一种用于小麦条锈病抗病新基因Yr50辅助选择的分子标记及其用法

摘要

本发明公开了一种用于小麦条锈病抗病新基因Yr50辅助选择的分子标记及其用法，属于植物分子遗传学和小麦种质创新技术领域，涉及抗小麦条锈病新基因的分子标记开发及其定位方法。用于小麦条锈病抗病新基因Yr50辅助选择的分子标记为标记Xbarc1096、标记Xwmc310，标记Xbarc1096与小麦条锈病抗性基因Yr50的遗传距离为6.9cM，标记Xwmc310与Yr50的遗传距离为7.2cM。本发明在国际上首次发现源于偃麦草的抗小麦条锈病新基因Yr50，并获与其连锁的分子标记，利用本发明的条锈病分子标记辅助育种选择目标明确，可节约成本，不仅为小麦抗条锈病育种提供了新抗源，而且进一步图位克隆该基因奠定了材料和技术基础。

权利要求

1.一种用于小麦条锈病抗病基因Yr50 辅助选择的分子标记的用法，其特征在于：扩增该分子标记的引物具有如下所示的核苷酸序列：标记Xbarc1096:

上游：5'-GCGTTCGCATATACGTCGTATACAT-3'，下游：5'-GGTGGTGAAGAGGCATGCCCAACAAA-3'或标记Xwmc310:

上游：5'-TGTGAGGCTGGGAGGAAAAGAG-3'，下游：5'-GCTAGGTTGTGTCCCACAATGC-3'；

将所述的分子标记用于SSR标记筛选时的反应程序为：(1) PCR反应体系为：20 μL，含10× buffer2 μL、2 mM dNTP、0.25 μM分子标记引物、1U TaqDNA聚合酶、100 ng基因组DNA, 去离子水补足至20 μL，其中10× buffer2 μL为10 mM Tris–HCl，pH 8.3，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2；

(2) 扩增程序为：94 ℃预变性5min；94 ℃变性45s，Xwmc310在51 ℃或Xbarc1096在

52 ℃复性45s，72 ℃延伸1min，35个循环；72 ℃延伸10min，4 ℃保存；

⑶ 电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将4 μL PCR产物和4 μL上样缓冲液混合点样，150V电泳2h，硝酸银染色拍照。

说明书

一种用于小麦条锈病抗病新基因Yr50 辅助选择的分子标

记及其用法

技术领域

[0001] 本发明属于植物分子遗传学和小麦种质创新技术领域，涉及抗小麦条锈病新基因的分子标记开发及其定位方法，具体涉及一种用于小麦条锈病抗病新基因Yr50 辅助选择的分子标记及其用法。

背景技术

[0002] 由条锈菌（P. striiformis f. sp. tritici）引起的小麦条锈病是一种世界性的小麦重要病害，而我国又是该病的流行区，其发病面积和成灾频率均居小麦病害之首。自20世纪50年代至今，我国曾发生15次中度流行和4次大流行。最近1次的大面积流行发生于2002年，由于条中31号（CYR31）和条中32号（CYR32）等新毒性小种的出现和流行，导致除Yr5、Yr10、Yr15、Yr24 和Yr26 外的大多数抗条锈基因丧失抗性。其发病面积在1亿亩以上，造成小麦减产131万吨（万安民，等. 2002年我国小麦条锈病发生回顾植物保护.2003，29：5-8）。最近几年，我国条锈病每年发生面积均在6000万亩左右（何中虎，等. 小麦条锈病和白粉病成株抗性研究进展与展望. 中国农业科学，2011，44(11)：2193-2215），严重威胁着我国小麦安全生产。

[0003] 对于小麦条锈病的防治，抗性基因的利用是最为经济、安全、有效的途径。自1962年在小麦中发现第一个抗条锈基因（Yr1）以来，已在43个位点（Yr1-Yr48）上正式定名了51个抗条锈基因和20多个暂命名基因，它们分布于除1A、4A、4B和7A的其他17个小麦染色体上（McIntosh等. Catalogue of Gene Symbols for Wheat，2008-2011）。然而，寄主抗性与病原菌毒性小种的共进化，导致小种专化性基因在生产利用不久便丧失抗性。在我国，因小麦-黑麦1RS/1BL易位系（含Yr9）和“繁6”衍生系等主要抗源的大面积使用导致新致病小种CYR31和CYR32的出现而爆发了1996、2002年的条锈病大流行就是明证。因此，抗病新基因的发掘与利用对有效防控小麦条锈病的流行和为害至关重要。

[0004] 抗源多样化是解决抗性丧失的重要途径。但目前仅有的几个对我国强优势生理小种条中31、32号表现高抗的抗性基因中，Yr5、Yr10来自斯卑尔脱小麦（T. spelta album），Yr15 源于野生二粒小麦（T.dicoccoides），Yr26 源于圆锥小麦。研究还发现，Yr5 位于2BL上（Sun 等. Plant Breeding, 2002, 121: 539-541），Yr10、Yr15和Yr26 位于小麦的1BS上（Wang 等. Euphytica, 2002, 124:71-73; Sun 等. Theoretical and Applied Genetics, 1997, 95: 622-628; Ma 等. Euphytica, 2001, 120: 219-226）。显然，仅靠这几个有限的抗病基因难以实现小麦条锈病抗源多样化。

[0005] 中间偃麦草（Thinopyrumintermedium，2n=6=42, JJsS）是小麦的一个多年生野生近缘植物，由于其蕴含着许多对改善小麦品质、增强小麦抗性的有益基因，已成为小麦遗传改良的重要基因资源之一。最近有研究发现中间偃麦草的1S染色体上含有免疫条中31、32号小种的新基因（Hu等. Euphytica, 2011, 177:169-177），但未见有关将偃麦草抗条锈基因整合到小麦基因组中并对其进行标记定位的研究报道。

[0006] 抗病基因的分子标记及连锁图谱建立是对目标基因进行精细遗传定位及图位克隆抗病基因的基础，同时更是分子标记辅助育种的有力工具，近年来，分子标记已广泛应用于小麦目标性状标记定位和性状间连锁关系的确定。但由于小麦的遗传基础相对狭窄，在常用的分子标记体系中，RFLP操作复杂、多态性较低，因而在一定程度上限制了小麦RFLP标记的筛选和应用。而微卫星（Microsatellite）或简单序列重复（SSR）以其数量丰富、多态性高、共显性遗传、操作简单、结果稳定可靠等优点而用于种质鉴定、目标基因的分子标记及定位。迄今，14个正式命名的抗条锈基因已获得连锁的SSR标记，包括免疫或高抗条中32号小种的Yr5、Yr10、Yr15、和Yr26（Sun等. Plant Breeding，2002，121：539-541；Wang等. Euphytica，2002，124：71-73；Sun等. Theoretical and Applied Genetics，1997，95：
622-628；Ma等. Euphytica，2001，120：219-226）。而且，有些紧密连锁的SSR标记已用于抗病基因的标记辅助选择（Murphy等.Crop Science，2009，49：1786-1790）及其图位克隆（Fu等. Science，2009，323：1357-1360）。因此，利用SSR分子标记定位Yr50 和开发与连锁的分子标记对于克隆和利用抗条锈基因Yr50 具有重要意义。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种用于小麦抗条锈病基因Yr50 连锁的分子标记及其用法。

[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0009] 本发明提供的辅助筛选用于小麦条锈病抗病基因Yr50 两个引物对，具有如下所示的核苷酸序列：

[0010] 标记Xbarc1096：

[0011] 上游：5'-GCGTTCGCATATACGTCGTATACAT-3'，

[0012] 下游：5'-GGTGGTGAAGAGGCATGCCCAACAAA-3'；

[0013] 标记Xwmc310：

[0014] 上游：5'-TGTGAGGCTGGGAGGAAAAGAG-3'，

[0015] 下游：5'-GCTAGGTTGTGTCCCACAATGC-3'。

[0016] 所述标记Xbarc1096与小麦条锈病抗性基因Yr50 的遗传距离为6.9 cM，标记Xwmc310 与Yr50 的遗传距离为7.2 cM。

[0017] 所述的辅助筛选Yr50的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对barc1096进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有132bp条带的待测小麦为候选的抗条锈病小麦；用所述引物对wmc310进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有188bp条带的待测小麦为候选的抗条锈病小麦。

[0018] 所述的分子标记用于SSR标记筛选时的反应程序为：

[0019] ⑴ PCR反应体系为20 μL，含10× buffer2 μL、10 mM Tris–HCl、pH 8.3、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、2 mM dNTP、0.25 μM分子标记引物、1U TaqDNA聚合酶、100 ng基因组DNA，去离子水补足至20 μL；

[0020] ⑵ 扩增程序为:94 ℃预变性5min；94 ℃变性45s，Xwmc310 在51 ℃或Xbarc1096 在52 ℃复性45s，72 ℃延伸1min，35个循环；72 ℃延伸10min，4 ℃保存；

[0021] ⑶ 电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将4 μL PCR产物和4 μL上样缓冲液混合点样，150V电泳2h，硝酸银染色拍照。

[0022] 其中所述的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=29:1，所述的上样缓冲液含0.4 g/ml蔗糖，1 mg/ml溴酚蓝和1 mg/ml二甲苯青。

[0023] 抗条锈病基因及其连锁标记的物理定位，用中国春小麦第4部分同源群的缺体-四体系和端体系对与抗病基因连锁的SSR标记进行染色体和染色体臂的物理定位，通过比较中国春与其端体系的扩增带型，将每个连锁标记定位到染色体臂上。 [0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0025] l、在国际上首次发现源于偃麦草的抗小麦条锈病新基因Yr50，并获与其连锁的分子标记：本发明利用846对SSR引物中5个与抗条锈病新基因Yr50连锁的分子标记，其中，标记Xbarc1096与Yr50的遗传距离为6.9 cM，标记Xwmc310与Yr50的遗传距离为7.2 cM，上述两个标记均与Yr50 紧密连锁，皆可用于该基因的分子标记辅助育种；

[0026] 2、利用本发明的条锈病分子标记辅助育种选择目标明确，可节约成本：传统的白粉病抗病育种首先要利用优异白粉病抗源为亲本进行杂交，然后对后代群体进行白粉病抗病性接种鉴定，该方法易受环境气候影响，选择准确性较低，因此传统抗病育种不但费时、费工，而且效率低、成本高。利用本发明的分子标记与条锈病抗性新基因Yr50紧密连锁的特点，在苗期就可快速、高通量地鉴定出含有条锈病抗性新基因Yr50 的分离群体和高代品系，在降低了成本的同时还可大幅度地提高选择效率，此外本发明的两个标记均为SSR标记，较之其他类型标记使用更为简便、快速；

[0027] 3、利用经典遗传学、中国春缺体—四体定位和分子标记方法，将Yr50定位在小麦4B染色体的长臂（4BL）上，这是迄今国内外首次定位在小麦4B染色体上的唯一的抗小麦条锈病新基因，本发明不仅为小麦抗条锈病育种提供了新抗源，而且进一步图位克隆该基因奠定了材料和技术基础；

[0028] 4、获得与目的基因紧密连锁的分子标记是成功进行植物分子育种和基因图位克隆的关键，但由于野生植物与其栽培物种的部分同源染色体缺乏高频率的配对和重组，使得外源目标基因的标记定位及其图位克隆极为困难（Cao等. Proc Natl Acad Sci USA,2011, 108(19): 7727-7732），本发明进行基因标记所用材料为自育的小麦-异源抗病渗入系（闫金龙等.植物保护学报，2010，37(5): 419-424）。由于它不含大的外源染色体片段，且能与小麦染色体正常配对，因而避免了前人因易位染色体片段过长而造成双亲间染色体的配对和重组受到抑制，从而实现了外源抗病基因的分子标记与定位。

附图说明

[0029] 图1为5个共显性SSR标记barc1096、wmc310、wmc47、gpw7272及gwm540对台长29×CH223 F2代部分单株的扩增结果；

[0030] 图中：P：CH223、Ps：台长29、Br：DNA抗池、Bs：DNA感池、R：抗病纯合体、Se：抗病杂合体、S：感病纯合体、R*、S* 和Se*：重组体基因型；

[0031] 图2为在4BL染色体上Yr50 的图谱位置；

[0032] 图3为5个SSR标记在中国春第4部分同源群缺体-四体材料和端体材料Dt4BS的扩增结果；

[0033] 图4为Xbarc1096 和Xwmc310 在SY95-71×CH223 F2代部分单株的扩增结果；

[0034] 图中：Pr：CH223、Ps：SY95-71、R：抗病纯合体、S：感病纯合体。

具体实施方式

[0035] 中间偃麦草中蕴含许多改良小麦品质、增强小麦抗性的有益基因，如目前正式命名的抗白粉病基因中，Pm40（Luo 等.Theoretical and Applied Genetics, 2009,118:1059-1064） 和 Pm43（He 等 . Theoretical and Applied Genetics, 2009,
118:1173-1180）均来自中间偃麦草。通过利用目前流行的条锈病小种条中29、31、32和
33接种鉴定发现，中间偃麦草、八倍体小偃麦-TAI7047及从“晋麦33/TAI7047∥2*京
411”BC2F6后代材料中选育出的CH223品系对四个小种都表现为免疫（表2），说明中间偃麦草中蕴含优良的抗条锈病基因。为更好的利用中间偃麦草中的抗条锈病基因改良小麦，我们对CH223中的抗条锈病基因进行定位和分子标记的开发，以实现分子标记辅助选择育种（Marker-assisted selection，MAS）。

[0036] 一、苗期抗性鉴定及抗条锈性基因来源

[0037] 为分析CH223抗条锈性基因的来源，于2007-2008年在山西省农业科学院作物科学研究所温室和成都电子科技大学邛崃病圃对小偃麦抗病渗入系及其杂交亲本TAI7047、京411、晋麦33及TAI7047的亲本中间偃麦草、太原768和晋春5号进行苗期抗性鉴定，铭贤169为感病对照。幼苗期分小种接种，待第1-2片叶充分展开后，用扫抹法接种预先繁殖好的新鲜菌种。条锈菌接种后的幼苗置于保湿桶中10℃结露保湿24h。温室温度控制在18/12℃（白天/晚上）、光照12～14h/d,光强大于10000lx。接种后16～18d，当感病对照品种“铭贤169”充分发病时，按0、0;、1、2、3、4的分级标准调查、记载其条锈病的侵染型，其中0-2的侵染型为抗病，3-4的侵染型为感病（刘孝坤.植物保护学报，1988，15 (1):33-39）。抗性评价标准见表1。

[0038] 表1本发明所用抗条锈病评价标准侵染型级别 苗期受条锈菌侵染表现 抗性水平
0 没有夏抱子堆和任何其它症状 免疫
0; 没有夏抱子堆，但有过敏性斑点 近于免疫
1 夏抱子堆很小，周围有清晰的坏死区 高抗
2 夏抱子堆小到中等，往往产生在绿岛中，绿岛周围有明显褪绿或坏死的边缘 中抗
3 夏抱子堆大小中等，合并现象很少，无坏死，但可能有褪绿区，尤其在生长条件中感不适宜时
4 夏抱子堆大，常常合并在一起，无坏死，但在生长条件不适宜时可能有褪绿现象高感[0039] 二、CH223/台长29和CH223/SY95-71杂种后代群体构建及表型鉴定

[0040] 1、杂交后代群体构建：以感条锈品种“台长29”为母本，抗条锈品系CH223为父本杂交获得F1，自交获得含211株单株的F2群体，每个F2单株通过自交获得F2:3家系。以感条锈品系SY95-71为母本，CH223为父本杂交，以同样的方法获得F1、含215株单株的F2群体和F2:3家系，此外该杂交组合还获得含94株单株的BC1群体。

[0041] 2、表型鉴定：用于抗病遗传分析的亲本及杂种后代都于2009-2011年种植于电子科技大学邛崃试验场。双亲及其F1代各播14粒；BC1代播8行、共104粒、F2代播17行、共221粒；F2:3家系及亲本种植一个重复，行长1.0m，每行点播15粒，行距0.25m。为确保发病充分，每10行种植1行感病对照铭贤169，并且试验材料四周种植铭贤169作诱发行。于2月下旬至3月上旬将条锈菌系条中32接种于试验材料和诱发品种铭贤169，接种后于灌浆期调查、记录病害的侵染型。双亲和F1按行观察，F2、BC1群体分单株观察。侵染型分级根据刘孝坤（植物保护学报，1988，15 (1): 33-39）的6级分类法进行，其中0-0；为免疫，1为高抗，2为中抗，3为中感，4为高感（表1）。根据F1的反应型及F2、F2:3和BC1群体中抗、感
2
单株分离比例确定控制抗性的基因对数和显隐性，并通过χ 测验判定其观察值与理论值的符合程度。

[0042] 三、CH223/台长29 F2群体的分子标记分析

[0043] 1、总DNA提取采用改良的SDS法（Yang 等. Hereditas, 2005, 142:80-85）。

[0044] 2、SSR扩增：PCR反应体系总体积为20 μL，由10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTPs、0.25 μM引物、80~100ng 模板DNA、1U Taq 酶组成。扩增程序与He等（Theoretical and Applied Genetics, 2009, 118:1173-1180）的相同。扩增产物用8%聚丙烯酰胺非变性胶，玻璃板垂直电泳，恒定电压150V、1.5-2 h，硝酸银染色。 [0045] 3、多态性标记筛选：采用优选小群体（Preferred Small Group）法筛选多态性标记。优选小群体由10株典型的抗病单株和10株典型的感病单株组成，稍微不同于Michelmore等提出的分离群体分组分析法（BSA）（Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:9828-9832），即不再将单株DNA混合建池，而是直接对20个单株进行PCR扩增和基因型检测。寻找表现型（抗感性状）和基因型（扩增带型）基本一致的标记，进一步在大的分离群体中进行验证，计算标记与基因之间连锁遗传距离，其标准是在优选小群体中估算的遗传重组率低于40%。

[0046] 4、数据分析：卡方检验（χ2）用来确定抗性分离群体F2、F2:3中观测值和理论期望值的适合度。将筛选到的多态性标记对“台长29/CH223”的F2单株进行检测，用MAPMAKER/EXP3.0软件计算标记与抗病基因之间的遗传距离，LOD值为3.0。Mapdraw V2.1软件绘制该抗病基因的标记连锁图，确定所筛标记与该抗病基因的连锁关系。

[0047] 四、结果与分析

[0048] 1、CH223的抗性鉴定及抗性基因来源

[0049] 以铭贤169为感病对照，用条锈菌系CYR29、CYR31、CYR32、CYR33对源于中间偃麦草的小偃麦抗病渗入系进行抗性鉴定。结果表明，小偃麦抗病渗入系对我国当前小麦条锈病的流行菌系或强毒力菌系均表现免疫，结果见表2。因此，小偃麦抗病渗入系是一个小麦条锈病的有效抗源。

[0050] 为明确小偃麦抗病渗入系CH223中抗小麦条锈病基因的来源，对小偃麦抗病渗入系、TAI7047及其各自的亲本用上述条锈菌系进行了苗期接种鉴定。结果显示，小偃麦抗病渗入系的抗性表现与其抗病亲本TAI7047以及TAI7047的野生亲本中间偃麦草大体相同，均为免疫，其侵染型为0或0；级；而小偃麦抗病渗入系的小麦亲本“京411” 、“晋麦33”和TAI7047的小麦亲本“太原768”、“晋春5号”均高感条锈病，其侵染型为4级（表2）。据此推断，小偃麦抗病渗入系所含的小麦条锈病抗性基因来自中间偃麦草。

[0051] 表2 CH223、八倍体小偃麦TAI7047及其亲本对小麦条锈病的抗性表现[0052]

[0053] 注: a. 小偃麦抗病渗入系的小麦亲本；b.八倍体小偃麦TAI7047的小麦亲本；c.小麦基因组

[0054] 2、抗性遗传方式

[0055] 用条锈菌小种条中32号（CYR32）对来自小偃麦抗病渗入系与感病品种“台长29”、“SY95-71”的杂交后代群体F1、F2、F2:3、BC1进行接种鉴定。结果表明（表3），所有杂交组合的F1植株均抗病，其侵染型为0-0；级。来自台长29/小偃麦抗病渗入系杂交F2的221个单株中，162株抗病（侵染型为0-0;级的60株、1-2级的102株），59株感病（侵染型为3级2
的20株、4级的39株），其χ =0.34，P=0.56，表明抗、感的分离比符合3:1。来自SY95-71/小偃麦抗病渗入系杂交F2的215个单株中，抗病的157株（侵染型为0-0;级的117株、1-2
2
级的40株）、感病的58株（侵染型为3级的21株、4级的37株），其χ=0.45，P=0.50，抗感分离比亦符合3:1。同时，98个“SY95-71/小偃麦抗病渗入系∥SY95-71”的BC1单株中，
53株抗病（侵染型为0-0;级的36株、1-2级的17株）、45株感病（侵染型为3级的21株、4
2
级的24株），其χ =0.65，P=0.42，抗感分离符合1:1。

[0056] 翌年，对“台长29/CH223”的F3家系再用条锈菌系CYR32进行接种鉴定。从调查结果发现，211个F2:3家系中、抗病的53个，抗性分离的111个，感病的47个（表3）。经适2
合度测验，符合1:2:1的显性单基因分离模式（χ=0.92、P=0.63）。因此，上述结果表明，小偃麦抗病渗入系对条锈病CYR32菌系的抗性受1对显性核基因所控制，将这一显性基因命名为Yr50。

[0057] 表3抗×感杂交组合各世代对条中32号小种的抗性分离

[0058]

[0059] 注：R、Se和S分别指纯合抗病、杂合型和纯合感病；P=0.05时差异显著值χ2=3.832
（df=1），χ=5.99（df=2）

[0060] 3、抗性基因的Yr50 连锁标记

[0061] 选用846对SSR引物对小偃麦抗病渗入系和台长29基因组DNA进行多态性分析，共获得385对多态性引物。采用优选小群体（Preferred Small Group）法，利用F2群体对抗、感DNA池的进一步筛选，筛选出5个引物对在抗、感DNA池中具有多态性，它们分别是2
barc1096、wmc310、wmc47、gpw7272及gwm540（图1），并且经过χ 检验，5个连锁标记在F2抗性分离群体中也均符合1:2:1的理论分离比例（表4）。

[0062] 表4台长29/CH223的F2群体中各SSR标记位点的分离比

[0063]

[0064] 注：P=0.05时差异显著值χ2=5.99，df=2；RR ：纯合抗病；Rr ：杂合型；rr：纯合感病；AA：抗性基因Yr50 带型；aa：台长29的感病带型；Aa：杂合带型

[0065] 4、抗条锈病基因Yr50 的遗传图谱

[0066] 利用来自台长29/小偃麦抗病渗入系F2群体的211个单株用上述5个引物分别进行了PCR扩增、电泳分析和MAPMAKER3.0软件遗传距离计算分析。结果表明，5个共显性SSR标记Xgwm540、Xbarc1096、Xwmc310、Xgpw7272 及Xwmc47 连锁，其标记与抗性基因可能的顺序Xgwm540-Xbarc1096-Yr50-Xwmc310-Xgpw7272-Xwmc47，其中距离Yr50最近的两个标记为Xbarc1096 和Xwmc310，遗传距离分别为6.9cM和7.2cM，见图2。

[0067] 、Yr50的染色体定位

[0068] 为确定抗条锈病基因Yr50所在的染色体位置，用5个与Yr50连锁的SSR标记在中国春及其第4部分同源群染色体的缺体-四体系（N4BT4A、N4AT4B和N4DT4B）DNA上扩增。结果表明，与Yr50连锁的多态性标记位点均位于4B染色体上。进一步在4BS染色体端体系（Dt4BS）DNA上扩增，结果只有Xgwm540 位于4BS上，其余4个标记Xbarc1096、Xwmc310、Xgpw7272 和Xwmc47 均无扩增产物（图3），由此Yr50 位于4BL上。

[0069] 、Yr50两侧连锁标记Xbarc1096和Xwmc310的应用

[0070] 提取SY95-71×CH223 F2代部分单株的DNA，用Xbarc1096 和Xwmc310 引物做PCR扩增。PCR反应体系为：20 μL，含10×buffer（10 mM Tris–HCl，pH 8.3，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2）2μL、2 mM dNTP、0.25 μM分子标记引物、1U TaqDNA聚合酶、100 ng基因组DNA，去离子水补足至20μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，51 ℃（Xwmc310）或52 ℃（Xbarc1096）复性45s，72 ℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4 ℃保存。结果显示，在抗病单株中都扩增出与亲本CH223同样的一条132bp（Xbarc1096）或188bp（Xwmc310）的条带，而在感病单株和感病亲本SY95-71中都没有扩增出该大小的片段（图4）。

[0071] 五、结论

[0072] 1、CH223抗条锈病基因的来源、抗性遗传方式及染色体位置

[0073] 中间偃麦草对三锈、条锈等多种小麦真菌病害具有良好抗性。CH223是以八倍体小偃麦TAI7047为抗源，与普通小麦品种杂交、回交的高代选系，在杂交系谱中、其小麦亲本太原768、晋春5号、晋麦33、京411均高感条锈菌系条中29、31、32、33号小种（表1），而抗病亲本TAI7047及其野生亲本中间偃麦草（近）免疫所有测试小种（表1），说明小偃麦抗病渗入系的抗条锈病基因来自中间偃麦草。利用中国春第4部分同源群的缺体-四体和双端体材料进一步将Yr50定位在小麦染色体4B的长臂（4BL）上（图2）。现已公开报道的72个抗小麦条锈病基因中，均没有来自中间偃麦草的，而且，它们分布于除1A、4A、4B和7A的其他小麦染色体上（McIntosh 等. Catalogue of Gene Symbols for Wheat, 2008-2011）。说明本研究发现的抗条锈病基因与现有的已知基因不存在任何等位关系，且基因位点属于不同的小麦染色体。因此，根据基因来源、染色体位置及分子标记定位结果，可以断定这是迄今国内外首次定位在小麦4B染色体上的唯一的抗小麦条锈病新基因。

[0074] 对CH223与两个感条锈亲本“台长29”和“SY95-71”的BC1、F2、F2:3杂种后代群体中的抗感分离情况来看，其抗性分离均符合1对显性单基因的分离模式（表2），说明CH223中来自中间偃麦草的抗小麦条锈病特性受1对显性核基因控制。通过筛选SSR标记，发现5个SSR标记与Yr50连锁。从这5个标记的在F2群体中的分离情况看，均符合1:2:1的分离比例（表3）。结合原位杂交结果、花粉母细胞减数分裂说明，CH223中外源染色体片段很小，因而Yr50 可以容易的导入到其他小麦中，这在抗条锈病育种中将有广阔的应用前景。 [0075] 、微卫星标记Xbarc1096 和Xwmc310 在检测Yr50 中的应用

[0076] Xbarc1096和Xwmc310与Yr50的遗传距离分别为6.9 cM和7.2 cM，在两个杂交组合“台长29×CH223”、“SY95-71×CH223”都能在抗病亲本和单株中检测到132bp和188bp的条带，而在感病亲本和单株中都无该大小的片段出现（图1和图4），因此这两个标记可以在分子辅助选择Yr50 育种中大幅度地提高选择效率。