极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的保存、活化及快速扩繁方法

摘要

本发明涉及一种极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的保存、活化及扩繁方法，该方法是将剥离出复水后的野生齿肋赤藓鲜绿的叶片，接种至改良的Knop固体培养基上，再转接至新鲜改良的Knop固体培养基中生成大量单株克隆再生苗；将再生苗缓慢干燥后，置于超低温冰箱长期保存；保存的材料经缓慢复水后，再进行扩大培养获得大批量的纯系材料。本发明所述方法可从一个叶片或外植体在1-2个月内快速克隆出大批量的单克隆系，为齿肋赤藓作为抗旱研究的模式植物提供持续的纯系材料，同时为“沙漠地毯工程”提供方法依据。实现齿肋赤藓单克隆纯系材料的永续获得以及扩大。本发明所述方法简便、成本低、周期短、获得的单株克隆系发育程度一致。

权利要求

1.一种极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的培养、保存、活化及快速扩繁方法，其特征在于按下列步骤进行：齿肋赤藓的组织培养：

a、将野外采集的齿肋赤藓洗净后，剥离假根、茎和叶子，剥离出复水后的野生齿肋赤藓鲜绿的叶片，无菌水震荡洗涤5次，然后接种至改良的Knop固体培养基上，置于光照培养箱中培养，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，培养2-3周，产生大量的原丝体，其中改良的Knop固体培养基为0.25g／LKH2PO4、0.25g／L KCl和0.25g／L MgSO4·7H2O、1g／L Ca(NO3)2.4H2O和

0.0125g／LFeSO4·7H2O组成，pH值为6.5；

b、将步骤a中产生的原丝体继代至新鲜的改良的Knop固体培养基上继续培养7-10天，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，产生大量的齿肋赤藓单株克隆系再生苗，其中改良的Knop固体培养基为

0.25g／L KH2PO4、0.25g／L KCl和0.25g／L MgSO4·7H2O、1g／L Ca(NO3)2.4H2O和

0.0125g／L FeSO4·7H2O组成，pH值为6.5；

齿肋赤藓的保存：

c、将步骤b中产生的单株克隆系再生苗，经室温缓慢干燥24小时后装于灭菌的1.5mL EP管中，置于超低温冰箱长期保存；

齿肋赤藓单株克隆的活化：

d、取出超低温保存的齿肋赤藓单株克隆系，置于室温或冰上放置30min后，接种至改良的knop固体培养基中，置于光照培养箱中复苏1天，然后将完整植株切割剪碎或将完整的植株接种至改良的Knop固体培养基或将完整的植株在沙土基质中扩繁，其中改良的Knop固体培养基为0.25g／L KH2PO4、0.25g／L KCl和0.25g／L MgSO4·7H2O、1g／L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g／LFeSO4·7H2O组成，pH值为6.5；

齿肋赤藓单株克隆的快速扩繁：

e、将活化的单株克隆系的完整植株切割剪碎，用喷洒的方式接种再生苗的碎片，在改良的Knop固体培养基中培养10天就开始出现大量的原丝体和单株克隆小苗雏形；或将完整的植株接种至改良的Knop固体培养基上继代培养，每隔10-15天继代一次，培养温度为白天25℃，晚上15℃、光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，即可获得大量的单克隆株系；土培苗的扩繁培养：先将沙土用改良的Knop液体培养基浸湿，将活化后的完整的植株喷洒至沙土培养基中，室温培养，光照白天12h，晚上12h，湿度为

50％，光强为4000lx，即可获得大量的单克隆株系，其中改良的Knop固体培养基为0.25g／L KH2PO4、0.25g／L KCl和0.25g／LMgSO4·7H2O、1g／L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g／L FeSO4·7H2O组成，pH值为6.5。

说明书

极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的保存、活化及快速扩繁方

法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的保存、活化及快速扩繁方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 干旱化是面临的全球性的严峻问题。干旱不仅造成农业的重大损失，还加剧了生态环境的恶化及土地沙漠化和水土流失。解决此问题的直接办法是有效节水。植物是人类赖以生存的基础，怎样才能使植物抗旱节水？这就需要从耐旱植物为切入点，深入了解植物的耐旱机理及调控机制，从而改善植物的耐旱能力。随着基因工程和分子生物学技术的迅速发展与完善，抗旱基因资源的搜索和抗旱分子机制研究不断深入，取得了一定的进展。近年来，丛藓科植物由于杰出的抗逆性能以及特殊的水化-再水化过程而受关注，成为分子生物学研究领域(尤其是植物抗逆分子机制方面)巨大潜能的材料。

[0003] 苔藓是水生向陆生的一种过渡形式，是高等植物中最原始的类群，是一种结构简单的小型非维管植物。它能在高温、高寒、干旱和弱光等恶劣的自然环境条件下生长繁衍，并具有极强的生命力。并且，苔藓与高等陆生植物有很多相似特点，为基因功能的研究提供了良好的材料。早在上世纪70年代，科学家就以小立碗藓(Physcomitrella patens)为植物分子生物学研究材料进行了很多相关研究，取得了一定进展。时代不断前进中，在本世纪初(2000年)，苔藓专家Oliver提出耐旱山墙藓(Tortula ruralis)是研究逆境生物学的模式植物，并进行初步的基因组学分析。在本发明前期的研究中，包括齿肋赤藓的生理和生态方面的研究结果，以及和oliver课题组研究结果的比较中，我们得出齿肋赤藓作为分子生物学材料优于山墙藓。并且首次解决和完善了齿肋赤藓单株克隆纯系材料的培养、保存、活化及扩繁体系。可用于生理生化、抗逆分子生物学及环境修复方面的研究。

[0004] 齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)隶属于丛藓科(Pottiaceae)赤藓属(Syntrichia sp.)，分布于干旱半干旱的荒漠地区。我国首次发现于新疆古尔班通古特沙漠。它是荒漠苔藓中的主要成员之一，作为环境演替过程中主要的先锋植物，参与土壤生物结皮形成，在防风固沙中起重要作用。它还是一种变水植物，在极端干旱、贫瘠、强风沙的自然条件下，呈休眠状态，似一层灰黑色的“壳”覆盖在沙漠表面，形成有重要生态意义的苔藓生物结皮；一旦遇到降水，能迅速通过再水化过程而“复原”呈鲜活的绿色，并开始执行光合作用。由于这些特殊的生命现象而备受关注，使其有望成为抗逆分子生物学研究的模式植物。

[0005] 经对现有的技术的文献检索，中国专利申请号为200910054354.3提供一种细叶小羽藓配子体的快繁方法，利用羽状先端为材料，诱导的新生配子体经过切割剪碎扩繁。该专利可应用于大气重金属污染的治理方面；中国专利申请号为200810035554.x提供齿肋赤藓原丝体为材料，在沙土中扩大培养(共需要4个月)，该专利为沙漠生态恢复及环境绿化提供方法依据；然而，在本发明前期的实验中发现原丝体在沙土中扩大培养容易污染绿藻，从而影响齿肋赤藓的扩繁，与200810035554.x相比，本专利是用单株克隆在沙土上扩大，或者直接在培养基中扩大培养，节约培养时间(仅需1-2个个月)，且不容易被绿藻污染。专利申请号为201110084559.3的专利提供了原丝体的保存方法；然而，前期实验表明原丝体的活化不如外植体容易(推测是因为外植体已经具备齿肋赤藓的耐旱特性及复水现象)，因此，本专利在此基础上改进，保存材料为发育完整的单株克隆。以及中国专利申请号为201110116117.2的专利提供了齿肋赤藓单株克隆的培养基为BBM(pH＝8.0)；在本专利的实例中表明，改良的Knop培养基成分更简单，更经济，且更适合齿肋赤藓单株克隆的生长。进一步检索没有有关齿肋赤藓单株克隆系的保存、活化及快速扩繁方面的报道。然而，鉴于齿肋赤藓将成为模式植物，建立快捷高效的齿肋赤藓单株克隆系的保存及快繁显得尤为重要，因此，本发明重点在于提供一种经济、高效、快速的齿肋赤藓组织培养、保存、活化和快速扩繁方法，为齿肋赤藓遗传转化体系的建立奠定基础，同时为利用齿肋赤藓构建生物结皮进行荒漠化治理这一“沙漠地毯工程”提供技术支撑。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于，针对国内外有关齿肋赤藓培养和保存的技术现状，提供一种极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的保存、活化及快速扩繁方法，该方法是将剥离出复水后的野生齿肋赤藓鲜绿的叶片，接种至改良的Knop固体培养基上培养产生原丝体，再转接至新鲜改良的Knop固体培养基中可生成大量单株克隆再生苗；将再生苗缓慢干燥后，置于超低温冰箱长期保存；保存的材料经缓慢复水后，再进行扩大培养获得大批量的纯系材料。活化的齿肋赤藓单克隆株系具有比野生的外植体更强更快的分化能力。本发明所述方法可从一个叶片或外植体在1-2个月内快速克隆出大批量的单克隆系，为齿肋赤藓作为抗旱研究的模式植物提供持续的纯系材料，同时为“沙漠地毯工程”提供方法依据。为抗逆基因组学、正向、反向遗传学研究提供纯系材料，推进齿肋赤藓作为抗逆分子生物学研究模式材料的进程。实现齿肋赤藓单克隆纯系材料的永续获得以及扩大。本发明所述方法简便、成本低、周期短、获得的单株克隆系发育程度一致。

[0007] 本发明所述的一种极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的培养、保存、活化及快速扩繁方法，按下列步骤进行：

[0008] 齿肋赤藓的组织培养：

[0009] a、将野外采集的齿肋赤藓洗净后，剥离假根、茎和叶子，剥离出复水后的野生齿肋赤藓鲜绿的叶片，无菌水震荡洗涤5次，然后接种至改良的Knop固体培养基上，置于光照培养箱中培养，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，培养2-3周，产生的大量原丝体；

[0010] b、将步骤a中产生的原丝体继代至新鲜的Knop固体培养基上继续培养7-10天，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，产生大量的齿肋赤藓单株克隆再生苗；

[0011] 齿肋赤藓的保存：

[0012] c、将步骤b齿肋赤藓单株克隆再生苗，经室温缓慢干燥24小时后装于灭菌的1.5mLEP管中，置于超低温冰箱长期保存；

[0013] 齿肋赤藓单株克隆的活化：

[0014] d、取出超低温保存的齿肋赤藓单株克隆，置于室温或冰上放置30min后，接种至改良的knop固体培养基中，置于光照培养箱中复苏1天，然后将完整植株切割剪碎或将完整的植株接种至改良的Knop固体培养基或将完整的植株在沙土基质中扩繁；

[0015] 齿肋赤藓单株克隆的快速扩繁：

[0016] e、将完整植株切割剪碎活化的单株克隆系用喷洒的方式接种再生苗的碎片，在改良的Knop固体培养基中10天就开始出现大量的原丝体和单株克隆小苗雏形；或将完整的植株接种至改良的Knop固体培养基上继代培养，每隔10-15天继代一次，培养温度为白天25℃，晚上15℃、光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，即可获得大量的单克隆株系；土培苗的扩繁培养：先将沙土用改良的Knop液体培养基浸湿，将活化后的完整的植株喷洒至沙土培养基中，室温培养，光照白天12h，晚上12h，湿度为50％，光强为4000lx，即可获得大量的单克隆株系。

[0017] 所述方法中涉及的改良的Knop固体培养基为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O组成，pH值为6.5。

[0018] 本发明所述的一种极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的培养、保存、活化及快速扩繁方法，该方法经过了大量的筛选试验：

[0019] 齿肋赤藓培养基筛选

[0020] 野外采集的齿肋赤藓样品洗净后，剥离绿色叶片，用灭菌水震荡洗涤5次，分别接种60片叶子至BCD、ppNH4、BBM、BG11、Knop和改良的Knop培养基。各培养基配方见表1，置于光照培养箱中培养，培养条件：温度为白天25℃，晚上15℃、光周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，10天后统计原丝体发生率，原丝体的面积及密度见显微观察图1，结果表明改良的Knop培养基的原丝体发生率、面积及密度最高。

[0021] 表1 本发明所用的培养基成分表

[0022]

[0023] 注：MS为常用培养基，此处未列出。

[0024] 齿肋赤藓单株克隆的最适外植体：

[0025] 分别剥离洗净后的齿肋赤藓的假根、茎和叶，经灭菌水震荡消毒后接种至改良的Knop培养基上，置于光照培养箱中培养，培养条件温度为白天25℃，晚上15℃、光周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，15天后，观察原丝体发生情况(见图2)，结果表明：假根、茎和叶片都能产生原丝体，但叶片的原丝体发生率为95％左右，且在叶轴和叶缘及叶尖处都有可能产生原丝体；茎原丝体发生率为50％左右，假根原丝体发生率最低。因此，绿色叶片是齿肋赤藓再生体系建立的最好外植体。

[0026] 齿肋赤藓单株克隆的保存方法比较：

[0027] 采集在改良的Knop固体培养基或沙土上生长1-2个月的齿肋赤藓单株克隆(见图3)，经室温缓慢干燥24小时后装于灭菌的1.5mLEP管中，分别置于温度-80℃、-20℃和4℃冰箱及室温保存，保存2个月后分别测定这四种保存的单株克隆系的叶绿素含量(见图
4)。由图4、5可知，保存2个月的单株克隆系在四种保存方法对叶绿素含量的影响差异不显著，且都能在改良的Knop培养基上良好生长(图5d、e)。然而在前期实验中，破坏了完整植株的外植体(碎片)干燥后保存在低温或超低温冰箱中，室温保存易引起外植体黄化(图5e)。因此，齿肋赤藓单株克隆系保存方法最好为低温或超低温保存。

[0028] 齿肋赤藓单株克隆系的活化：

[0029] 取出保存的齿肋赤藓单株克隆系材料，置于室温或冰上放置30min后，加入灭菌水复苏材料(图5a、b、c为-80℃保存的材料，见图5a)，接种至改良的knop固体培养基中，置于光照培养箱中复苏1天(图5b)，可见再生苗经过超低温保存后，仍然具有生活力(图5)，然后直接或者碎片化此材料，接种至改良的Knop固体培养基或者沙土基质中扩大培养，图5c为固体培养基培养7天的照片，可见再生株能再次产生大量原丝体和再生植株。

[0030] 齿肋赤藓单株克隆系的扩大培养：

[0031] 活化的齿肋赤藓单株克隆系在Knop固体培养基上培养10天后，已长出大量的原丝体和再生苗(图6a)，继代至新鲜Knop培养基中，继续培养7-10天可生成大量的再生苗(图6b)，每隔10天继代一次，如此重复可获得大量单株克隆系无菌苗材料，土培扩大：将其切成碎片或完整植株转移至沙土基质中，碎片用喷洒的方式接种再生苗的碎片至沙土培养基中，碎片方式接种时，要谨防绿藻污染造成对齿肋赤藓植株生长的抑制作用，因此沙土应首先彻底灭菌，培养条件为室温培养，光照白天12h，晚上12h，湿度为50％，光强为4000lx，可获得大量土培的齿肋赤藓单株克隆。

[0032] 本发明所述的一种极端耐旱齿肋赤藓单株克隆系的培养、保存、活化及快速扩繁方法，该方法与现有技术相比其特点为：

[0033] 本发明提供的改良的knop培养基优于其它培养基，特别实用于齿肋赤藓的培养，其特点是营养成分仅为常用无机盐且组分少(经济实惠，操作简便)。

[0034] 本发明在原丝体继代中不但使原丝体尽量分化产生再生株，而且切割剪碎再生株是充分利用了苔藓无性繁殖特性，提高了单个外植体叶片的繁殖产量。

[0035] 本发明2个月内就可获得大量的齿肋赤藓单株克隆材料。可用于逆境胁迫处理的组学研究。同时能为沙漠地毯工程提供材料。

[0036] 本发明提供了齿肋赤藓保存、活化和扩繁方法。实现了齿肋赤藓单克隆纯系材料的永续获得以及扩大。为齿肋赤藓成为广泛应用的抗逆分子生物学研究模式材料提供保障。

附图说明

[0037] 图1为本发明在不同培养基上的生长图片，其中本发明中所用的改良Knop培养基，a为放大20倍的照片，b为放大40倍的照片。

[0038] 图2为本发明齿肋赤藓外植体不同部位发生原丝体的比较图，其中a为假根产生的原丝体，b为茎产生的原丝体，c为叶缘及叶柄产生的原丝体。

[0039] 图3为本发明齿肋赤藓单株克隆系图，其中a为改良的Knop固体培养基中继代培养，b为单株克隆株系放大10倍的照片，c为沙土扩大培养齿肋赤藓。

[0040] 图4为本发明不同保存方法下，齿肋赤藓单株克隆系的叶绿素含量比较图，其中RT为室温保存，4℃、-20℃和-80℃分别为齿肋赤藓单株克隆系的保存温度。

[0041] 图5为本发明齿肋赤藓单株克隆的活化图，其中a为超低温冰箱中取出的齿肋赤藓干样经复水后的照片；b为保存样在改良的Knop固体培养基中生长1天的状态；c为保存样在改良的Knop固体培养基中生长7天的状态；d、分别表示常温、4℃保存的齿肋赤藓单株克隆系活化后的培养照片；e分别表示-20℃和-80℃保存的齿肋赤藓单株克隆系活化后的培养照片；f表示齿肋赤藓单株克隆系的碎片室温保存1个月后黄化，在改良的Knop固体培养基中不能复活的照片。

[0042] 图6为本发明齿肋赤藓单株克隆系的生长状态图，其中a为活化后的齿肋赤藓单株克隆系培养10天的照片，b为活化后的齿肋赤藓单株克隆系培养20天的照片。

具体实施方式

[0043] 下面结合附图对本发明做详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明所保护的范围不限于下述实施例。

[0044] 实施例1

[0045] 齿肋赤藓的组织培养：

[0046] a、将野外采集的齿肋赤藓洗净后，剥离假根、茎和叶子，剥离出复水后的野生齿肋赤藓鲜绿的叶片，无菌水震荡洗涤5次，然后接种至改良的Knop固体培养基成分为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O组成，pH值为6.5，置于光照培养箱中培养，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上
10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，培养2-3周，产生的大量原丝体；

[0047] b、将步骤a中产生的原丝体继代至新鲜的改良的Knop固体培养基为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/LFeSO4·7H2O上，pH值为6.5，上继续培养7-10天，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，产生大量的齿肋赤藓单株克隆再生苗；

[0048] 齿肋赤藓的保存：

[0049] c、将步骤b齿肋赤藓单株克隆再生苗，经室温缓慢干燥24小时后装于灭菌的1.5mLEP管中，置于超低温冰箱长期保存；

[0050] 齿肋赤藓单株克隆的活化：

[0051] d、取出超低温保存的齿肋赤藓单株克隆，置于室温或冰上放置30min后，接种至改良的knop固体培养基为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O中，pH值为6.5，置于光照培养箱中复苏1天，然后将完整植株切割剪碎或将完整的植株接种至改良的Knop固体培养基或将完整的植株在沙土基质中扩繁；

[0052] 齿肋赤藓单株克隆的快速扩繁：

[0053] e、将完整植株切割剪碎活化的单株克隆系用喷洒的方式接种再生苗的碎片，在改良的Knop固体培养基为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/LCa(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O中，pH值为6.5，10天就开始出现大量的原丝体和单株克隆小苗雏形；

[0054] 或将完整的植株接种至改良的Knop固体培养基为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O上，pH值为6.5，继代培养，每隔10-15天继代一次，培养温度为白天25℃，晚上15℃、光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，即可获得大量的单克隆株系。

[0055] 实施例2

[0056] 齿肋赤藓的组织培养：

[0057] a、将野外采集的齿肋赤藓洗净后，剥离假根、茎和叶子，剥离出复水后的野生齿肋赤藓鲜绿的叶片，无菌水震荡洗涤5次，然后接种至改良的Knop固体培养基成分为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O组成，pH值为6.5，置于光照培养箱中培养，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上
10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，培养2-3周，产生的大量原丝体；

[0058] b、将步骤a中产生的原丝体继代至新鲜的改良的Knop固体培养基为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/LFeSO4·7H2O上，pH值为6.5，上继续培养7-10天，培养温度为白天25℃，晚上15℃，光照周期为白天14h，晚上10h，光照强度为4000lx，湿度为50％，产生大量的齿肋赤藓单株克隆再生苗；

[0059] 齿肋赤藓的保存：

[0060] c、将步骤b齿肋赤藓单株克隆再生苗，经室温缓慢干燥24小时后装于灭菌的1.5mLEP管中，置于超低温冰箱长期保存；

[0061] 齿肋赤藓单株克隆的活化：

[0062] d、取出超低温保存的齿肋赤藓单株克隆，置于室温或冰上放置30min后，接种至改良的knop固体培养基为0.25g/L KH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O中，pH值为6.5，置于光照培养箱中复苏1天，然后将完整植株切割剪碎或将完整的植株接种至改良的Knop固体培养基或将完整的植株在沙土基质中扩繁；

[0063] 齿肋赤藓单株克隆的快速扩繁：

[0064] e、土培苗的扩繁培养：先将沙土用改良的Knop液体培养基为0.25g/LKH2PO4、KCl和MgSO4·7H2O、1g/L Ca(NO3)2.4H2O和0.0125g/L FeSO4·7H2O浸湿，pH值为6.5，将活化后的完整的植株喷洒至沙土培养基中，室温培养，光照白天12h，晚上12h，湿度为50％，光强为4000lx，即可获得大量的单克隆株系。

[0065] 齿肋赤藓单株克隆活化后，其原丝体发生及幼苗产生时间比野外采集的齿肋赤藓外植体更早(整个周期少2周左右)，只是原丝体显得更细。这可能是因为单株克隆比野外样品的分化能力更强，但营养积累比野外的时间短而少。