基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒

摘要

本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1，试剂R2以及校准品，其中：试剂R1为Tris-HCl缓冲体系，包括Tris-HCl缓冲液，聚合物，乙二胺四乙酸二钠。试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液。参考校准品，包括牛血清基质；根据牛血清基质的体积用量百分比，还包括防腐剂0.2-2.2％，稳定剂1-10％。本发明同现技术相比，不但能用于肾功能疾病的辅助诊断，同时也能用于营养不良的辅助诊断。具有很高的临床应用价值。

权利要求

1.一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1，试剂R2以及校准品，其中：试剂R1为Tris-HCl缓冲体系，包括Tris-HCl缓冲液30-60mmol/l，PH值为7.2-7.6；

聚合物60-95mmol/l；乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/l；

试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液35-60mmol/l，pH值为7.2-7.6；其中，所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子采用物理吸附法，具体步骤为：将羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳混合,将两者混匀后37℃吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液，封闭2小时，离心去上清，用胶乳稀释液稀释至1.2-2.5％；

校准品，包括牛血清基质；根据牛血清基质的体积用量百分比，还包括防腐剂

0.2-2.2％和稳定剂1-10％；

且所述试剂盒是测定血清或血浆中的视黄醇结合蛋白的试剂盒。

2.根据权利要求1所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中，聚苯乙烯乳胶粒子的直径为45-92nm。

3.根据权利要求1所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中，聚合物为聚乙二醇6000-8000，葡聚糖，或聚氧乙烯类多聚物。

4.根据权利要求1所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述胶乳稀释液的成分为：pH值为7.4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠

10.2mmol/l，0.05％脱脂奶粉，0.9％NaN3。

5.根据权利要求4所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与聚苯乙烯乳胶粒子质量比1/20-5/10。

6.根据权利要求4所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的封闭液包括脱脂奶粉和甘氨酸。

7.根据权利要求1所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述胶乳稀释液包括，35-60mmol/l，pH值为7.2-7.6磷酸盐缓冲液；0.01％-0.1％脱脂奶粉，0.9％的NaN3。

说明书

基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒

[技术领域]

[0001] 本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒。[背景技术]

[0002] 视黄醇结合蛋白属于Lipocalin超家族，相对分子质量约21×103，配体主要是全反式视黄醇，即维生素A，Kd＝20Nm，结合位点1。RBP主要负责结合、转运血浆中的维生素A。外源性的维生素A进入血液循环系统后，首先与RBP结合，视黄醇-RBP复合体进一步与甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)形成三元复合物而被转运。

[0003] 肝脏是维生素A储存及RBP合成与分泌的主要场所。RBP的分泌严格受机体视黄醇含量的影响。有关RBP突变体和基因敲除小鼠的研究发现，血液中RBP的缺失，除了引起视觉功能障碍外，对机体其他方面功能没有明显影响，因此，RBP可能只是在膳食维生素A缺乏时为机体视黄醇的代谢稳定提供一种保障。

[0004] 与疾病的关系：RBP是一种可自由通过肾小球、重吸收率很高的小分子量蛋白，在健康人尿中含量很低。糖尿病肾病患者早期就出现肾小管损害，尿RBP是诊断早期糖尿病肾病的一个较敏感的指标；慢性肾功能衰竭(CRF)患者血中RBP大量积聚。

[0005] RBP由肝细胞合成，当肝细胞损伤时，RBP合成受抑制，故检测血液RBP水平，可敏感地反映肝功能的改变。放免法检测发现，肝硬化和急、慢性肝炎的血清RBP水平均明显低于正常对照组，急性病毒性肝炎早期血清RBP含量下降比晚期更明显RBP与机体的营养状态：RBP不仅参与视黄醇的运转，其分泌也严格受机体维生素A含量的影响，大量口服视黄醇可导致血液及肝脏RBP下降。维生素A的缺乏可改变血液中RBP含量并抑制肝脏分泌RBP，机体营养不良或应激反应时RBP可迅速下降。由于RBP的半衰期相对较短，变化早于前白蛋白(PA)、转铁蛋白(TRF)等且灵敏性更高，故可作为判断营养状态应激反应的指标诊断方法

[0006] 胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。

[0007] 视黄醇结合蛋白检测方法，由最初免疫电泳的定性检测，到放射免疫、荧光免疫和酶免疫的定量检测，以及到免疫比浊的自动化检测，发展十分迅速。目前，国内外免疫比浊法是最为普遍通用的方法。但是免疫比浊法原理基于抗体抗原免疫反应结合形成浊度，来检测血清中RBP的浓度。并没有采用检测信号方法技术，其最低检测限只能达到10mg/l。同时存在着开瓶稳定性不好、较易受溶血干扰等问题。在临床上只能用于肾功能的辅助诊断。
[发明内容]

[0008] 本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种高灵敏度、稳定性好、准确度高、抗干扰能力强的视黄醇结合蛋白检测试剂盒。

[0009] 为了实现上述目的，本发明设计了一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1，试剂R2以及校准品，其中：

[0010] 试剂R1为Tris-HCl缓冲体系，包括Tris-HCl缓冲液30-60mmol/l，PH值为7.2-7.6；聚合物60-95mmol/l；乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/l；

[0011] 试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液35-60mmol/l，PH值为7.2-7.6；

[0012] 参考校准品，包括牛血清基质；根据牛血清基质的体积用量百分比，还包括防腐剂0.2-2.2％；稳定剂1-10％。

[0013] 所述试剂R2中，聚苯乙烯乳胶粒子的直径为45-92nm。

[0014] 所述试剂R1中，聚合物为乙二醇6000-8000；或为聚乙二醇6000-8000，葡聚糖，聚氧乙烯类多聚物。

[0015] 所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子采用物理吸附法，具体步骤为：将羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳混合，将两者混匀后37℃吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液，封闭2小时，离心去上清，用胶乳稀释液稀释至1.2-2.5％。

[0016] 所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与聚苯乙烯乳胶粒子质量比1/20-5/10。

[0017] 所述的封闭液包括脱脂奶粉和甘氨酸。

[0018] 所述胶乳 稀释液 包括，35-60mmol/l，PH值为7.2-7.6磷 酸盐缓冲 液；0.01％-0.1％脱脂奶粉，0.9％的NaN3。

[0019] 本发明同现技术相比，采用聚苯乙烯胶乳包被视黄醇结合蛋白多克隆抗体，与待测标本(血清或血浆)中的视黄醇结合蛋白发生结合反应，形成免疫复合物，用光透射强度检测这种变化，以视黄醇结合蛋白标准品的校准曲线得出样本中目标检测物视黄醇结合蛋白的浓度。本发明采用纳米微球信号放大技术，使得试剂最低检测限检达到1mg/l，抗血红蛋白干扰达到了500mg/dl，开瓶稳定性达到了1个月。在临床上，不但能用于肾功能疾病的辅助诊断，同时也能用于营养不良的辅助诊断。具有很高的临床应用价值。[附图说明]

[0020] 图1为本发明试剂中5种不同含量的视黄醇结合蛋白参考标准的标准曲线。

[0021] 图2为普通免疫比浊法试剂中5种不同含量的视黄醇结合蛋白参考标准的标准曲线。

[0022] 图3为本发明试剂对照普通免疫比浊法试剂相关性曲线图。[具体实施方式]

[0023] 下面结合附图对本发明作进一步描述。

[0024] 实施例1：

[0025] 试剂R1：

[0026]

[0027] 将上述各种成分在室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。

[0028] 试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液35-60mmol/l，PH值为7.2-7.6；其制备方法如下：

[0029] 称取直径为45nm的聚苯乙烯胶乳粒子，在经过浓度为45mmol/l，PH值为7.4的Tris-Hcl缓冲液清洗后，与羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体以5∶10的质量比混合，将两者混匀后37℃吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体。

[0030] 加入封闭液，封闭2小时，封闭液的主要成分为0.1％脱脂奶粉和0.2mm的甘氨酸。

[0031] 离心去上清，用胶乳稀释液稀释至1.5％，胶乳稀释液的主要成分PH值为7.4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/l，0.05％脱脂奶粉，0.9％NaN3。

[0032] 参考校准品校准品制备：

[0033] 将经过处理的牛血清，加入BAS 0.1％，NaN30.9％得到校准品稀释液。用重组视黄醇结合蛋白溶于制备的类似人血清基质的溶液，制备不同浓度的标准品(0、5mg/l、15mg/l、30mg/l、60mg/l、120mg/l)

[0034] 本实施例描述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1，R2的用量分别为120ul和120ul，样本量3ul。120ul试剂R1加入3ul样本于37C5min后加入120ulR2，即开始读点，反应5min后读取另一点；检测波长分别主波长570nm副波长800nm。

[0035] 表1：

[0036]

[0037]

[0038] 采用本试剂及上述测定方法，对照普通免疫比浊法试剂，采用日立7170生化分析仪测得的5种不同含量的视黄醇结合蛋白标准品(自制)的曲线，如图1和2所示，每个点代表一个含量的参考标准品，其中X轴表示视黄醇结合蛋白含量(mg/L)；Y轴表示吸光度，具体参数参见表2和表3。

[0039] 表2：

[0040]

[0041] 表3：

[0042]

[0043] 实验一：检测试剂的相关性试验；

[0044] 使用本法发明试剂对照普通免疫比浊法试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述“视黄醇结合蛋白测定方法”中的参数进行测定，测定结果见图3，X，Y轴均为测定值(视黄醇结合蛋白的含量mg/L)。

[0045] 由图3的结果看出，两种试剂的相关系为R2＝0.9819，回归方程为y＝1.0758x。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

[0046] 此外，以上实验是采用日立公司的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。

[0047] 实验二：最低检测限试验；

[0048] 实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。

[0049] 采用实施例1中的试剂、对照试剂、参考校准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本，低值样本(数值在试剂线性范围下限±1/3内的样本)。

[0050] 机器：日立7170自动生化分析仪。

[0051] 操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。

[0052] 结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。

[0053] 表4结果显示，本发明试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值-2SD的数值均大于零点平均值+2SD，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到0.8mg/l。

[0054] 表4：

[0055]

[0056]

[0057] 而对照普通免疫比浊法试剂，如表5所示，测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比较血清平均值-2SD与零点平均值+2SD大小，其中1/16、1/8、1/4稀释平均值-2SD的数值小于零点平均值+2SD，1/2稀释平均值-2SD的数值大于零点平均值+2SD，表明普通免疫比浊法试剂最低检测限为12mg/l左右。

[0058] 表5：

[0059]

[0060] 实验三：灵敏度实验；

[0061] 本实验目的是检测试剂在测试生理盐水以及一定浓度的管理血清时的吸光度变化值。

[0062] 采用实施例1中的试剂，对照试剂、参考校准品、空白溶液、0.9％的生理食盐水，浓度的管理血清时的吸光度变化值。

[0063] 机器：日立7170自动生化分析仪。

[0064] 操作步骤：使用生理食盐水、低值样本，每个样本测试5次，计算吸光度。

[0065] 如表6显示，本发明试剂测定生理盐水时吸光度变化为-2.8(1/10000A)，理论浓度为0.35mg/l血清样本时吸光度变化为323.6(1/10000A)。

[0066] 表6：

[0067]

[0068] 而普通免疫比浊法试剂，参见表7，测定生理盐水时吸光度变化为-21.75(10000A)，理论浓度为0.35mg/l血清样本时吸光度变化为31.5(1/10000A)，表明本发明试剂灵敏度要显著高于普通免疫比浊法试剂。

[0069] 表7：

[0070]

[0071] 实验四：检测试剂抗干扰能力试验；

[0072] 本发明对检测试剂和对照试剂同时进行了抗干扰性试验，结果如下表8所示，加入干扰物后，对各种干扰物的相对误差均在10％以内。对照试剂对各种干扰物的相对误差都超过10％。

[0073] 表8：

[0074]