干细胞体外定向诱导软骨支架材料及其制备方法

摘要

本发明涉及干细胞体外定向诱导软骨支架材料及其制备方法。本发明的技术方案要点是：干细胞体外定向诱导软骨支架材料，包括海绵状胶原支架和PLGA微球，PLGA微球内包载有TGF-β1，上述PLGA微球置于纤维蛋白中。本发明提供了一种胶原支架材料与细胞因子复合均一、内部释放一致和机械性能优越以及良好的生物相容性、可降解性和无免疫性的干细胞体外定向诱导软骨支架材料的制备方法。本发明所提供的胶原/纤维蛋白/PLGA微球复合支架材料与现有材料比较具有机械性能好、生物相容性、可降解性及无免疫原性优越的显著优点。

权利要求

1.一种制备干细胞体外定向诱导软骨的支架材料的方法，其特征在于有以下步骤：

（1）用体积浓度为0.3％丙二酸溶液将胶原分散液稀释至体积浓度为0.6％，在低温离心机中4℃，1500rpm离心15分钟，以除去分散液中的气泡；胶原分散液搅拌均匀，置于平整的不锈钢模具中；在-80℃超低温冰箱预冻后进行冷冻干燥，得到胶原海绵支架；

（2）将步骤（1）制得的胶原海绵支架在体积浓度为0.3％的戊二醛溶液中浸泡，戊二醛交联液的pH值控制为8.4，交联反应时间2h，使胶原支架交联，将交联后的胶原海绵支架，放入去离子水中清洗，充分去除支架中残留的戊二醛，然后-80℃超低温冰箱预冻，重新放入冷冻干燥机中进行第二次冷冻干燥，得到胶原海绵支架；制备的胶原支架厚度控制在

0.4±0.05cm，孔径平均为56.5±14.6µm；

（3）用液中干燥法制备载TGF-β1的PLGA微球，将TGF-β1溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入到PLGA的二氯甲烷溶液中乳匀分散后，再将PLGA的溶液加入1％的聚乙烯醇水溶液中，持续搅拌待二氯甲烷挥发后，离心收集微球，并冷冻干燥得到微球；液中干燥法中的外水相为1.0%的聚乙烯醇水溶液，内水相为pH7.2的磷酸盐缓冲溶液；离心条件为10分钟，转速8000rpm；载TGF-β1的PLGA微球光滑圆整，粒径为22.4±6.2µm，包封率为（86.21±2.31）%，载药量为（7.65±0.84）%；

（4）将步骤（3）制备的包载TGF-β1的PLGA微球加入纤维蛋白原中，与凝血酶混合后迅速加入到胶原海绵支架内，得到干细胞体外定向诱导软骨支架材料，其中微球：纤维蛋白胶质量比=1:8~1:20，纤维蛋白胶：胶原海绵支架质量比=1:1~1:3。

说明书

干细胞体外定向诱导软骨支架材料及其制备方法

[0001] 技术领域：

[0002] 本发明属于生物医学材料领域，涉及一种作为间充质干细胞体外定向诱导软骨的支架材料及其制备方法。

[0003] 背景技术：

[0004] 软骨是一种无血管组织，一旦损伤极难修复至正常，其中自体软骨细胞移植修复关节软骨部分缺损已被FDA批准用于临床，但是自体来源的软骨组织有限；组织工程软骨产品已进入临床前或临床验证阶段，软骨组织工程的基本方法是将自体或异体组织细胞经体外培养扩增后接种到一种组织相容性好可降解吸收的生物材料上，将组织-生物材料复合体植入体内组织缺损部位，生物材料逐渐被降解吸收，而组织形成新的有功能的软骨组织，从而达到修复软骨缺损的目的，因此支架材料在组织工程研究中起中心作用，它不仅为特定的细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。现有的软骨组织工程支架尚有以下缺陷：（1）构建的软骨复合组织仅仅具有形态学和生物化学成分方面的证据，其生物学功能，尤其是力学性能不能实现在体内较长时间存在而不发生变性等；（2）支架内部细胞因子等营养成分分布及释放不均一，且内部细胞因子的释放与软骨的形成不一致；（3）体内软骨组织的生长不一致，均一输送及长时间保持仍然不理想，严重制约在临床上的广泛应用。因此，寻找一种既具有良好生物相容性和生物降解性又具有特定形状和连通三维多孔结构的支架材料是组织工程的一个重要方面。胶原蛋白的生物学性质与功能具有低抗原性、生物可降解性(易被人体吸收)、细胞适应性和促细胞增殖作用，使得胶原蛋白成为最有用的生物材料之一，在生物医学领域如组织工程支架材料具有广泛用途。通过交联或复合其他物质可以提高胶原支架（Collagen scaffold，CoS）的酶稳定性，改善胶原的力学性能可以达到改善上述缺点的作用（Chen, HL，et al. Artificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology [J]. 2008，36(4): 372-385），并给细胞提供三维生长空间，为软骨的形成提供所需的三维空间，作为软骨组织工程支架保证生成的软骨具有合适的强度、硬度和弹性。在支架材料中复合一定量的细胞因子，为细胞的生长、分化和增殖提供养分。用纤维蛋白胶修饰制备好的胶原支架材料，可在一定程度上改善原有缺点。复合材料作为间充质干细胞（Mesenchymal stem cells， MSCs）体外定向诱导软骨细胞的支架，对细胞外基质与可降解吸收生物材料经体外培养，在体内预制呈类似软骨结构，以期达到更好的细胞增殖、融合和诱导分化的作用。纤维蛋白胶(Fibrin glue, FG)是一种生物蛋白制品，主要成分是纤维蛋白原和凝血酶,各成分混合后模拟体内凝血的最后阶段, 纤维蛋白原与凝血酶接触后,先转变为纤维蛋白单体, 后者再聚合成可溶性纤维蛋白多聚体,最终形成具有一定三维网状结构的纤维蛋白。纤维蛋白具有良好的组织和细胞相容性、生物可降解性、可塑性强等多种生物学特性。近年来纤维蛋白胶作为组织工程支架材料在体外重建软骨组织、皮肤、心肌组织等多领域获得成功并用于移植（Liang M.S.，et al. Biomaterials 32 (2011) 8684-8693; Jason W. Bjork et al. Biomaterials 32 (2011) 2479-2488），但是单纯纤维蛋白支架（Fibrin scaffold，FiS）的生物力学性质较差，本发明结合上述两种生物材料的特点，可改善单纯一种材料的局限性：胶原纤维只在酸性环境中溶解，在中性环境中由于胶原未能溶解分散，很难使水溶性的蛋白及细胞因子等营养成分分散均匀，因而不能保证营养物质持续均匀地释放发挥作用；而胶原蛋白溶解的酸性环境易导致蛋白及细胞因子的失活。

[0005] MSCs来源于早期中胚层，具有跨胚层向多组织细胞分化的潜能，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经细胞，且具有免疫调节性。MSCs不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性低，是一类免疫缺陷细胞，不需经过严格配对使用，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，且易于转染外源基因，是细胞治疗和组织再生的理想细胞。体外成功诱导骨髓MSCs向软骨转化的发生需要特定的细胞因子参与和高密度的细胞浓度(Philippe Tropel et al., Experimental Cell Research, 2004:295(2):395-406)。生长因子对细胞的作用不是单一的过程，是一种网络式的调节，生长因子对细胞作用的量效关系、时效关系、细胞因子之间的相互作用及反馈调节等至关重要。合理有效的利用细胞生长因子-转化生长因子-β1 (Transforming growth factor beta1, TGF-β1)在体外促进MSCs的增殖、分化，表达软骨细胞表型，在软骨组织工程中有着不可替代的作用，是整个过程的关键所在。单纯复合细胞因子，细胞因子易受到外界环境因素的影响而变性失活，且不能够持续作用。

[0006] 克服现有支架材料内部细胞因子及其营养成分活性低及分布不均一的缺点，以MSCs作为种子细胞克服自体组织来源限制的缺陷，满足由于运动损伤，肿瘤等疾病造成的软骨组织缺损的要求是研究的重点。

[0007] 发明内容：

[0008] 本发明的目的是提供一种胶原支架材料与细胞因子复合均一、内部释放一致和机械性能优越以及良好的生物相容性、可降解性和无免疫性的干细胞体外定向诱导软骨支架材料及制备方法。

[0009] 本发明的技术方案是：干细胞体外定向诱导软骨支架材料，包括海绵状胶原支架和PLGA微球，其特征在于：所述PLGA微球内包载有TGF-β1，上述PLGA微球置于纤维蛋白中。

[0010] 一种制备所述的干细胞体外定向诱导软骨的支架材料的方法，其特征在于有以下步骤：（1）用体积浓度为0.3％丙二酸溶液将胶原分散液稀释至体积浓度为0.6％；搅拌均匀，置于平整的不锈钢模具中，在-80℃超低温冰箱预冻后进行冷冻干燥，得到胶原海绵支架，将冻干的胶原海绵支架在体积浓度为0.3％的戊二醛溶液中浸泡，使胶原支架交联，将交联后的胶原海绵支架，放入去离子水中清洗，充分去除支架中残留的戊二醛，然后-80℃超低温冰箱预冻，重新放入冷冻干燥机中进行第二次冷冻干燥，得到胶原海绵支架；（2）用液中干燥法的微球制备工艺，将TGF-β1溶于磷酸盐缓冲液溶液中，加入到PLGA的二氯甲烷溶液中乳匀分散后，再迅速加入体积浓度为1%的PVA水溶液中，持续搅拌待二氯甲烷挥发后，离心收集微球，并冷冻干燥得到微球；（3）将制备的包载TGF-β1的PLGA微球加入纤维蛋白原中，与凝血酶混合后迅速加入到胶原海绵支架内，得到干细胞体外定向诱导软骨支架材料。

[0011] 本发明所提供的胶原/纤维蛋白/PLGA微球复合支架材料与现有材料比较具有机械性能好、生物相容性、可降解性及无免疫原性优越的显著优点。将包载TGF-β1的微球与纤维蛋白原混合均匀后，再加入到胶原支架中，实现了营养物质TGF-β1在支架中的均匀分布，支架各部分TGF-β1浓度一致，且TGF-β1缓慢释放，调整微球的量可达到调整支架内部TGF-β1含量的作用，而且释放的TGF-β1结构未见显著改变，活性得到保护，保障了支架内部持续均一且有活性营养成分的作用。制备的支架材料孔径分布均匀，且支架内部孔径相互贯通，支架材料具有有一定的机械强度、柔韧性，生物相容性好，且支架的降解性与人体软骨生长相适应，符合人体内植入需求；该支架材料能引导、促进MSCs细胞的粘附和生长，并且各种原料廉价易得，制备工艺简单，制备条件可控，是一种较好的MSCs体外定向诱导软骨的复合支架材料。

[0012] 附图说明：

[0013] 图1为微球的扫描电镜图。

[0014] 图2为载PLGA微球的纤维蛋白胶扫描电镜图。

[0015] 图3为胶原支架扫描电镜图。

[0016] 图4为胶原/纤维蛋白/PLGA微球复合材料支架扫描电镜图

[0017] 图5为复合支架材料的机械性能测定结果图。

[0018] 图6为复合支架材料的体外降解图。

[0019] 具体实施方式：

[0020] 实施例：胶原支架的制备

[0021] 称取胶原分散液，并用0.3％（v/v）丙二酸溶液稀释至胶原终浓度为0.6％（v/v），搅拌均匀，在低温离心机中4℃，1500rpm离心15分钟，以除去分散液中的气泡，然后置于平整的不锈钢模具中，在-80℃超低温冰箱预冻后进行冷冻干燥4小时，得到胶原海绵支架；将冻干的胶原海绵支架在pH=8.4的0.3％（v/v）戊二醛溶液中浸泡2小时，使胶原支架交联，将交联后的胶原支架，放入去离子水中清洗10次，充分去除支架中残留戊二醛；然后-80℃超低温冰箱预冻，重新放入冷冻干燥机中进行第二次冷冻干燥，得到胶原支架，制备的胶原膜厚度控制在（0.4±0.05）cm。

[0022] 胶原/纤维蛋白/PLGA微球的复合支架材料的制备

[0023] 液中干燥法制备载TGF-β1的PLGA微球，液中干燥法中的外水相为1% （w/w）的聚乙烯醇（PVA）水溶液，内水相为pH7.2的PBS溶液，制备的微球粒径为（22.4±6.2）µm；将微球与纤维蛋白原在磁力搅拌作用下混合均匀，其中微球：纤维蛋白胶质量比为1:8~1:20；在上述混合液中加入凝血酶，立即加入制备好的胶原支架中，其中纤维蛋白胶：胶原质量比为1:1~1:3，得到胶原/纤维蛋白/PLGA微球复合支架材料。将上述制备的支架材料剪成直
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径为14mm的圆形，分别装入聚乙烯薄膜小袋中，封口后γ射线辐射灭菌（ Co，2×10rad），所述乳匀速率为20000rpm，所述离心条件为10分钟，转速8000rpm，所述的TGF-β1微球光滑圆整，粒径为（22.4±6.2）µm，包封率为（86.21±2.31）%，载药量为（7.65±0.84）%。

[0024] 支架材料的形貌观察

[0025] 制备的支架材料置入液氮冷冻定型后，取出切成小试片，取其表面和截面置于金属片上，真空喷金处理后，扫描电镜观察支架材料表面形态和截面形貌，测量计算胶原支架平均孔径（56.5±14.6）µm。

[0026] 支架的机械性能检测

[0027] 取每种支架材料样品各五个，剪成条状，计算其表面积，用电子拉力试验机进行拉伸强度的测试（夹具间距为20mm，拉伸速度为100mm/min。检测其断裂强度及断裂伸长率。断裂强度＝断裂拉力/截面积；断裂伸长率＝（断裂长度-拉伸前长度）/拉伸前长度。

[0028] 支架的降解性能检测

[0029] 胶原酶溶液的配制:称取胶原酶(228U/mg)，加入PBS（pH6.8）缓冲液中溶解,使其浓度为10U/ml，加入CaCl2，使其浓度为0.005M,加入少量NaNO3(0.02％)。

[0030] 胶原药膜在保干器中充分干燥至恒重后精确称重为W0，加入8ml（10U/mg）胶原酶溶液，置于（37 ±1）°C，（75±1）rpm空气浴振荡器中计时反应。每样做三个平行实验。反应8小时，16小时，24小时，32小时，各取出一片，加入1mlEDTA溶液(0.2M)终止反应。
用三蒸水漂洗3次后，每次10分钟。冷冻干燥后称重W1，按照以下公式计算降解百分率：

[0031] D%=(W0-W1)/W0×100%