进行克隆，参见Wands等的描述(Gastroenterology 80：225-232(1981))。然后对通过该选择获得的杂交瘤细胞进行分析以鉴定分泌能够结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的抗体的克隆。
相关新基因(FAMLF)表达载体转染的细胞免疫XenoMOuse 小鼠。免疫后，提取该小鼠的脾细胞并将其与适当的骨髓瘤细胞系融合。任何适当的骨髓瘤细胞系均可以用于本发明。
融合后，所获杂交瘤细胞在HAT培养基上选择性地维持，然后通过有效稀释进行克隆，参见Wands等的描述(Gastroenterology 80：225-232(1981))。然后对通过该选择获得的杂交瘤细胞进行分析以鉴定分泌能够结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的抗体的克隆。
[0082] 本发明涉及免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的完全人类抗体，一般是分离的。基本上是，用家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)表达细胞免疫来自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)表达人抗体的XenMouse小鼠系(免疫操作方法的详情)；从具有高滴度抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体的小鼠回收脾和/或淋巴结细胞(含有B细胞)；并将此回收细胞与髓样细胞系融合以制备永生化杂交瘤细胞系。筛选杂交瘤细胞系以选择和鉴定产生特异针对免疫原的抗体的杂交瘤细胞系。
[0083] 本发明包括免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或其片段、变体或融合蛋白的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)。家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽包括但不限于的家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或的DNA编码的多肽；家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)可以通过重组表达编码的多肽的核酸来制备。
[0084] 免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体包含具有至少一种细胞系表达的任意一条重链和/或至少一种细胞系表达的任意一条轻链的氨基酸序列的多肽。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体的抗体，包含具有至少一种细胞系表达的任意一个重链VH域和/或至少一种细胞系表达的任意一个轻链VL域的氨基酸序列的多肽。本发明抗体包含选自细胞系的相同细胞系表达的VH域和VL域的氨基酸序列。本发明抗体包含来自的不同细胞系的VH域和VL域的氨基酸序列。包含至少一种细胞系表达的VH和/或VL域的抗体片段或变体的或由它们组成的、免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的分子也包括在本发明内，编码这些VH和VL域、分子、片段、和/或变体的核酸分子也包括在内。
[0085] 本发明还提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽、或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的重链中所含的任意一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列。尤其是，本发明提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)并包含如下多肽或由其组成的抗体，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的重链中所含的VH CDR1的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的重链所含的VH CDR2的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的重链所含的VH CDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或其抗体片段或变体或由它们组成的、免疫特异性结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)片段或其变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
[0086] 本发明还提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽、或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的轻链中任意一个、两个、三个、或更多个VL CDR的氨基酸序列。尤其是，本发明提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)、并包含如下多肽或由其组成的抗体，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的轻链中VL CDR1的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的轻链中VL CDR2的氨基酸序列。免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有一种或多种细胞系表达的轻链所含的VL CDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或其抗体片段或变体或由它们组成的、免疫特异性结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)片段或变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
[0087] 本发明还提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的多肽片段或变体的抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)，其中所述抗体包含一种或多种细胞系表达的重链或轻链中的一个、两个、三个或更多个VH CDR和一个、两个、三个或更多个VL CDR，或由它们组成。尤其是，本发明提供免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含一种或多种细胞系表达的重链或轻链中VHCDR和VL CDR的VH CDR1和VL CDR1、VH CDR1和VL CDR2、VH CDR1和VL CDR3、VH CDR2和VL CDR1、VH CDR2和VL CDR2、VH CDR2和VL CDR3、VH CDR3和VHCDR1、VH CDR3和VL CDR2、VH CDR3和VL CDR3、或它们的任何组合，或所述抗体由它们组成。
[0088] 编码相应于Xenomouse系来源抗体的抗家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)抗体的核酸分子
[0089] 本发明还提供编码本发明抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)的核酸分子，其一般是分离的。本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有至少一种细胞系所表达的重链的任一个VH域的氨基酸序列的VII域和具有至少一种表2所示细胞系表达的轻链的氨基酸的VL域，或由它们组成。本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有至少一种细胞系所表达重链的任一个VH域的氨基酸序列的VH域或具有至少一种表2所示细胞系表达的轻链的氨基酸的VL域，或由它们组成。
[0090] 本发明还提供包含本文所述抗体分子(例如VH域和/或VL域)的变体(包括衍生物)或由其组成的抗体，其中该抗体免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或其片段或变体。本领域技术人员已知的标准技术可以用于将突变引入编码本发明分子的核苷酸序列中，包括例如导致氨基酸替代的定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸替代、少于40个氨基酸替代、少于30个氨基酸替代、少于25个氨基酸替代、少于20个氨基酸替代、少于15个氨基酸替代、少于10个氨基酸替代、少于5个氨基酸替代、少于4个氨基酸替代、少于3个氨基酸替代、或少于2个氨基酸替代(相对于参考VH域，即VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3，VL域，即VL CDR1、VL CDR2或VL CDR3而言)。“保守氨基酸替代”是指将氨基酸残基替代为具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族在现有技术中已有定义。
[0091] 这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、D分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸.或者，可以沿着全部或部分的编码序列，例如通过饱和诱变，随机地引入突变，并可以就生物学活性筛选所获突变体以鉴定保留活性(例如结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的能力)的突变体。
[0092] 免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或其片段或变体的本发明抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，包含如下核苷酸序列编码的氨基酸序列或由其组成，所述核苷酸序列可与互补于一种或多种细胞系表达的一种VH或VL域的编码序列的核苷酸序列杂交，所述杂交的条件是严紧条件，例如与滤膜结合的DNA在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，之后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃下作一或多次洗涤；高度严紧条件，例如与滤膜结合的核酸在6×SSC中约45℃下杂交，之后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约68℃下作一或多次洗涤；或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件(参见例如Ausubel，F.M.等编，1989，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
[0093] 正如本领域熟知的，具有相似氨基酸序列的多肽、或其片段或变体常常具有相似的结构和许多相同的生物学活性。因此，免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VH域或由其组成，所述氨基酸序列与表2所列至少一种细胞系所表达的重链的VH域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性。
[0094] 免疫特异性地结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VL域或由其组成，所述氨基酸序列与至少一种细胞系所表达的轻链的VL域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性。
[0095] 编码抗体的多核苷酸
[0096] 本发明抗体(包括抗体片段或变体)可以通过本领域任何已知方法制备。例如，应当理解根据本发明的抗体可以在非杂交瘤细胞系的细胞系中表达。例如，可以使用编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列转化适当哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞或制备噬菌体展示文库。此外，本发明多肽抗体可以通过化学方法合成或通过使用重组表达系统产生。
[0097] 制备本发明抗体的一个途径是克隆任何一种或多种杂交瘤细胞系表达的VH和/或VL域。为了从这些杂交瘤细胞系分离VH和VL域，可以使用包括VH或VL核苷酸序列的PCR引物从分离自杂交瘤细胞系的总RNA中扩增表达的VH和VL序列。然后可以使用载体，例如具有由5’和3’单个T核苷酸突出端组成的PCR产物克隆位点的载体(该突变端可以与用于PCR反应的许多DNA聚合酶添加在PCR产物5’和3’末端的单个腺嘌呤核苷酸突变端互补)，克隆PCR产物。然后可以使用本领域已知的常规方法对此VH和VL域测序。
[0098] 可以将克隆的VH和VL基因置于一种或多种适当表达载体中。作为非限制性例子，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点、和保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物扩增该VH或VL域。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将此PCR扩增的VH域克隆至表达适当免疫球蛋白恒定区(例如分别地用于VH域的人IgG1或IgG4恒定区，和用于κ和λVL域的人κ或λ恒定区)的载体中。优选地，表达该VH或VL域的载体包含适合指导该重链和轻链在所选表达系统中表达的启动子；分泌信号；用于免疫球蛋白可变区、免疫球蛋白恒定区的克隆位点；和选择标记如新霉素。还可以将该VH和VL域克隆至表达必要恒定区的单一载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术(见例如Guo等，J.Clin.Endoctinol.Metab.82：925-31(1997)，和Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-86(1995)，将它们完整地并入本文作为参考)，将重链转换载体(conversion vector)和轻链转换载体共转染至细胞系中以产生表达全长抗体如IgG的稳定或瞬时细胞系。
[0099] 本发明还提供包含编码本发明多肽和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还包括在严紧或较低严紧杂交条件下(例如上文所定义的)与编码如下抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中优选地所述抗体是特异地结合本发明多肽的抗体、优选地是结合具有序列<二>的氨基酸序列的多肽或保藏克隆编码的多肽的抗体。
[0100] 该多核苷酸的获得和该多核苷酸的核苷酸序列的确定可以通过本领域任何已知方法实现。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可以从化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸(例如，Kutmeier等，BioTechniques 17：242(1994)描述的方法)，筒而言之，这包括合成含有编码该抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，将这些寡核苷酸退火并连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
[0101] 或者，可以从适当来源的核酸制备编码抗体的多核苷酸。如果不能得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成、或使用可与该序列3’和5’末端杂交的合成引物通过PCR扩增从适当来源(例如从产生自或分离自表达该抗体的任何组织或细胞，如经选择表达本发明抗体的杂交瘤细胞的抗体cDNA文库或cDNA文库或核酸、优选poly A+RNA)获得，或通过使用特异针对特定基因序列的寡核苷酸探针，例如从cDNA文库鉴定编码该抗体的cDNA克隆来进行克隆。然后，使用本领域任何熟知的方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆至可复制克隆载体中。
[0102] 一旦测定了该抗体的核苷酸序列和相应氨基酸序列，即可以使用本领域用于操作核苷酸序列的熟知方法，如重组DNA技术、定点诱变、PCR等操作该抗体的核苷酸序列(见例如描述在以下文献中的技术：Sambrook等，1990，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning，Alaboratory Manual)第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等编，1998，Current Pro‘tocols in M01ecular Bi010gy，John wiley&sons，NY，两者均完整地并入本文作为参考)，以制备具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替代、缺失和/或插入。
[0103] 可以通过本领域熟知方法，例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定序列高变区，检查重链和/或轻链可变区的氨基酸序列来鉴定互补决定区(CDR)的序列。使用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入构架区内，例如插入人构架区中以人源化非人抗体，参见以上描述。构架区可以是天然存在的或共有构架区，优选人构架区(参见例如Claothia等，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)列出的人构架区)。优选通过组合构架区和CDR制备的多核苷酸编码特异结合本发明多肽的抗体。优选地，正如以上讨论的，可以在构架区中进行一个或多个氨基酸替代，而且优选氨基酸替代提高抗体与其抗原的结合。此外，可以使用这些方法造成参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸替代或缺失，以产生缺失一个或多个链内二硫键的抗体分子。对该多核苷酸的其它改变也包括在本发明内并属于本领域技术人员的范围。
[0104] 对于一些应用，例如本发明抗体的体外亲和力成熟，可能有用的是将一种或多种本发明抗体的重链和轻链VH和VL域在噬菌体展示文库中表达为单链抗体或Fab片段。例如，可以使用噬菌体展示文库，将编码一种或多种本发明抗体的VH和VL域的cDNA以所有可能的组合进行表达，从而允许选择以优选的结合特征(例如提高的亲和性或提高的关闭速率)结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的VH/VL组合。此外，尤其是，VH和VL区段——本发明一种或多种抗体的VH和VL域的CDR区，可以在体外进行突变。具有“突变”的CDR的VH和VL域在噬菌体展示文库中的表达使得可以选择出以优选的结合特征(例如提高的亲和性或提高的关闭速率)结合家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽的VH/VL组合。
[0105] 在噬菌体展示方法中，功能性抗体域展示在带有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。具体地，从动物cDNA文库(例如人或鼠淋巴样组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库扩增编码VH和VL域的DNA序列。通过PCR经scFv接头将编码VH和VL域的DNA连接起来并将其克隆至噬菌粒载体(例如PCANTAB 6或pComb 3 HSS)中。通过电穿孔使用该载体转化大肠杆菌，并用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体典型地是丝状噬菌体如fd和M13。该VH和VL域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可以使用抗原，例如标记的抗原或与固体表面或珠结合或被其捕获的抗原，筛选或鉴定表达结合目的抗原(例如家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)多肽或其片段)的抗原结合域的噬菌体。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括但不限于公开在如下文献中的那些：Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等。
[0106] 可以使用通过将具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起而开发用于制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger 等，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等，Nature 314：452-454(1985))。正如以上讨论的，嵌合抗体是具有来源于不同动物物种的不同部分的分子，例如具有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些抗体，如人源化抗体。
[0107] 或者，可以采用描述用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778；Bird，Science242：423-42(1988)；Huston 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；和Ward等，Nature 334：544-54(1989))以制备单链抗体。通过将重链和轻链的Fv区片段经氨基酸桥连接导致单链多肽而形成单链抗体。也可以使用在大肠杆茵中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等，Science 242：1038-1041(1988))。
[0108] 提供FAMLF特异性单克隆抗体的制备方法，本发明抗体可以通过本领域已知用于合成抗体的任何方法制备，尤其是化学合成、细胞内免疫(即intrabody技术)、或优选地重组表达技术。制备抗体的方法包括但不限于杂交瘤技术、EBV转化、和本文讨论的其它方法以及重组DNA技术的使用，本发明抗体或其片段、衍生物、见如下讨论。一旦通过动物、化学合成、或重组表达产生了本发明抗体分子后，可以通过本领域已知用于纯化免疫球蛋白的任何方法对其进行纯化，这些方法的例子有层析(例如离子交换、亲和、尤其是用于纯化蛋白质A之后的特异抗原的亲和层析，和大小排阻柱层析)、离心、差异溶解、或任何其它用于纯化蛋白质的标准技术。此外，本发明抗体或其片段可以和本文描述的或本领域已知的异源多肽序列融合以利于纯化。本发明提供的FAMLF特异性抗体可以用于免疫学相关分析、治疗技术。这些技术包括但不局限于：Western Bloting分析、免疫比浊法、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫组化、流式细胞分析术、激光共聚焦免疫分析，免疫共沉淀分析。
[0109] 本发明还涉及FAMLF特异性单克隆抗体的变体或类似物(例如本发明抗体的重链或轻链或本发明单链抗体)的重组表达要求构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码本发明抗体分子或抗体重链或轻链、或它们的部分(优选地含有重链或轻链可变区)的多核苷酸后，则可以通过重组DNA技术使用本领域熟知的技术制备用于产生该抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建含有抗体编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。因此，本发明提供包含与启动子可操作地连接的、编码本发明抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制载体。这些载体可以包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列，并且可以将抗体的可变区克隆至该载体中用于表达完整的重链或轻链。
[0110] 本发明包括通过重组方式融合或通过化学方式缀合(包括共价和非共价缀合)了本发明多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20、30、40、50、60、70或80个氨基酸)产生融合蛋白的抗体。该融合不一定是直接的，也可以通过接头序列进行。抗体可以特异针对非本发明多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20、30、40.50、60、70或80个氨基酸)的抗原。例如，可以通过将本发明多肽和特异针对特定细胞表面受体的抗体融合或缀合，而使用该抗体体内或体外将本发明多肽靶向特定细胞系。本发明多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可以和异源蛋白(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端融合。本发明抗体还可以和白蛋白(包括但不限于重组人血清白蛋白)融合，获得嵌合多肽。编码本发明融合蛋白的多核苷酸也包括在本发明内。这些融合蛋白可以例如有利于纯化并可以增加体内半衰期。与本发明多肽融合或缀合的抗体也可以采用本领域已知的方法用于体外免疫测定和纯化方法中。
[0111] 本发明还包括包含与非可变区的抗体域融合或缀合的本发明多肽的组合物。例如，本发明多肽可以与抗体Fc区或其部分融合或缀合。与本发明多肽融合的抗体部分可以包含恒定区、铰链区、CH1域、CH2域和CH3域、或所有域或其部分的任意组合。这些多肽还可以与上述抗体部分融合或缀合形成多聚体。例如，与本发明多肽融合的Fc部分可以通过两个Fc部分之间的二硫键形成二聚体。更高的多聚体形式可以通过将该多肽与IgA和IgM的部分融合来制备。使本发明多肽与抗体部分融合或缀合的方法是本领域已知的。
[0112] 正如以上所讨论的，相应于保藏克隆编码多肽的多肽、多肽片段、或变体的多肽可以通过使用本领域已知方法和上述抗体部分融合或缀合以增加该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。而且，相应于保藏克隆所编码多肽的多肽可以和上述抗体部分融合或缀合以利于纯化。与具有二硫键连接的二体结构(由于IgG)的抗体融合或缀合的本发明多肽也可以比单纯的单体分泌蛋白或蛋白片段在结合和中和其它分子方面更有效。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有益的，因此可以导致例如提高的药物动力学性质。或者，在融合蛋白质表达、检测和纯化后可能期望除去该Fc部分。例如，当融合蛋白用作免疫抗原时，该Fc部分可能阻碍治疗和诊断。在药物发现上，例如为了高通量地筛选分析以鉴定hIL-5的拮抗剂，将人蛋白质hIL-5与Fc部分融合。
[0113] 而且，可以将本发明抗体或其片段与标记序列如利于纯化的肽融合。该标记氨基酸序列是六组氨酸肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的该标签，尤其是它们中许多已可商业购买获得。六组氨酸使得可以方便地纯化融合蛋白。对于纯化有用的其它肽标签包括但不限于“HA”标签，其相应于流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell 37：767(1984))，和“flag”标签。
[0114] 本发明还包括域诊断或治疗剂缀合的抗体或其片段。这些抗体可以在诊断上用于例如监测肿瘤的发生或进展而作为临床测试程序的一部分，例如以确定给定治疗法的效率。可以通过将该抗体与可检测物质偶联有利检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射活性物质、使用多种正电子发射断层扫描术的正电子发射金属、和非放射活性顺磁金属离子。可检测物质可以直接地与抗体(或其片段)或间接地通过中间体(例如本领域已知的接头)使用本领域技术与抗体偶联或缀合。适当的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、D半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适当荧光物质的例子包括伞形酮、萤光素、异硫氰酸萤光素、罗丹明、二氯三嗪基胺萤光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素、水母发光蛋白；适当的14
放射活性物质的例子包括碘、碳( C)、硫等。
放射活性物质的例子包括碘、碳( C)、硫等。
[0115] 本发明家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)和/或家族性急性髓系白血111 177
病相关新基因(FAMLF)SV多肽与对于使多肽偶联放射金属离子(包括但不限于 In、 Lu、
90 153 166
Y、Sm、 Ho)有用的大环螯合剂连接。该大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)。DOTA与本发明FAMLF和/或FAMLF SV多肽通过接头分子连接。用于将DOTA和多肽偶联的接头分子的例子是本领域通常已知的。此外，美国专利
5,652,361和5,756,065公开了可以和抗体缀合的螯合剂和它们的制备和使用方法，特此将它们完整地并入作为参考。尽管美国专利5,652,361和5,756,065集中于使螯合剂与抗体缀合，但本领域技术人员可以容易地改动其中所公开的方法使螯合剂与其它多肽缀合。
病相关新基因(FAMLF)SV多肽与对于使多肽偶联放射金属离子(包括但不限于 In、 Lu、
90 153 166
Y、Sm、 Ho)有用的大环螯合剂连接。该大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)。DOTA与本发明FAMLF和/或FAMLF SV多肽通过接头分子连接。用于将DOTA和多肽偶联的接头分子的例子是本领域通常已知的。此外，美国专利
5,652,361和5,756,065公开了可以和抗体缀合的螯合剂和它们的制备和使用方法，特此将它们完整地并入作为参考。尽管美国专利5,652,361和5,756,065集中于使螯合剂与抗体缀合，但本领域技术人员可以容易地改动其中所公开的方法使螯合剂与其它多肽缀合。
[0116] 本发明抗体缀合物可以用于修饰指定的生物学反应，治疗剂或药物部分不应理解为限制于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望生物学活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质包括例如毒素如相思豆毒蛋白、篦麻毒素A、假单胞茵外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α干扰素、β干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂如TNF-q、TNF-β、AIM I、AIM II、Fas配体，VEGI、thromobotic剂或抗血管生成剂如制管张素或endostatin；或生物反应修饰剂例如淋巴因子、白介素
1(“IL-I”)、白介素2(“IL-2”)、白介素6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其它生长因子。
1(“IL-I”)、白介素2(“IL-2”)、白介素6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其它生长因子。
[0117] 还可以使抗体与固体支持物连接，这对于免疫测定或纯化靶抗原尤其有用。该固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚丙乙烯、聚乙烯氯或聚丙烯。
[0118] 将这些治疗部分与抗体偶联的技术是熟知的，见例如Arnon等，“癌症治疗中用于药物的免疫打靶的单克隆抗体”，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antiboides and Cancer Therapy)，Reisfeld 等 ( 编 )，pp243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“用于药物递送的抗体”，《受控的药物递送》(Controlled Drug Delivery)(第2版)，Robinson等(编)pp623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体：综述”，《单克隆抗体’84：生物学和临床应用》(Monoclonal Antibodies’84：Biological and Clinical Applications)，Pinchera等(编)，pp 475-506(1985)：“癌症治疗中放射标记抗体治疗用途的分析、结果、和前景”，《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)，Baldwin等(编)，pp 303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“抗体-毒素缀合物的削备和细胞毒性”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
[0119] 或者，可以将抗体与二抗缀合形成抗体杂缀合物(heteroconjugate)，参见Segal的美国专利4,676,980，其完整地并入作为参考。
[0120] 与治疗部分偶联或未偶联的抗体用作治疗剂时可以单独使用或联合细胞毒性因子和/或细胞因子一起使用。
[0121] 本发明抗体可以用于对细胞系和生物样品进行免疫表型分型。本发明基因的翻译产物可以用作细胞特异标记，或更具体地用作差异表达在特定细胞类型发育和/或成熟不同阶段时的细胞标记。指向特定表位、或表住的组合的单克隆抗体将允许筛选表达该标记的细胞群。在使用单克隆抗体筛选表达该标记的细胞群时，多种技术可以使用，包括使用抗体包被的磁珠进行的磁性分离、使用与固体基质(即板)附着的抗体进行的“淘选”、和流式细胞技术(见例如美国专利5,985,660；和Morrison等，Cell，96：737-49(1999))。
[0122] 这些技术使得可以选择特定细胞群体，例如可以在血液恶性肿瘤(例如急性白血病患者的最小残余疾病(minimal residual disease)(MRD))中发现的那些，和移植物中的“非自体”细胞以防止移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者，这些技术允许筛选能够经历增殖和/或分化的造血干细胞和祖先细胞，例如可以在人脐带血中找到的那些。
[0123] 本发明抗体可以通过本领域任何已知方法分析其免疫特异性的结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性分析系统，所述技术的例子有BIAcore分析、FACS(荧光激活细胞分拣术)分析、免疫荧光、免疫细胞化学法、western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集试验、补体结合试验、免疫放射分析、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，但这仅是举出的几个例子。这些测定是常规的并是本领域熟知的(见例如Ausubel等编1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，其完整地并入本文作为参考)。示例性免疫测定法简要地描述如下(但并不旨在构成限制)。
[0124] 免疫沉淀操作方法一般包括在补加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑酶肽、钒酸钠)的裂解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠(pH 7.2)，1％Trasylol)中裂解细胞群，向细胞裂解物加入目的抗体，于4℃孵育一段时间(例如1-4小时)，向细胞裂解物加入蛋白A和/或蛋白G Sepharose珠，4℃孵育约1小时或更长，在裂解缓冲液中洗涤这些珠，并将这些珠重现悬浮在SDS/样品缓冲液中。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如Western印迹分析评价。本领域技术人员应指导可以经修饰增加抗体与抗原的结合并降低背景的参数(例如用sepharose珠预先清洁细胞裂解物)。对于免疫沉淀操作方法的进一步讨论，参见例如Ausubel等，1994，Current Protocols in Molecular Biology，V01.1，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，10.16.1。
[0125] Western印迹分析一般包括制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如根据抗原的分子量的8％-20％ SDS-PAGE)上电泳此蛋白样品，将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶上转移至膜如硝酸纤维素、PVDF或尼龙膜上，在封闭缓冲液(例如具有3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween 20)中洗涤膜，使用稀释在封闭缓冲液中的一抗(目的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，使用与酶底物(例如辣根过氧化物酶或32 125
碱性磷酸酶)或放射活性分子(例如 P或 I)缀合的二抗(识别一抗的抗体，如抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员将指导可以改变以增加检测信号并降低背景噪音的参数。对于western印迹操作方法的进一步讨论，见例如Ausubel等(编)1994，CurrentProtocols in Mulecular Biology，V01.1，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，10.8.1。
碱性磷酸酶)或放射活性分子(例如 P或 I)缀合的二抗(识别一抗的抗体，如抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员将指导可以改变以增加检测信号并降低背景噪音的参数。对于western印迹操作方法的进一步讨论，见例如Ausubel等(编)1994，CurrentProtocols in Mulecular Biology，V01.1，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，10.8.1。
[0126] ELISA包括制备抗原，用该抗原包被96孔微量滴定板的孔，孔中加入与可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的目的抗体并孵育一段时间，检测抗原的存在。在ELISA中，目的抗体不必与可检测化合物缀合；相反，可以向孔中加入与可检测化合物偶联的二抗(识别目的抗体)。而且，替代用抗原包被孔，可以用抗体包被孔。在此情况下，可以在向包被孔中加入目的抗原后加入与可检测化合物缀合的二抗。本领域技术人员将指导可以改变以增加检测信号的参数以及本领域已知的ELISA的其它变体。对于ELISA的进一步讨论，参见Ausubel等(编)1994，Current Protocols in Molecular Biology，V01.1，Jolln Wiley&Sons，Inc.，纽约，11.2.1。
[0127] 抗体与抗原的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的关闭速率可以通过竞争性结合分析测定。竞争性结合分析的一个例子是放射免疫测定，其包括在存在增加量的未标记3 125
抗原下使标记抗原(例如 H或 I)和目的抗体孵育，并检测与标记抗原结合的抗体。目的抗体对家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的亲和性以及结合关闭速率可以从斯卡查德作图分析的数据确定。也可以使用放射免疫测定确定与二抗的竞争。在此情况下，
3 125
将家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)与偶联了标记化合物(例如 H或 I标记的化合物)的目的抗体在增加量的未标记二抗存在下孵育。两种抗体间的此类竞争性测定也可以用于确定两种抗体是结合相同还是不同表位。
抗原下使标记抗原(例如 H或 I)和目的抗体孵育，并检测与标记抗原结合的抗体。目的抗体对家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的亲和性以及结合关闭速率可以从斯卡查德作图分析的数据确定。也可以使用放射免疫测定确定与二抗的竞争。在此情况下，
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将家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)与偶联了标记化合物(例如 H或 I标记的化合物)的目的抗体在增加量的未标记二抗存在下孵育。两种抗体间的此类竞争性测定也可以用于确定两种抗体是结合相同还是不同表位。
[0128] BIAcore动力学分析被用于确定抗体(包括抗体片段或其变体)与家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)片段的结合开启和关闭速率。BIAcore动力学分析包括分析抗体与表面固定了家族性急性髓系白血病相关新基因(FAMLF)的芯片结合和解离。
[0129] 本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
[0130] 本发明的有益效果：本发明FAMLF基因全长cDNA序列、完整开放读码框的发现，FAMLF基因全长cDNA的克隆、人类新基因FAMLF的特异性抗体研制所用的免疫多肽表位的发现及FAMLF蛋白特异性抗体的发明，所有这些工作为今后白血病特异性基因诊断抗体、蛋白芯片、基因芯片、基因药物的研发奠定基础。该项目研究对于开发研制抗白血病新药，提高白血病诊断准确率与治疗效果，提高福建省白血病的治愈率有重要的作用，有潜在重大的社会与经济效益。本发明有助于深入阐述白血病发生发展的分子生物学机制，为白血病及其他恶性肿瘤的基因诊断和基因治疗奠定基础。本研究具有如下优点：
[0131] 1、新颖性：目前国内外尚未见发病率这么高、规模这么大的急性髓系白血病家系(见图20)的报道，国内尚未见家族性急性髓系白血病相关新基因克隆的报告。
[0132] 2、创造性：克隆出家族性急性髓系白血病相关新基因的cDNA全长，成功预测出该新基因的开放读码框，发明出该基因差异表达引物，发明出针对该新基因的特异性单克隆性抗体，并通过Western Bloting验证该基因表达所用的开放读码框与预测的开放读码框是一致的，应用一步法RT-PCR和Western Bloting发现该基因在白血病患者中高表达在正常人中低表达。
[0133] 3、实用性：在克隆出该新基因全长cDNA序列、确定好开放读码框并发明出该基因差异表达分析引物、蛋白质特异性抗体的基础上，可以进一步设计出急性髓系白血病基因治疗的靶位点，研制出包含该基因的基因诊断试剂盒、基因芯片、蛋白芯片，并推广该基因所表达的蛋白质特异性抗体在临床上的应用。
附图说明
[0134] 图1为本发明FAMLF基因的cDNA序列表图。
[0135] 图2为本发明FAMLF基因FAMLF的编码蛋白序列表图。
[0136] 图3为本发明EST zywB-87(GenBank注册号：CV973101)PCR检测电泳图。
[0137] 1 EST zywB-87 PCR检测结果 2 阴性对照
[0138] 可见在500-750bp之间有一清晰单一条带，阴性对照无条带
[0139] 图4为本发明的第一轮5′RACE PCR电泳图。
[0140] M DNAMarker 2000 1 第一轮5′RACE PCR 2 阴性对照
[0141] 图5为本发明的第二轮巢式5′RACE PCR电泳图。
[0142] M DNAMarker 2000 1第二轮巢式5′RACE PCR 2 阴性对照
[0143] 图6为本发明的3′RACE PCR电泳图。
[0144] M DNAMarker 6000 1 3′RACE PCR 2 阴性对照
[0145] 图7为本发明ORF分析网络界面图。
[0146] 图8为本发明NCBI/Blastn检索图。
[0147] 图9为本发明FAMLF新基因电子染色体定位图。
[0148] 图10为本发明蛋白质疏水性轮廓图。
[0149] 图11为本发明的蛋白质功能结构域分析结果一图。
[0150] 图12为本发明的蛋白质功能结构域分析结果二图。
[0151] 图13为本发明的FAMLF基因在部分急性髓系白血病病人及正常人之间的表达电泳图。
[0152] 1 DNA maker(DL2000) 2 家系中急性髓系白血病患者 3-5 家系外急性髓系白血病病人 6-7 家系中正常对照 8-9 家系外正常对照
[0153] 内参片断为251bp，目的片断为175bp，结果显示FAMLF基因在患者中的表达明显高于正常人
[0154] 图14为本发明的FAMLF在U937、Raj及Ca46细胞株的表达电泳图。
[0155] M DNAMarker DL 2000 1 U937细胞株 2 Raj细胞株 3 Ca46细胞株4 Shi-1细胞株
[0156] 内参片断为251bp 目的片断为522bp 结果显示FAMLF在上述细胞株中均有较高表达
[0157] 图15为本发明的FAMLF在急性单核细胞白血病、黑色素瘤、肝癌、Hela细胞株的表达电泳图。
[0158] M DNAMarker DL 2000 1阳性对照(患者OneStep RT-PCR扩增结果)
[0159] 2 急性单核细胞白血病细胞株 3 黑色素瘤细胞株 4 肝癌细胞株
[0160] 5 Hela细胞株 内参片断为251bp 目的片断为522bp
[0161] 结果显示FAMLF在急性单核细胞白血病细胞株中表达，在黑色素、肝癌细胞株中不表达
[0162] 图16为本发明的Western Bloting验证所制备的针对FAMLF的单克隆抗体图。
[0163] 1是33-1-3R3(PA)这个抗体，稀释250倍 2 是33-1-3R3×(PA)这个抗体，稀释比为50 其中GAPDH抗体和Actin抗体作为阳性对照
[0164] 图17为Western Bloting分析FAMLF在白血病NB4、U937、K562、骨髓瘤细胞系U266、CEM、白血病H160细胞、淋巴瘤细胞株CA46、Jurkat细胞株中的表达图。
[0165] 图18为Western Bloting分析FAMLF在白血病病人中的表达图(5为阳性对照，1、2、3、4、6为临床白血病病人)
[0166] 图19为本发明的Western Bloting分析FAMLF在正常人中的表达图。(1为阳性对照，2、3、4、5、6为正常人)
[0167] 图20为本发明的福建省急性髓系白血病高发家系系谱图。
具体实施方式
[0168] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述：
[0169] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如sanlbrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0170] 实施例1：通过sMART-RACE技术克隆出FAMLF基因全长序列
[0171] 1)EST zywB-87(GenBank注册号：CV973101)序列校对
[0172] 1.1)将EST zywB-87与基因组比对
[0173] 联 网http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat ？command ＝start 将 EST zywB-87与人类基因组序列进行比对，得到如下结果：
[0174] Alignment of YourSeq and chr1：197136247-197173157
[0175] Click on links in the frame to the left to navigate through the alignment.Matching bases in cDNA and genomic sequences are colored blue and capitalized.Light blue bases mark the boundaries of gap s in either sequence(often splice sites).
[0176] cDNA YourSeq
[0177] acgcggggAC AGGAGCAAGG GATGTCTGAG CACAAGTGGC TGAGTTCCGA 50
[0178] GTGACTTTAT GAAGCACTTT CTACCTTCCT CTCCGGCATG AAAACAGGGA 100
[0179] TTCTGCACCT GCATCATGGA CAGTCTGGCA AAAGCCTCTG CTCTGCCTCC 150
[0180] GGGGACAAGA AACTAGAGCA AATAACCGcT TTGAAATTAG ATCCTGGCgA 200
[0181] AATTACCcAC AATCAATGgt ggaaactgaa aggagaaTGA TTTAAATCTT 250
[0182] CAATGACAGT TGT
[0183] 目的序列位于1号染色体197136247-197173157区段，其中大写字母序列代表与基因组正确匹配，小写字母序列代表与基因组错配
[0184] 1.2)根据基因组比对结果采用引物设计软件Oligo 6.0设计校对上游引物F39，校对下游引物R591：
[0185] 上游引物F39：5’AGTGGCACCAAGATGCTTA 3’，
[0186] 下游引物R591：5’CCCTATGGATTGTTGAACTGG 3’，
[0187] 1.3)用TaKaRa公司的PrimeSTARTMHS DNA Polymerase试剂，具体操作按照该公司的protocol进行EST zywB-87的PCR检测，并取5mlPCR产物，2％琼脂糖电泳，观察结果(结果见图3的zywB-87基因的电泳图)，可见在500-750bp之间有一清晰单一条带，阴性对照无条带，其余45ul送Invitrogen公司直接测序。
[0188] 1.4)EST zywB-87 PCR产物直接测序结果
[0189] PCR产物经Invitrogen公司直接测序，测序结果如下：
[0190] 1 CGAAGCGTCT CATGGAAGCC AGTCTCCTCT AATGTGTATT
[0191] TTGGTGCCCT GTCTGCTGGT
[0192] 61 TCGCCTAAGT GATGTGGCAT ACATTTGATG AAAGGACAGT
[0193] AAATGACATC AATTATAAAA
[0194] 121 GACATCTACT AATGAGAGGA AGAAGAGGAA GAGAGAGAAA
[0195] TTGAAAAAAAGAATAAGAAA
[0196] 181 TTCTCTGAAA TGGAAACAGC AAAGCACTTT GATTGAACTA
[0197] AAAGAAATGA CGTACCTTAA
[0198] 241 TCATGCCCTA ATTTTAGGGT ACCACCAACC AAGCTACTCA CTCTTCTTTG[0199] GAAAGATGAC
[0200] 301 GTGTTTCTTC AACTTCTGTA CAACTGTCAT TGAAGATTTA AATCAATCTC[0201] CCTTCAGTTT
[0202] 361 CCATCATTGA TTGTTGGTAA TTTTGCCAGG ATCTCTGTAC AAAACAAAAC[0203] AAAAAGATAT
[0204] 421 TATGTGAAAC TCAGGCCATG CTGAGCAAAT TAGCTGAAAT TTATTTTTAT
[0205] CCTCTTATGG
[0206] 481 GGATGTTTTC CAGTTCAACA ATCCATAGGGA
[0207] 1.5)序列EST zywB-87校正结果
[0208] 将以上测序结果与基因组序列及EST zywB-87原始序列对比，发现EST zywB-87原始序列测序有部分错误，正确的序列如下：
[0209] 1 ACAGGAGCAA GGGATGTCTG AGCACAAGTG GCTGAGTTCC
[0210] GAGTGACTTT ATGAAGCACT
[0211] 61 TTCTACCTTC CTCTCCGGCA TGAAAACAGG GATTCTGCAC CTGCATCATG[0212] GACAGTCTGG
[0213] 121 CAAAAGCCTC TGCTCTGCCT CCGGGGACAA GAAACTAGAG
[0214] CAAATAACCG TTTTGAAATT
[0215] 181 AGATCCTGGC AAAATTACCA ACAATCAATG ATGGAAACTG
[0216] AAGGGAGATT GATTTAAATC
[0217] 241 TTCAATGACA GTTGT
[0218] 2)利用Clontech的5′端RACE试剂盒作FAMLF基因的5′端RACE，并使用引物设计软件Oligo 6.0根据校正好的EST zywB-87序列设计5’RACE引物。
[0219] 2.1)5′RACE引物
[0220] GSP1：5’AATCAATCTCCCTTCAGTTTCCATC 3’
[0221] NGSP1：5’TCTCCCTTCAGTTTCCATCA 3’
[0222] 2.2)5′RACE PCR电泳结果见图4、图5
[0223] 2.3)巢式5′RACE PCR产物直接测序结果
[0224] 巢式5′RACE PCR产物经Invitrogen公司直接测序，测序结果如下：
[0225] 1 TTTCAAACGG TTATTTGCTC TAGTTTCTTG TCCCCGGAGG
[0226] CAGAGCAGAG GCTTTTGCCA
[0227] 181 AGCTGTACTA TCTGCAGTTC TCCCCGCGTA CTCTGCGTTG ATACCACTGC
[0228] TTGCCCTATA
[0229] 241 GTGAGTCGTA TTAGA
[0230] 3)利用Clontech的3′端RACE试剂盒作FAMLF基因的3′端RACE，并使用引物设计软件Oligo 6.0根据校正好的EST zywB-87序列设计3’RACE引物。
[0231] 3.1)3′RACE引物
[0232] GSP2：5’AAGCACTTTCTACCTTCCTCTC 3’
[0233] 3.2)3′RACE PCR电泳结果见图6
[0234] 3.3)3′RACE PCR产物直接测序结果
[0235] 3′RACE PCR产物较长，一个反应不能测通，经过4次连续Warlking测序，得到其全长序列如下：
[0236] 1 ATGCATCATG GAAGTCTGGT AAAAGCCTCT GCTCTGCCTC
[0237] CGGGGACAAG AAACTAGAGC
[0238] 61 AAATAACCGT TTTGAAATTA GATCCTGGCA AAATTACCAA CAATCAATGA
[0239] TGGAAACTGA
[0240] 601 TAACCAAACA ACATACCTAT GAAAATAGAT CAGTAAGGCT
[0241] TTGAGAAACATTCTTAAGTA
[0242] 661 AAATCTGTAA AGCATCTTTG CATTTTTTTT CAAGAAAGAC CTCCAGGTAA[0243] ATGATGGCTT
[0244] 2041 GTTCTGTAGT TTTAACCAGA ACAAAGGGAT TACCCAGAAG
[0245] AAAAGAAGGT AAGCTATTTC
[0246] 2101 ATCAGTTTTG GTGGAAATCA GAAGTTTTTT TTTCTATTAT TAGCTTTGTA[0247] TTCTTAAAAA
[0248] 2161 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA
[0249] 4)cDNA全长序列拼接结果
[0250] 根据校正的EST序列，5’-RACE序列，3′-RACE序列，采用DNAMAN软件进行cDNA全长序列拼接，拼接的cDNA序列全长如下：
[0251] 1 AGAACTGCAG ATAGTACAGC TTCCACAGGA GCAAGGGATG
[0252] TCTGAGCACA AGTGGCTGAG
[0253] 61 TTCCGAGTGA CTTTATGAAG CACTTTCTAC CTTCCTCTCC
[0254] GGCATGAAAA CAGGGATTCT
[0255] 121 GCACCTGCAT CATGGACAGT CTGGCAAAAG CCTCTGCTCT
[0256] GCCTCCGGGG ACAAGAAACT
[0257] 1201 GGGAAGAAGA CACTTCTGCG TCTGACAGTG AATCAGGCTC
[0258] CCAGTTTTGA AGATGTGCTG
[0259] 1261 TAGGTAGTTC TCGCTGAATC CATTTCCCAG TTGGTTTCTA TTCCCCGCCC
[0260] CATTCCTGTG
[0261] 2161 TCACAGTTCT GTAGTTTTAA CCAGAACAAA GGGATTACCC
[0262] AGAAGAAAAG AAGGTAAGCT
[0263] 2221 ATTTCATCAG TTTTGGTGGA AATCAGAAGT TTTTTTTTCT ATTATTAGCT
[0264] TTGTATTCTT
[0265] 2281 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
[0266] 5)FAMLF新基因注册结果
[0267] 新基因经过申请，通过美国国家生物信息学中心GenBank的工作人员审核，获得核酸注册号：EF413001，蛋白质注册号：ABN58747，被正式命名为Homo sapiens familial acute myelogenous leukemia related factor(简称FAMLF)。
[0268] 实施例2：FAMLF的生物信息学分析和功能预测
[0269] 1)全长cDNA分析结果
[0270] 应用NCBI/ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析其ORF编码框，结果见图7。FAMLF的cDNA的序列如下：
[0271] 1 AGAACTGCAG ATAGTACAGC TTCCACAGGA GCAAGGGATG TCTGAGCACA
[0272] AGTGGCTGAG 60
[0273] 61 TTCCGAGTGA CTTTATGAAG CACTTTCTAC CTTCCTCTCC GGCATGAAAA CAGGGATTCT
[0274] 120
[0275] 121 GCACCTGCAT CATGGACAGT CTGGCAAAAG CCTCTGCTCT GCCTCCGGGG[0276] ACAAGAAACT 180
[0277] 181 AGAGCAAATA ACCGTTTTGA AATTAGATCC TGGCAAAATT ACCAACAATC AATGATGGAA
[0278] 240
[0279] 241 ACTGAAGGGA GATTGATTTA AATCTTCAAT GACAGTTGTA CAGAAGTTGA AGAAACACGT 300
[0280] 301 CATCTTTCCA AAGAAGAGTG AGTAGCTTGG TTGGTGGTAC CCTAAAATTA GGGCATGATT
[0281] 360
[0282] 361 AAGGTACGTC ATTTCTTTTA GTTCAATCGA AGTGCTTTGC TGTTTCCATT TCAGAGAATT
[0283] 420
[0284] 421 TCTTATTCTT TTTTTCAATT TCTCTCTCTT CCTCTTCTTC CTCTCATTAG TAGATGTCTT
[0285] 480
[0286] 481 TTATAATTGA TGTCATTTAC TGTCCTTTCA TCAAATGTAT GCCACATCAC TTAGGCGAAC
[0287] 540
[0288] 541 CAGCAGACAG GGCACCAAAA TACACATTAG AGGAGACTGG CTTCCATGAG[0289] ACGCTTCGAC 600
[0290] 601 TGTCTCATCG GGGCACTTGT AATAAGCATC TTGGTGCCAC TGAATGCAAT GCTGTATTCA
[0291] 660
[0292] 661 AATAATAGCT TTCATCTTCA CTCTTTTTAA ATATAAAAGT AAACCTTGAA GCCCTTTGAA
[0293] 720
[0294] 721 GGACCTAACC AAACAACATA CCTATGAAAA TAGATCAGTA AGGCTTTGAG AAACATTCTT
[0295] 780
[0296] 781 AAGTAAAATC TGTAAAGCAT CTTTGCATTT TTTTTCAAGA AAGACCTCCA GGTAAATGAT
[0297] 840
[0298] 841 GGCTTTTAAT AAGACACATG ACAATCTCAA TTACAAGAAT CATTAGTGTG TGTCCTGTGC
[0299] 900
[0300] 901 GCCATTTTAT GTTCCCAGCA GGATATATCT TTTCTCGTCT AGGGTTTCCA GGGCTGTCTA
[0301] 960
[0302] 961 CTGTTCTCTA TGTGTAAAAC GTATTTAAGT GTTCCCCCAA TGCTGCACTA ATGTTGAAAC
[0303] 1020
[0304] 1021 AAAACAAAAC AAAAACGAAG AAACCTTTGT CAAGTGGTCA GACAGACTGG[0305] AACTAGAGGA 1080
[0306] 1081 TTATAGGTAA GAGAGATAAA ATGAAGGGTT GAAAGCTATA ATTTCTATTT ATGTGGTGGC
[0307] 1140
[0308] 1141 AACCAAATCA GCTGTTGGAG TCAGGCAATT TAAAGATGTG GCTACTGGAG CTCAGAGTCT
[0309] 1200
[0310] 1201 GGGAAGAAGA CACTTCTGCG TCTGACAGTG AATCAGGCTC CCAGTTTTGA AGATGTGCTG
[0311] 1260
[0312] 1261 TAGGTAGTTC TCGCTGAATC CATTTCCCAG TTGGTTTCTA TTCCCCGCCC CATTCCTGTG
[0313] 1260
[0314] 1321 TCCCCACACT TTCCACTTGA TTTTACCTCT TTGACAATTC TATATTTTAC TTTCCTTCCT
[0315] 1320
[0316] 1381 CTCATTCCCC TTTTCCCACC CCCTTTTTTT ACTGTAGTTC TTGGCCTCTG ACTACTGTTC
[0317] 1380
[0318] 1441 CATGCTGGAT GTCCCCAGAA AATAGAGTAT GTTTAGAAAG GAGACAGTGC ATCTCAGAAG
[0319] 1440
[0320] 1501 GGCCTCCCCA GTCCACTAGT CCATTTTTTA ATGTGTTGTG CTCTATGGGT GTCAGGAATA
[0321] 1560
[0322] 1561 TTTGTAGATG AAGTAATTTG TGGCATGAAT TTTGATAGAA GCAGGATCAC CAACAAAATG
[0323] 1620
[0324] 1621 ATAAATGTAG GTACCTGTCT ACCTTGCATA ATATTCACTA TGATCTTGAG AATTTCAATG
[0325] 1680
[0326] 1681 TATAATTTGT CTTTATTCTT ATTTTTCATT AGAATTAACA GAATCTCAGA GCTGGTAGAA
[0327] 1740
[0328] 1741 AGTATAGAAA CTGTATATAC AACTCTCATA TTCAGATGAA GAAAATGATG CACAAAAAAT
[0329] 1800
[0330] 1801 CAACTGTCCT AAGCCATTTA GCTTGTCTAT AAGTGCTGTT GGCTTAATTA TAGTTTTGCA
[0331] 1860
[0332] 1861 TATATTTAGG CAAAGAAAAT ACTTTCTCAG AAACTGGTTA GGACTGTTTG AGAAGAAATA
[0333] 1920
[0334] 1921 TAATCATCAA AATATATACA CAGTAAAATG TAACCGTCCA TCATTCAACA TAGGCAAGAA
[0335] 1980
[0336] 1981 TATATATTGA ATTGCCTGAG TGTATTATTC GTATAGCAAA ACTTACTTGA ATTTCTAATA
[0337] 2040
[0338] 2041 AATCTTCTGA CCTCTGTATA TGTATAAAAT ATATAAACCA ACCAAATTCT GTACATAAAT
[0339] 2100
[0340] 2101 ATATTTTTGG ATACCAGTAC AATCCCTATT TCACTTTTGT GTATTCCAGT TATTTATTAC
[0341] 2160
[0342] 2161 TCACAGTTCT GTAGTTTTAA CCAGAACAAA GGGATTACCC AGAAGAAAAG
[0343] AAGGTAAGCT 2220
[0344] 2221 ATTTCATCAG TTTTGGTGGA AATCAGAAGT TTTTTTTTCT ATTATTAGCT TTGTATTCTT[0345] 2280
[0346] 2281 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA
[0347] 2303
[0348] NCBI/ORF Finder程序发现该序列在+1相位有完整的ORF编码框，位于第1531-1779核苷酸之间，编码82个氨基酸的蛋白质，在开放阅读框架的第一个ATG上游有同框架的终止密码子TAG，编码框架的下游有终止密码子TGA，3′末端有polyA尾和AATAAA加尾信号，表明该cDNA为全长cDNA。
[0349] 2)序列相似性分析结果见图8
[0350] 3)新基因电子染色体定位结果见图9
[0351] 联网http://genome.ucsc.edu/进行基因定位，发现基因定位于染色体1q31.3。
[0352] 4)基因组结构确定
[0353] 联网http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？command＝start进行基因组结构确定，发现该基因含有2个外显子，1个内含子，第一个外显子为204bp，第二个外显子为2076bp，内含子为38964bp，内含子外显子交界位点符合GT-AG规则，启动子元件为起始子Inr，符合在-1和+1两个位点核苷酸序列为CA规则，转录起始点上游-75区含有CAAT盒。
[0354] 5)新基因编码蛋白性质功能预测
[0355] 5.1)编码蛋白质基本理化性质预测结果
[0356] 根据开放读码框得知该蛋白质的氨基酸残基序列为：
[0357] 1 MCCALWVSGI FVDEVICGMN FDRSRITNKM INVGTCLPCI
[0358] 41 IFTMILRISM YNLSLFLFFI RINRISELVE SIETVYTTLI FR 82
[0359] 应 用ProtParam 工 具(http://expasy.org/tools/protparam.html) 分 析 该蛋白分子质量为9554.5，等电点(pI)为7.60，分子式为C434H693N107O114S10，消光系数为-1 -18730M cm (280nm)，半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞)，不稳定系数是37.75，一般认为该蛋白是稳定的，疏水性指数是122.32，总平均亲水性0.888。
[0360] 5.2)蛋白质疏水性轮廓分析
[0361] 应用ProtScale工具(www.expasy.org/tools/protscale.html)进行蛋白质疏水性轮廓分析(结果见图10)
[0362] 5.3)蛋白质功能结构域分析结果
[0363] 联网http://smart.embl-heidelberg.de/，分析蛋白质可能的功能结构域(见图11、图12)：
[0364] 发现1-17氨基酸区域含有信号肽，29-51氨基酸区域可能为跨膜区，52-74氨基酸区域含有LRR_SD22功能结构域，75-82氨基酸区域为内在固有无序结构区，2-39氨基酸区域也可能为BowB结构域。
[0365] 6)FAMLF基因在患者与家族正常人之间、U-937、HL-60、CA-46、RAGJ、SHI-1、Hela、急性单核细胞白血病、黑色素瘤、肝癌细胞株的差异表达分析
[0366] 6.1)使用引物设计软件Oligo 6.0根据该基因的cDNA序列设计差异表达分析引物F17、R539：
[0367] 上游引物F17：5’AAGCACTTTCTACCTTCCTCTC 3’
[0368] 下游引物R539：5’TCTCCCTTCAGTTTCCATCA 3’
[0369] 6.2)以β2ACTIN为内参照进行OneStep RT-PCR反应，反应体系：
[0370]
[0371] 反应参数：
[0372] 50℃ 30min
[0373] 95℃ 15min
[0374] 循环35次 94℃ 30sec
[0375] 52℃ 30sec
[0376] 72℃ 30sec
[0377] 4℃下保持
[0378] 分别取5ul PCR产物，2％琼脂糖电泳，观察结果(见图13、图14、图15)，电泳图得出结论：图13表明内参片断为251bp，目的片断为175bp，结果显示FAMLF基因在患者中的表达明显高于正常人；图14表明内参片断为251bp，目的片断为522bp，结果显示FAMLF在上述细胞株U937细胞株、Raj细胞株、Ca46细胞株、Shi-1细胞株中均有较高表达；图15结果显示FAMLF基因在急性单核细胞白血病细胞株中表达，在黑色素、肝癌细胞株中不表达，FAMLF基因能作为恶性肿瘤检测的含有人类新基因FAMLF试剂盒；以及人类新基因FAMLF所编码的多肽和多核苷酸能在制备抗白血病细胞药物中的应用。
[0379] 实施例3：人基因FAMLF全长cDNA的克隆
[0380] 根据人基因FAMLF的序列，设计一对引物F82和R1974，用于扩增包括信号肤序列在内的FAMLF基因全长cDNA扩增条件：95℃变性15min；然后以94℃30s，58℃ 1min，72℃30s(全长2min)的程序循环35次；最后72℃延伸7min。PCR产物采用直接测序验证，并克隆到载体pMD18-T上。PCR及测序鉴定其正确性。DNA片段回收使用上海生工公司的胶回收试剂盒，质粒抽提使用上海生工公司的质粒抽提试剂盒，大肠杆菌转化采用热休克法。
具体步骤见《分子克隆》。DNA序列测定表明：PCR产物的DNA序列与序列表<210>1所示的
82-1974bp相同。(见图1所述)
具体步骤见《分子克隆》。DNA序列测定表明：PCR产物的DNA序列与序列表<210>1所示的
82-1974bp相同。(见图1所述)
[0381] 实施例4-1：人基因FAMLF特异性单克隆性抗体A的研制
[0382] 1)根据基因FAMLF的序列应用软件设计并合成免疫表位多肽[此多肽位于该基因编码的蛋白质的第2到第16个氨基酸残基(CALWVSGIFVDEVI-NH2)]20mg，经检测其纯度92％，达到本实验的要求。
[0383] 2)将该多肽连接上匙孔血蓝蛋白(KLH)与牛血清白蛋白(BSA)，两个标志分别用于后续抗体的免疫纯化与ELISA监测。
[0384] 3)将上述KLH、BSA连接多肽分别免疫两只纽西兰白兔。
[0385] 4)将上述标记多肽免疫纽西兰白兔，并通过ELISA监测抗血清的进展直到其滴度大于10,000时，把纽西兰白兔的血液全部放出来用于抗体A的提取。
[0386] 5)通过亲和提纯法提取血清中的抗体A，得到浓度为1.3mg/ml的抗体A 7ml。
[0387] 6)通过Western Bloting验证所提取的抗体A(结果见图16)，图16得出结论：1、33-1-3R3(PA)，针对该基因编码的蛋白质的第4到第16个氨基酸残基所对应的多肽片段-CALWVSGIFVDEVI-NH2)，这个抗体，稀释250倍；2、33-1-3R3×(PA)这个抗体，稀释比为
50，其中GAPDH抗体和Actin抗体作为阳性对照，Western Bloting的具体步骤见《分子克隆》，结果显示成功制备出针对FAMLF的抗体；3、首次证实FAMLF为编码约8kD蛋白质的人类新基因。
50，其中GAPDH抗体和Actin抗体作为阳性对照，Western Bloting的具体步骤见《分子克隆》，结果显示成功制备出针对FAMLF的抗体；3、首次证实FAMLF为编码约8kD蛋白质的人类新基因。
[0388] 实施例4-2：人基因FAMLF特异性单克隆性抗体B的研制
[0389] 1)根据基因FAMLF的序列应用软件设计并合成免疫表位多肽[此多肽位于该基因编码的蛋白质的第17到第29个氨基酸残基(CGMNFDRSRITNK-NH2)]20mg，经检测其纯度84％，达到本实验的要求。
[0390] 2)将该多肽连接上匙孔血蓝蛋白(KLH)与牛血清白蛋白(BSA)，两个标志分别用于后续抗体的免疫纯化与ELISA监测。
[0391] 3)将上述KLH、BSA连接多肽分别免疫两只纽西兰白兔。
[0392] 4)将上述标记多肽免疫纽西兰白兔，并通过ELISA监测抗血清的进展直到其滴度大于10,000时，把纽西兰白兔的血液全部放出来用于抗体B的提取。
[0393] 5)通过亲和提纯法提取血清中的抗体B，得到浓度为0.1mg/ml的抗体B 4ml。
[0394] 6)同样通过Western Bloting验证所提取的抗体B，结果显示成功制备出针对FAMLF的抗体B。
[0395] 实施例4-3：人基因FAMLF特异性单克隆性抗体C的研制
[0396] 1)根据基因FAMLF的序列应用软件设计并合成免疫表位多肽[此多肽位于该基因编码的蛋白质的第61到第77个氨基酸残基(C-RINRISELVESIETVYT-NH2)]20mg，经检测其纯度算83％，达到本实验的要求。
[0397] 2)将该多肽连接上匙孔血蓝蛋白(KLH)与牛血清白蛋白(BSA)，两个标志分别用于后续抗体的免疫纯化与ELISA监测。
[0398] 3)将上述KLH、BSA连接多肽分别免疫两只纽西兰白兔。
[0399] 4)将上述标记多肽免疫纽西兰白兔，并通过ELISA监测抗血清的进展直到其滴度大于10,000时，把纽西兰白兔的血液全部放出来用于抗体C的提取。
[0400] 5)通过亲和提纯法提取血清中的抗体C，得到浓度为1.7mg/ml的抗体C 7ml。
[0401] 6)同样通过Western Bloting验证所提取的抗体C，结果显示成功制备出针对FAMLF的抗体C。
[0402] 实施例5：人基因FAMLF特异性单克隆性抗体的应用
[0403] 通过Western Blot在蛋白质水平对人FAMLF基因的在细胞株、临床白血病患者和正常人中的表达进行定量分析(结果见图17、图18、图19)，得出结论：1、抗体A，针对该基因编码的蛋白质的第2到第16个氨基酸残基所对应的多肽片段(CALWVSGIFVDEVI-NH2)，这个抗体用于通过Western Bloting检测新基因所表达的蛋白质FAMLF；2、通过WesternBloting技术发现结果显示FAMLF新基因编码的蛋白质在诸多与白血病相关的细胞株中高表达，在部分临床白血病患者中高表达，在正常人中不表达，FAMLF是与人类白血病相关的新基因；本发明通过通用技术制备了FAMLF基因作为恶性肿瘤检测的含有人类新基因FAMLF的试剂盒，试剂盒采用通用方法检测，结果表明在含有U937细胞株、Raj细胞株、Ca46细胞株、Shi-1细胞株中均有较高表达，在白血病NB4、U937、K562、骨髓瘤细胞系U266、白血病H160细胞、淋巴瘤细胞株CA46中有较高表达，能检测到含有急性单核细胞的白血病细胞株和CA46。人类新基因所编码的多肽和多核苷酸能在制备抗白血病细胞药物中的应用。
[0404] 通过大量试验，获得如图20所示的福建省急性髓系白血病高发家系系谱图。