一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用转让专利
申请号 : CN201210066328.4
文献号 : CN102618640B
文献日 : 2013-11-20
发明人 : 刘喆 , 马振毅 , 李西川
申请人 : 天津医科大学
摘要 :
本发明涉及一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用，试剂盒由RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系、PCR反应体系组成，其中所述PCR反应体系含有特异扩增p52Shc基因的引物序列为：序列1和序列2；含有特异扩增p66Shc基因的引物序列为：序列3和序列4。本发明的试剂盒对实体肿瘤患者的临床术后标本进行分析，根据其p52Shc/p66Shc基因表达模式，可判断患者的病理分型和预后。本试剂盒具有判断准确性好、灵敏度高、使用成本低和适用范围广等优点。
权利要求 :
Shc Shc
1.一种检测p52 /p66 基因表达模式的分子诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒由RNAShc抽提体系、RNA逆转录反应体系和PCR反应体系组成，其中PCR反应体系含有特异扩增p52Shc基因的引物的序列为：序列1和序列2；含有特异扩增p66 基因的引物的序列为：序列3和序列4；
所述RNA抽提体系具体包括：TRIzol、氯仿、异丙醇、75%乙醇和Nuclease-FreeWater；
所述RNA逆转录反应体系具体包括：oligo(dT)18、dNTPMix、5×ReverseTranscriptReactionBuffer、Nuclease-FreeWater和ReverseTranscriptase；
所 述 PCR 反 应 体 系 具 体 包 括：Nuclease-FreeWater、dNTPMix、10×PCRReactionBuffer、DNA聚合酶、引物序列1、引物序列2、引物序列3和引物序列4。
Shc Shc
2.一种如权利要求1所述的检测p52 /p66 基因表达模式的分子诊断试剂盒在制备实体肿瘤的病理分型试剂中的应用。
Shc Shc
3.权利要求2所述的检测p52 /p66 基因表达模式的分子诊断试剂盒在制备实体肿瘤的病理分型试剂中的应用，其特征在于：所述实体肿瘤为通过临床检查或触诊扪及到的有形肿块的肿瘤。
Shc Shc
4.一种如权利要求1中所述的检测p52 /p66 基因表达模式的分子诊断试剂盒在制备实体肿瘤的预后试剂中的应用。
Shc Shc
5.权利要求4所述的检测p52 /p66 基因表达模式的分子诊断试剂盒在制备实体肿瘤的预后试剂中的应用，其特征在于：所述实体肿瘤为通过临床检查或触诊扪及到的有形肿块的肿瘤。
说明书 :
Shc Shc
一种检测p52 /p66 基因表达模式的分子诊断试剂盒及
其检测方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，涉及核酸的检测试剂及其在肿瘤诊断分型Shc Shc和预后中的应用，尤其是一种检测p52 /p66 基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用。
背景技术
[0002] 近年来恶性肿瘤患者人数逐渐增加，已成为临床上导致患者死亡的主要因素之一。肿瘤标志物(Tumor Marker TM)在肿瘤普查、诊断、判断预后、评价治疗疗效和高危人群随访等方面都具有较大的实用价值，是目前肿瘤学研究的关键问题之一。目前已经应用于临床的肿瘤标志物有甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等多种，但总体来说还是不够完善，临床仍然迫切要求更多更好的肿瘤标志物和检测试剂盒的发现/发明和临床应用。 [0003] 最新研究表明，肿瘤转移抑制基因p66Shc的表达水平与肿瘤的发生发展密切相关，Shc Shc在正常体细胞中p66 稳定表达，而在肿瘤细胞中p66 表达失活，导致细胞绕过失巢凋亡Shc
途径，促进肿瘤的转移。小鼠实验证明，p66 是人体内一个重要的肿瘤转移抑制基因，该基Shc
因的表达失活大大促进了肿瘤的转移。因此，p66 的表达水平可以成为一个潜在的、具有临床应用前景的肿瘤标志物。发明内容
途径，促进肿瘤的转移。小鼠实验证明，p66 是人体内一个重要的肿瘤转移抑制基因，该基Shc
因的表达失活大大促进了肿瘤的转移。因此，p66 的表达水平可以成为一个潜在的、具有临床应用前景的肿瘤标志物。发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用，本试剂盒具有灵敏度高、成本低、检测方法简便、快速的优点。 [0005] 本发明的目的是这样实现的：
[0006] 一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒，试剂盒由RNA抽提体系、ShcRNA逆转录反应体系和PCR反应体系组成，其中PCR反应体系含有特异扩增p52 基因的引Shc
物的序列为：序列1和序列2；含有特异扩增p66 基因的引物的序列为：序列3和序列4。 [0007] 而且，所述RNA抽提体系具体包括：TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和Nuclease-Free Water。
物的序列为：序列1和序列2；含有特异扩增p66 基因的引物的序列为：序列3和序列4。 [0007] 而且，所述RNA抽提体系具体包括：TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和Nuclease-Free Water。
[0008] 而且，所述RNA逆转录反应体系具体包括：oligo(dT)18、dNTP Mix、5×Reverse Transcript Reaction Buffer、Nuclease-Free Water和Reverse Transcriptase。 [0009] 而且，所述PCR反应体系具体包括：Nuclease-Free Water、dNTP Mix、10×PCR Reaction Buffer、DNA聚合酶、引物序列1、引物序列2、引物序列3和引物序列4。 [0010] 一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤如下：
[0011] (1)从临床获得实体肿瘤患者手术后的新鲜肿瘤样本，用RNA抽提体系提取样本的总RNA；
[0012] (2)使用RNA逆转录反应体系将该总RNA经逆转录反应转变为cDNA；
[0013] (3)以该cDNA为模板，用PCR反应体系通过PCR反应分别特异扩增p52Shc和p66Shc基 因的目标DNA片段，将PCR产物送到生物技术公司测序；
[0014] (4)分析该PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图，计算p66Shc单等位基因表达模式的丢失程度，对肿瘤患者病理分型和预后作出判断。
[0015] 而且，所述步骤(4)将p52Shc基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中CShc和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到数值分别为x1和y1；将p66 基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到Shc
数值分别为x2和y2；根据下列公式计算p66 单等位基因表达模式丢失程度值LOM，根据表1判断患者的病理分期和预后，公式为：
数值分别为x2和y2；根据下列公式计算p66 单等位基因表达模式丢失程度值LOM，根据表1判断患者的病理分期和预后，公式为：
[0016]Shc
[0017] 公式1 p66 单等位基因表达模式丢失程度值LOM计算公式Shc
[0018] 肿瘤患者p66 单等位基因表达模式丢失程度值LOM与病理分期和预后的关系表 [0019]LOM 病理分期 预后
0～25％ I 优
25％～50％ II 良
50％～75％ III 中
75％～100％ IV 差
0～25％ I 优
25％～50％ II 良
50％～75％ III 中
75％～100％ IV 差
[0020] 一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒在实体肿瘤的病理分型中的应用。
[0021] 而且，所述实体肿瘤为通过临床检查或触诊扪及到的有形肿块的肿瘤。 [0022] 一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒在实体肿瘤的预后中的应用。
[0023] 而且，所述实体肿瘤为通过临床检查或触诊扪及到的有形肿块的肿瘤。 [0024] 本发明的优点和积极效果是：
[0025] 1、本发明提供的试剂盒可以通过检测p66Shc单等位基因表达模式丢失程度的具体数值对患者预后进行科学判断；因此，本发明提供的试剂盒在对患者进行病理分型和预后判断时具有判断准确性好的突出优点。
[0026] 2、本发明提供的试剂盒是通过RT-PCR反应对肿瘤患者标本的p66Shc单等位基因表达模式丢失程度进行检测，因此具备灵敏度高和检测成本低等优点。
[0027] 3、本发明提供的试剂盒可以应用于肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌等多种实体肿瘤，因此具有适用范围广的优点。
[0028] 4、本发明提供的p52Shc/p66Shc基因表达模式分子诊断试剂盒能够有效提高对实体肿瘤患者的病理分型和预后的准确率，有效降低检测成本。
[0029] 5、本发明提供的试剂盒可以通过检测肿瘤患者术后标本中p66Shc基因的表达模式判断患者的病理分型和预后。目前临床上对肿瘤患者进行病理分型和预后判断的方法是临床医生通过对病理切片的显微观察得出的主观判断，而本发明提供的试剂盒可以根据检测数值对患者 的病理分型和预后进行科学判断，具有判断准确性好的突出优点。 附图说明
[0030] 图1为本发明p52Shc/p66Shc基因表达模式分子诊断试剂盒的工作原理示意图； [0031] 图2为本发明根据测序峰图计算p66Shc单等位基因表达模式丢失程度(LOM)的示Shc Shc意图；其中p52 测序图中C和T的峰面积分别为x1和y1；p66 测序图中C和T的峰面积分别为x2和y2；
[0032] 图3为本发明试剂盒在临床肺癌肿瘤患者的病理分析和预后判断中的应用1例； [0033] 图4为本发明试剂盒在临床肝癌肿瘤患者的病理分析和预后判断中的应用1例； 具体实施方式
[0034] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0035] 本发明所述的p52Shc/p66Shc基因表达模式分子诊断试剂盒的工作原理是：p52Shc和Shcp66 是由定位于人类第1号染色体1q21的同一个SHC1基因编码，使用两个不同的启动Shc
区，分别转录并翻译成的两个不同蛋白。在正常体细胞中p52 只在细胞两个等位基因中Shc
的一个表达，而p66 则只在另一个等位基因表达，即二者呈单等位基因表达；而在肺癌，Shc Shc
肝癌等实体瘤肿瘤细胞中，随着肿瘤转移程度的加深，p66 逐渐表达失活，而p52 则逐渐Shc Shc
在两条等位基因上都开始表达。所以，p52 /p66 的基因表达模式与肿瘤的转移程度直接Shc Shc
相关。SNP rs8191981位于p66 mRNA和p52 mRNA的公有外显子上，为C/T型SNP位点。
从临床肿瘤患者手术后的肿瘤样本中提取总RNA，经逆转录反应获得cDNA，经PCR特异性Shc Shc Shc Shc
扩增含有该SNP位点的p66 和p52 DNA片段，通过DNA测序检测p66 和p52 转录本mRNA在该SNP位点的基因型。如附图1所示，如果转录本经测序发现在该SNP位点出现C或T单峰，则说明该转录本只在对应的单个等位基因表达；如果转录本经测序发现在该SNP位点出现C、T双峰，则说明该转录本在两个等位基因都表达，根据峰面积可以计算出该转Shc
录本在两个等位基因上的表达比例和p66 单等位基因表达模式的丢失程度，从而对肿瘤患者病理分型和预后作出判断。
区，分别转录并翻译成的两个不同蛋白。在正常体细胞中p52 只在细胞两个等位基因中Shc
的一个表达，而p66 则只在另一个等位基因表达，即二者呈单等位基因表达；而在肺癌，Shc Shc
肝癌等实体瘤肿瘤细胞中，随着肿瘤转移程度的加深，p66 逐渐表达失活，而p52 则逐渐Shc Shc
在两条等位基因上都开始表达。所以，p52 /p66 的基因表达模式与肿瘤的转移程度直接Shc Shc
相关。SNP rs8191981位于p66 mRNA和p52 mRNA的公有外显子上，为C/T型SNP位点。
从临床肿瘤患者手术后的肿瘤样本中提取总RNA，经逆转录反应获得cDNA，经PCR特异性Shc Shc Shc Shc
扩增含有该SNP位点的p66 和p52 DNA片段，通过DNA测序检测p66 和p52 转录本mRNA在该SNP位点的基因型。如附图1所示，如果转录本经测序发现在该SNP位点出现C或T单峰，则说明该转录本只在对应的单个等位基因表达；如果转录本经测序发现在该SNP位点出现C、T双峰，则说明该转录本在两个等位基因都表达，根据峰面积可以计算出该转Shc
录本在两个等位基因上的表达比例和p66 单等位基因表达模式的丢失程度，从而对肿瘤患者病理分型和预后作出判断。
[0036] 一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒，该试剂盒由RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和PCR反应体系组成。
[0037] 上述RNA抽提体系具体包括：TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇(Nuclease-Free Water配制)和Nuclease-Free Water；这些试剂均为本领域常用的生物化学试剂，可以是上海英俊生物技术有限公司提供的试剂。
[0038] 上述RNA逆转录反应体系具体包括：oligo(dT)18、dNTP Mix、5×Reverse Transcript Reaction Buffer、Nuclease-Free Water和Reverse Transcriptase。其中oligo(dT)18浓度为100μM，dNTP Mix的浓度为10mM，5×Reverse Transcript Reaction Buffer的配方为250mM Tris-Cl(pH 8.3)+250mM KCl+20mM MgCl2+50mM DTT，Reverse Transcriptase可以是MBI Fermentas公司提供的M-MuLV Reverse Transcriptase(20U/μl)。这些试剂均为本领域常用的生 物化学试剂。
[0039] 上述PCR反应体系具体包括：Nuclease-Free Water、dNTP Mix、10×PCR Reaction Buffer、DNA聚合酶、引物序列1、引物序列2、引物序列3和引物序列4。其中Nuclease-Free Water和dNTP Mix同上述RNA逆转录反应体系，10×PCR Reaction Buffer的配方为100mMTris-HCl(pH 8.8)+500mM KCl+15mM MgCl2+0.8％NP40，DNA聚合酶为本领域常用的DNA聚合酶，可以是Invitrogen公司提供的Platinum Taq酶(5U/μl)。这些试剂均为本领域常用的生物化学试剂。引物(序列1)AAGCTGGCAG TGGCGTGATC CGGCAC和(序列2)Shc
TAGGCGACAT ACTCGGCTGT GTCCGG用于特异性扩增一段含有SNP rs8191981位点的p52基因DNA片段；引物(序列3)ATGAGCAACC TGAGGCTGGC CAACCC和(序列4)GGCGATGATC Shc
TGTTTGCAGT CTGCGG用于特异性扩增一段含有SNP rs8191981位点的p66 基因DNA片段。
这两对引物可以由本领域常用的方法合成，本发明所述的两对引物均有上海英俊生物技术有限公司合成提供。
TAGGCGACAT ACTCGGCTGT GTCCGG用于特异性扩增一段含有SNP rs8191981位点的p52基因DNA片段；引物(序列3)ATGAGCAACC TGAGGCTGGC CAACCC和(序列4)GGCGATGATC Shc
TGTTTGCAGT CTGCGG用于特异性扩增一段含有SNP rs8191981位点的p66 基因DNA片段。
这两对引物可以由本领域常用的方法合成，本发明所述的两对引物均有上海英俊生物技术有限公司合成提供。
[0040] 一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒的检测方法，步骤如下： [0041] (1)从临床获得肿瘤患者手术后的肿瘤样本，用RNA抽提体系提取获得样本的总RNA：将组织剪切成小块，取约50mg组织加入1ml Trizol，室温放置5分钟；加入0.2ml氯仿，vortex混匀15秒，室温放置2-3分钟；12,000g 4℃离心15分钟，吸取上层无色水相至新的离心管中；加入0.5ml异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10分钟；12,000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清；加入1ml 75％乙醇(Nuclease-Free Water配制)，颠倒混匀；7,500g 4℃离心5分钟，弃上清，小心吸尽液体；待RNA略干后，加入20μl Nuclease-Free Water溶解，获得样本的总RNA。
[0042] (2)使用RNA逆转录反应体系，将样本的总RNA经逆转录反应转变为该样本的cDNA：逆转录反应体系和反应条件为：Nuclease-Free Water 8μl、总RNA4μl、oligo(dT)181μl，65℃ 5min；然后加入5×Reverse Transcript Reaction Buffer 4μl、dNTP Mix 2μl和Reverse Transcriptase 1μl，42℃ 60min；然后70℃灭活5min。 [0043] (3)以该样本的cDNA为模板，用PCR反应体系通过PCR反应分别特异扩增来Shc Shc源于p52 和p66 的目标DNA片段，并将其送到生物技术公司测序：PCR反应体系为：
Nuclease-Free Water 13.5μl、10×PCR Reaction Buffer 2μl、dNTP Mix 1μl、cDNA
1μl、DNA聚合酶1μl、引物序列1或3 1μl、引物序列2或4 1μl；PCR反应条件为：95℃
5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，30cycle；72℃ 5min。PCR产物直接送到生物技术公司测序，生物技术公司可以是上海英俊生物技术有限公司。
Nuclease-Free Water 13.5μl、10×PCR Reaction Buffer 2μl、dNTP Mix 1μl、cDNA
1μl、DNA聚合酶1μl、引物序列1或3 1μl、引物序列2或4 1μl；PCR反应条件为：95℃
5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，30cycle；72℃ 5min。PCR产物直接送到生物技术公司测序，生物技术公司可以是上海英俊生物技术有限公司。
[0044] (4)通过分析该SNP位点的测序峰图，计算p66Shc单等位基因表达模式的丢失程Shc度，对肿瘤患者病理分型和预后作出判断：将p52 基因和PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到数值分别为x1和y1；将Shc
p66 基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格Shc
法进行积分，得到数值分别为x2和y2；根据下列公式计算p66 单等位基因表达模式丢失程度值(LOM)，根 据表1判断患者的病理分期和预后，如附图2所示。
p66 基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格Shc
法进行积分，得到数值分别为x2和y2；根据下列公式计算p66 单等位基因表达模式丢失程度值(LOM)，根 据表1判断患者的病理分期和预后，如附图2所示。
[0045]Shc
[0046] 公式1p66 单等位基因表达模式丢失程度值(LOM)计算公式Shc
[0047] 表1肿瘤患者p66 单等位基因表达模式丢失程度值(LOM)与病理分期和预后的关系
[0048]LOM 病理分期 预后
0～25％ I 优
25％～50％ II 良
50％～75％ III 中
75％～100％ IV 差
0～25％ I 优
25％～50％ II 良
50％～75％ III 中
75％～100％ IV 差
[0049] 为了更好理解本发明试剂盒的使用方法和技术效果，下面将通过具体的病理分析来对本发明做具体的阐述。
[0050] I临床肺癌肿瘤患者病理分析和预后判断1例
[0051] 从临床获取肺癌患者新鲜的术后标本，用解剖剪尽量绞碎，加入1ml Trizol，室温放置5分钟；加入0.2ml氯仿，vortex混匀15秒，室温放置2-3分钟；12,000g 4℃离心15分钟，吸取上层无色水相至新的离心管中；加入0.5ml异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10分钟；12,000g4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清；加入1ml 75％乙醇(Nuclease-Free Water配制)，颠倒混匀；7,500g 4℃离心5分钟，弃上清，小心吸尽液体；待RNA略干后，加入20μl Nuclease-Free Water溶解，获得样本的总RNA。向一个无菌且无核酸酶的PCR管中加入Nuclease-Free Water 8μl、总RNA 4μl、oligo(dT)181μl，
65℃ 5min；然后加入5×Reverse Transcript Reaction Buffer 4μl、dNTP Mix 2μl和Reverse Transcriptase 1μl，42℃ 60min；然后70℃灭活5min，获得cDNA。向新的PCR管中加入Nuclease-Free Water 13.5μl、10×PCR Reaction Buffer 2μl、dNTP Mix 1μl、cDNA 1μl、DNA聚合酶1μl、引物序列1 1μl、引物序列2 1μl进行PCR反应，反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，30cycle；72℃ 5min。经电泳检测PCR产物为具有单一条带的DNA片段，将其送到上海英俊生物技术有限公司进行DNA测序测Shc Shc
序，测序结果如附图3所示。根据测序结果，我们对p52 和p66 SNP位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行简易积分，x1＝108，y1＝72，x2＝70，y2＝112，根据公式1，计算得到LOM＝80％，根据表1，我们判断出该患者的病理分型为肺癌IV期，预后为差。
65℃ 5min；然后加入5×Reverse Transcript Reaction Buffer 4μl、dNTP Mix 2μl和Reverse Transcriptase 1μl，42℃ 60min；然后70℃灭活5min，获得cDNA。向新的PCR管中加入Nuclease-Free Water 13.5μl、10×PCR Reaction Buffer 2μl、dNTP Mix 1μl、cDNA 1μl、DNA聚合酶1μl、引物序列1 1μl、引物序列2 1μl进行PCR反应，反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，30cycle；72℃ 5min。经电泳检测PCR产物为具有单一条带的DNA片段，将其送到上海英俊生物技术有限公司进行DNA测序测Shc Shc
序，测序结果如附图3所示。根据测序结果，我们对p52 和p66 SNP位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行简易积分，x1＝108，y1＝72，x2＝70，y2＝112，根据公式1，计算得到LOM＝80％，根据表1，我们判断出该患者的病理分型为肺癌IV期，预后为差。
[0052] II临床肝癌肿瘤患者病理分析和预后判断1例
[0053] 从临床获取肝癌患者新鲜的术后标本，用解剖剪尽量绞碎，加入1ml Trizol，室温放置5分钟；加入0.2ml氯仿，vortex混匀15秒，室温放置2-3分钟；12,000g 4℃离心15分钟，吸 取上层无色水相至新的离心管中；加入0.5ml异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10分钟；12,000g4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清；加入1ml 75％乙醇(Nuclease-Free Water配制)，颠倒混匀；7,500g 4℃离心5分钟，弃上清，小心吸尽液体；待RNA略干后，加入20μl Nuclease-Free Water溶解，获得样本的总RNA。向一个无菌且无核酸酶的PCR管中加入Nuclease-Free Water 8μl、总RNA4μl、oligo(dT)181μl，
65℃ 5min；然后加入5×Reverse Transcript Reaction Buffer 4μl、dNTP Mix 2μl和Reverse Transcriptase 1μl，42℃ 60min；然后70℃灭活5min，获得cDNA。向新的PCR管中加入Nuclease-Free Water 13.5μl、10×PCR Reaction Buffer 2μl、dNTP Mix 1μl、cDNA 1μl、DNA聚合酶1μl、引物序列1 1μl、引物序列2 1μl进行PCR反应，反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，30cycle；72℃ 5min。经电泳检测PCR产物为具有单一条带的DNA片段，将其送到上海英俊生物技术有限公司进行DNA测序测Shc Shc
序，测序结果如附图4所示。根据测序结果，我们对p52 和p66 SNP位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行简易积分，x1＝12，y1＝120，x2＝161，y2＝16，根据公式1，计算得到LOM＝18.2％，根据表1，我们判断出该患者的病理分型为肝癌I期，预后为优。
65℃ 5min；然后加入5×Reverse Transcript Reaction Buffer 4μl、dNTP Mix 2μl和Reverse Transcriptase 1μl，42℃ 60min；然后70℃灭活5min，获得cDNA。向新的PCR管中加入Nuclease-Free Water 13.5μl、10×PCR Reaction Buffer 2μl、dNTP Mix 1μl、cDNA 1μl、DNA聚合酶1μl、引物序列1 1μl、引物序列2 1μl进行PCR反应，反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，30cycle；72℃ 5min。经电泳检测PCR产物为具有单一条带的DNA片段，将其送到上海英俊生物技术有限公司进行DNA测序测Shc Shc
序，测序结果如附图4所示。根据测序结果，我们对p52 和p66 SNP位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行简易积分，x1＝12，y1＝120，x2＝161，y2＝16，根据公式1，计算得到LOM＝18.2％，根据表1，我们判断出该患者的病理分型为肝癌I期，预后为优。
[0054] 本发明所述实体肿瘤为通过临床检查或触诊扪及到的有形肿块的肿瘤。 [0055] 一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒在实体肿瘤的预后中的应用。
[0056] 所述肿瘤具体包括肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌、结直肠癌和卵巢癌。