一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法转让专利
申请号 : CN201210105195.7
文献号 : CN102628083B
文献日 : 2013-11-06
发明人 : 邹曙明 , 田玉梅 , 蒋霞云
申请人 : 上海海洋大学
摘要 :
本发明涉及一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法：通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；接下来分别进行第一轮PCR和第二轮PCR分别扩增转座子插入位点5'和3'侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数。本发明优点在于：具有简便、高效和低成本特点，可为利用Tgf2转座子介导的其他鱼类基因组插入诱变和转基因后代的拷贝数和侧翼序列的检测提供快速、准确的方法。
权利要求 :
1.一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：（1）通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；（2）再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；（3）酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；（4）接下来分别进行第一轮 PCR和第二轮 PCR分别扩增转座子插入位点5'和3'侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数，所述的检测出的Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列数即为插入的拷贝数；
所述的步骤（2）中限制性内切酶为Sau3A1，酶切好的DNA片段带有"GATC"粘性末端；
所述的步骤（3）中splinkerette接头包含长序列SEQ ID No:1和短序列SEQ ID No:2；
所述的splinkerette接头的合成步骤为：把所述的splinkerette接头长序列与短序列等浓度等体积混合，95℃保温5min，然后以1℃/15s逐步降至4℃，长序列与短序列退火形成splinkerette接头；
所述的splinkerette接头一侧带有段序列的"GATC"粘性末端，另一侧带有由于短序列中的AT碱基互补配对形成一个7bp的发卡结构而形成错配区；
所述的步骤（3）中酶切好的DNA片段与splinkerette接头均带有"GATC"粘性末端，通过T4连接酶连接，形成酶切DNA片段两端带有splinkerette接头的DNA片段；
所述的步骤（4）中进行转座子插入位点5'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为Splink1：SEQ ID No:5和Tgf2-5'GSP3: SEQ ID No:3；对第一轮PCR产物稀释50倍，并进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: SEQ ID No:6和Tgf2-5'GSP4：SEQ ID No:4，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数；
所述的步骤（4）中进行转座子插入位点3'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为：
Splink1: SEQ ID No:5和Tgf2-3'GSP1: SEQ ID No:7；对第一轮PCR产物稀释50倍，进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: SEQ ID No:6和Tgf2-3'GSP2: SEQ ID No:8，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组3'侧翼序列，并推测出插入拷贝数。
说明书 :
一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝
数的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及鱼类基因工程领域，具体地说，是一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法，及其在金鱼Tgf2转座子插入位点检测中的应用，适用于在金鱼和养殖鱼类Tgf2转座子介导的转基因或插入诱变后代中进行快速准确的开展基因组插入拷贝数和侧翼序列的鉴定。
背景技术
[0002] DNA转座子(transposon)是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位置的过程称为转座(transposition)。很多不同的转座子(如P因子和Mos1)介导的基因组插入诱变已被作为大规模遗传筛选的工具，不仅在单细胞生物如细菌和酵母中，而且在多细胞生物包括蠕虫、果蝇和拟南芥的研究中都被证明是成功的，它们为发现和解码这些生物的性状主控基因作出了巨大的贡献。近年来，我们在一些金鱼品系中发现了一个新的、具有天然转座活性hAT 家族转座子，为近年发现的第二例具有天然转座活性的脊椎动物转座子，根据国际转座子的命名标准，命名该转座子为Tgf2 转座子。Tgf2 转座子来源于鲤科鱼类，其在鲤科养殖鱼类中的转基因整合率约为50％，是第1代线性化质粒注射方法的10倍。与昆虫piggyBac转座子倾向插入TTAA和Tc1/mariner转座子家族偏好AT位点相比，鲤科 Tgf2转座子为随机插入，这为开辟鲤科养殖鱼类全基因组插入诱变研究奠定了物质基础。
[0003] 目前，进行转座子在生物基因组插入拷贝数和侧翼序列一般采用反向PCR (inverse PCR)方法。反向PCR在扩增前先用限制性内切酶酶切样品基因组DNA，再用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，然后通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段，并进行测序，从而获得插入拷贝数的侧翼序列和拷贝数。反向PCR方法存在一些缺点和不足，例如，1、酶切、自连过程受到很多不确定因素的影响，需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段，这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；2、为提高分子间连接的效率，连接反应中基因组DNA的浓度要低，因为高浓度的DNA可能会提高非同源连接水平，从而产生非特异扩增；3、成环的双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应，它只可以扩增出较短的DNA片段；4、鱼类转座子插入位点存在多拷贝，反向PCR引物可能与多个基因序列杂交，严重干扰转座子插入位点侧翼序列的鉴定。
[0004] 中国专利文献CN101962659A公开了一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体及其制备方法，由转基因供体质粒和辅助质粒组成，转基因供体质粒由鱼类启动子序列，如斑马鱼Krt8启动子、目的基因、以及金鱼Tgf2转座子左右臂序列构建，辅助质粒由斑马鱼β-actin启动子和金鱼Tgf2转座酶编码基因构建，为进行鱼类转基因研究提供了新方法。中国专利文献CN101962660A公开了一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法，通过注射转基因供体质粒，并辅以基于Tgf2转座酶mRNA两种载体，共同注射入鱼类1-2期细胞期受精卵，即可实现高效转基因，与常规鱼类转基因技术相比，具有整合效率高、负载容量大、通用、安全和高效的优点。但是关于一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法目前还未见报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法，所述的方法包括以下步骤：（1）通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；（2）再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；（3）酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；（4）接下来分别进行第一轮 PCR和第二轮 PCR分别扩增转座子插入位点5'和3'侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数，所述的检测出的Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列数即为插入的拷贝数。
[0007] 所述的步骤（1）中的金鱼基因组DNA带有Tgf2转座子插入位点，包括基因组本身带有Tgf2转座子的金鱼各品系，以及通过转座方式插入Tgf2转座子的其他鱼类。
[0008] 所述的步骤（2）中的限制性内切酶为Sau3A1，酶切好的DNA片段带有"GATC"粘性末端。
[0009] 所述的步骤（3）中的splinkerette接头包含长序列SEQ ID No:1和短序列SEQ ID No:2。
[0010] 所述的splinkerette接头的合成步骤为：把权利要求4所述的splinkerette接头长序列与短序列等浓度等体积混合，95℃保温5min，然后以1℃/15s逐步降至4℃，长序列与短序列退火形成splinkerette接头。
[0011] 所述的splinkerette接头一侧带有段序列的"GATC"粘性末端，另一侧带有由于短序列中的AT碱基互补配对形成一个7bp的发卡结构而形成错配区。
[0012] 所述的步骤（3）中酶切好的DNA片段与splinkerette接头均带有"GATC"粘性末端，通过T4连接酶连接，形成酶切DNA片段两端带有splinkerette接头的DNA片段。
[0013] 所述的步骤（4）中进行转座子插入位点5'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为Splink1：SEQ ID No:5和Tgf2-5'GSP3: SEQ ID No:3；对第一轮PCR产物稀释50倍，并进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: SEQ ID No:6和Tgf2-5'GSP4：SEQ ID No:4，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数。
[0014] 所述的步骤（4）中进行转座子插入位点3'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为：Splink1: SEQ ID No:5和Tgf2-3'GSP1: SEQ ID No:7；对第一轮PCR产物稀释50倍，进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: SEQ ID No:6和Tgf2-3'GSP2: SEQ ID No:8，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组3'侧翼序列，并推测出插入拷贝数。
[0015] 本发明优点在于：
[0016] 1、可在金鱼基因组Tgf2转座子插入后代中，进行快速准确的开展基因组插入拷贝数和侧翼序列的鉴定；
[0017] 2、本发明与现有技术相比，具有简便、高效和低成本特点，可为利用Tgf2转座子介导的其他鱼类基因组插入诱变和转基因后代的拷贝数和侧翼序列的检测提供快速、准确的方法。
附图说明
[0018] 附图1是金鱼基因组提取琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0019] 附图2是合成的带有"GATC"粘性末端和一个7-bp发卡结构的splinkerette接头图谱。
[0020] 附图3是金鱼基因组DNA用限制性内切酶Sau3A1酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0021] 附图4是Splinkerette PCR法扩增Tgf2转座子5'侧翼序列的琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0022] 附图5是Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5'端的序列比对结果。
[0023] 附图6是Splinkerette PCR法扩增Tgf2转座子3'侧翼序列的琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0024] 附图7是Tgf2转座子在金鱼基因组插入区3'端的序列比对结果。
[0025] 附图8是Tgf2转座子插入金鱼基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0026] 附图9是Tgf2转座子插入金鱼基因组的序列比对结果。
[0027] 附图10是Tgf2转座子插入金鱼基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0028] 附图11是Tgf2转座子插入金鱼基因组的序列比对结果。
具体实施方式
[0029] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0030] 本发明的目的是建立一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法，克服反向PCR在内切酶的选择、酶切、自连、形成超螺旋、非特异扩增等问题，以及难以检测出金鱼等鱼类基因组转座子多拷贝插入位点等。本发明由于接头的引物是与中间错配区的一条链的序列完全一致，因此，能避免接头到接头间的非特异性扩增，具有操作简单、检测效率高和具有检测出多拷贝插入位点的特点。本发明适用于Tgf2转座子介导的金鱼或其他鱼类基因组插入诱变和转基因研究分析。
[0031] 本发明的一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入拷贝数和侧翼序列的方法，包括以下步骤：通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；接下来分别进行第一轮 PCR和第二轮 PCR分别扩增转座子插入位点5'和3'侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数。
[0032] 需要说明的是，所述的金鱼基因组DNA带有Tgf2转座子插入位点，包括基因组本身带有Tgf2转座子的金鱼各品系，以及通过转座方式插入Tgf2转座子的其他鱼类。
[0033] 所述的对全基因组DNA进行酶切的限制性内切酶为Sau3A1，酶切好的DNA片段带有"GATC"粘性末端。
[0034] 所 述 的 splinkerette 接 头 包 含 长 序 列 (5'-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGA GAGACCGTGGCTGAATGA GACTG GTGTCGACACTAGTGG-3')（SEQ ID No:1）和短序列(5'-GATCCCACTAGTGTCGACACCAGTCTCTAATTTTTTTTT TCAAAAAAA- 3')（SEQ ID No:2）。所述 的splinkerette接头的合成步骤为：把权利要求4所述的splinkerette接头长序列与短序列等浓度等体积混合，95℃保温5min，然后以1℃/15s逐步降至4℃，长序列与短序列退火形成splinkerette接头。合成的splinkerette接头一侧带有段序列的"GATC"粘性末端，另一侧带有由于短序列中的AT碱基互补配对形成一个7bp的发卡结构而形成错配区。
[0035] 所述的酶切好的DNA片段与splinkerette接头均带有"GATC"粘性末端，通过T4连接酶连接，形成酶切DNA片段两端带有splinkerette接头的DNA片段。
[0036] 所述的进行转座子插入位点5'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为：Splink1:5'-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGAGAGACC-3'（SEQ ID No:5）和Tgf2-5'GSP3: 5'-TAAGTACTTTTTGACTGTAAATAAAATTGTAAGGAGT -3'（SEQ ID No:3）；对第一轮PCR产物稀释50倍，并进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: 5'- GTGGCTGAA TGAGACTGGTGTCGAC-3'（SEQ ID No:6）和Tgf2-5'GSP4: 5'-AAGTATTGA TTTTTAATTGTACTCAAGTAA AGT-3'（SEQ ID No:4），对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数。
[0037] 所述的进行转座子插入位点3'侧翼序列扩增的第一轮 PCR，所用引物为：Splink1:5'-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGAGAGACC-3'（SEQ ID No:5） 和 Tgf2-3'GSP1:5'-AGACTAATACACCTCTTCCCGCATCG-3'（SEQ ID No:7）；对第一轮PCR产物稀释50倍，进行第二轮 PCR，所用的引物为：Splink2: 5'- GTGGCTGAATGAGACTGGTGTCGAC-3'（SEQ ID No:6）和Tgf2-3'GSP2: 5'-GGCTTGACACTAACAATTT TGAGAATC-3'（SEQ ID No:8），对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组3'侧翼序列，并推测出插入拷贝数。
[0038] 由于Tgf2转座子在基因组插入位点的两侧均带有8-bp重复标识，根据带有相同的8-bp重复标识的两侧序列设计引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，从而鉴定出Tgf2转座子在金鱼基因组侧翼序列。
[0039] 这种由通过在基因组转座子Tgf2插入位点两侧引入特异性splinkerette接头的反向PCR方法，由于接头的引物与中间错配区的一条链的序列完全一致，因此，能避免接头到接头间的非特异性扩增。克服传统反向PCR在内切酶的选择、酶切、自连、形成超螺旋、非特异扩增等问题，以及难以检测出基因组鱼类转座子多拷贝插入位点等。因此，本发明具有操作简单、检测效率高和具有检测出金鱼Tgf2转座子多拷贝插入位点的特征。
[0040] 实施例1 带Tgf2转座子插入的鱼类基因组DNA的提取
[0041] 由于金鱼基因组中存在Tgf2转座子的插入，取95%酒精保存或活金鱼尾鳍约100-200mg，剪碎，55℃烘干5-6min； 加入410μL的STE裂解液（pH=8.10），80μL的SDS（10%，pH=8.14）和10μL的蛋白酶K（20μg/ml）；翻转摇匀，56℃水浴保温14-15个小时；加入340μL到400μL的饱和氯化钠溶液混匀，轻摇3min；加入340μL到400μL的氯仿，摇匀；4℃ 12000rpm离心20min ，将上清液移入另一干净的离心管中；加入450μL到500μL的异丙醇（-20℃），12000rpm离心20min（4℃）；倒去上清液，留沉淀，加入800μL的75%乙醇洗涤；12000rpm离心5min到15min（4℃）；到去乙醇，烘干沉淀，加入100μL到200μL的双蒸水，再加2μL的RNase。取1μl 金鱼基因组DNA，0.8%凝胶电泳检测基因组DNA的质量（图1），其余于4 ℃冰箱保存备用。
[0042] 需要说明的是，所述的带Tgf2转座子插入的鱼类转基因方法详见中国专利申请201010223188.8 一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法。
[0043] 实施例2 Splinkerette接头的合成
[0044] 委托上海生工公司合成splinkerette接头所需的一条寡核苷酸长序列（SEQ ID No:1）和一条寡核苷酸短序列（SEQ ID No:2）；分别把寡核苷酸长序列和短序列用无菌双蒸水溶解为50μm/μl，分别取50μl寡核苷酸长序列和短序列等体积混合，95℃保温5min，然后在PCR仪上以1℃/15s逐步降至4℃，长序列与短序列在退火过程中就可形成splinkerette接头，-20℃保存。合成的splinkerette接头一侧带有限制性内切酶Sau3A1的"GATC"粘性末端，另一侧带有由短序列中的AT碱基互补配对形成一个7-bp的发卡结构而形成错配区（图2）。
[0045] 实施例3 金鱼基因组DNA的酶切及连接splinkerette接头
[0046] 取实施例1中提取的包含Tgf2转座子的金鱼基因组DNA，用限制性内切酶Sau3A1进行37℃水浴酶切12h，酶切反应在30μl体系中进行，包含10μl Genomic DNA (2.5μg)，3μl 10×Sau3A1 Restriction buffer，4μl Sau3A1 enzyme (10U/μl)，0.3μl Acetylated BSA (10mg/ml)，12.7μl ddH2O。酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测酶切的效果（图3）。将酶切完全的金鱼基因组Sau3A1酶切DNA产物在65℃水浴20min，以终止限制性内切酶活性，于-20℃保存备用。将Sau3A1酶切DNA产物4.5μl与splinkerette接头1μl用4μl T4 DNA连接酶（Takara公司，5U/μl）在40μl反应体系中连接12 h，之后65℃水浴20min，并用大量DNA纯化试剂盒（天根）过柱纯化。
[0047] 实施例4 Splinkerette PCR法扩增Tgf2 转座子5'侧翼序列
[0048] 根据Tgf2转座子序列设计引物Tgf2 5'-GSP3（SEQ ID No:3）和Tgf2 5'-GSP4（SEQ ID No:4），进行2轮PCR扩增。第一轮扩增以实施例3纯化的带有splinkerette接+头的基因组酶切片段5 μl为模板，加入5 μl 10 ×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl splink 1（SEQ ID No:5），1μl Tgf2-5’GSP3（SEQ ID No:3），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃ 15s，65℃
30s，72℃ 3min，28个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增以第一轮PCR产物稀释50倍为+
模板，加入5 μl 10 ×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl splink 2（SEQ ID No:6），1μl Tgf2-5’GSP4（SEQ ID No:4），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃15s，57℃ 30s，72℃ 3min，30个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测（图4）。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收亮带，将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5'端的结果如图5所示，共检测出6种Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数为6个。
30s，72℃ 3min，28个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增以第一轮PCR产物稀释50倍为+
模板，加入5 μl 10 ×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl splink 2（SEQ ID No:6），1μl Tgf2-5’GSP4（SEQ ID No:4），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃15s，57℃ 30s，72℃ 3min，30个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测（图4）。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收亮带，将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5'端的结果如图5所示，共检测出6种Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数为6个。
[0049] 实施例5 Splinkerette PCR法扩增Tgf2转座子3'侧翼序列
[0050] 根据Tgf2转座子序列设计引物Tgf2 5'-GSP1（SEQ ID No:7）和Tgf2 5'-GSP2（SEQ ID No:8），进行2轮PCR扩增。第一轮扩增以实施例3纯化的带有splinkerette接+头的基因组酶切片段5 μl为模板，加入5 μl 10 ×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl Splink 1（SEQ ID No:5），1μl Tgf2-3’GSP1（SEQ ID No:7），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃ 15s，68℃
30s，72℃ 3min，28个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增以第一轮PCR产物稀释50倍为+
模板，加入5 μl 10 ×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl Splink 1（SEQ ID No:6），1μl Tgf2-3’GSP2（SEQ ID No:8），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃15s，61℃ 30s，72℃ 3min，30个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测（图6）。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收目的片段，将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5'端的结果如图7所示，共检测出6种Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数为6个。
30s，72℃ 3min，28个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增以第一轮PCR产物稀释50倍为+
模板，加入5 μl 10 ×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl Splink 1（SEQ ID No:6），1μl Tgf2-3’GSP2（SEQ ID No:8），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃15s，61℃ 30s，72℃ 3min，30个循环；72℃ 延长10min。第二轮扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测（图6）。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收目的片段，将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5'端的结果如图7所示，共检测出6种Tgf2转座子在金鱼基因组5'侧翼序列，并推测出插入拷贝数为6个。
[0051] 实施例6 Tgf2转座子插入金鱼基因组的鉴定1
[0052] 选取实施例4、5中均检测到的Tgf2转座子插入侧翼序列（Tgf2末端8碱基CTTGTTAC相同）设计引物Tgf2-f1（SEQ ID No:9）和Tgf2-r1（SEQ ID No:10），以实施例1中提取的金鱼基因组为模板，进行PCR扩增。反应体系为：1μl Genomic DNA，5 μl 10 +
×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl Tgf2-f1（SEQ ID No:9），1μl Tgf2-r1（SEQ ID No:10），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：
94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 5min，28个循环；72℃ 延长10min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收5.1kb和0.4kb目的片段（图8），将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，5.1kb长片段序列中保留有4.7kb完整的金鱼Tgf2转座子。0.4kb短片段为金鱼Tgf2转座子自主剪切后留下的序列，其中，序列-1为Tgf2转座子完全剪切或野生型基因序列，序列-2为Tgf2转座子不完全剪切后多出部分8-bp正向重复“TAC”序列，序列-3为Tgf2转座子不完全剪切后多出部分Tgf2转座子（CAGACCTCTG）序列（图9）。上述结果证明了实施例4、5获得的金鱼基因组Tgf2转座子插入侧翼序列的正确性。
×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl Tgf2-f1（SEQ ID No:9），1μl Tgf2-r1（SEQ ID No:10），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：
94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 5min，28个循环；72℃ 延长10min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收5.1kb和0.4kb目的片段（图8），将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，5.1kb长片段序列中保留有4.7kb完整的金鱼Tgf2转座子。0.4kb短片段为金鱼Tgf2转座子自主剪切后留下的序列，其中，序列-1为Tgf2转座子完全剪切或野生型基因序列，序列-2为Tgf2转座子不完全剪切后多出部分8-bp正向重复“TAC”序列，序列-3为Tgf2转座子不完全剪切后多出部分Tgf2转座子（CAGACCTCTG）序列（图9）。上述结果证明了实施例4、5获得的金鱼基因组Tgf2转座子插入侧翼序列的正确性。
[0053] 实施例7 Tgf2转座子插入金鱼基因组的鉴定2
[0054] 选取实施例4、5中均检测到的Tgf2转座子插入侧翼序列（Tgf2末端8碱基GTTGTGTC相同）设计引物Tgf2-f2（SEQ ID No:11）和Tgf2-r2（SEQ ID No:12），以实施例1中提取的金鱼基因组为模板，进行PCR扩增。反应体系为：1μl Genomic DNA，5 μl +10 ×LA buffer (Mg2 plus)，5μl dNTP mixture 2.5mM，1μl Tgf2-f2（SEQ ID No:11），
1μl Tgf2-r2（SEQ ID No:12），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 5min，28个循环；72℃ 延长10min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测（图10）。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收目的片段，将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，5.2kb长片段序列中保留有4.7kb的完整金鱼Tgf2转座子，0.5kb短片段序列为金鱼Tgf2转座子自主完全剪切或野生型基因序列（图11）。上述结果进一步证明了实施例4、5获得的金鱼基因组Tgf2转座子插入侧翼序列的正确性。
1μl Tgf2-r2（SEQ ID No:12），0.5 μl LA Taq酶，32.5 μl ddH2O，总体积50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 5min，28个循环；72℃ 延长10min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳检测（图10）。经1.2%琼脂糖凝胶分离后，割胶回收目的片段，将回收产物分别连接至pMD-19T载体（TaKaRa）中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 µg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200µl菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用Bioedit软件进行序列分析，5.2kb长片段序列中保留有4.7kb的完整金鱼Tgf2转座子，0.5kb短片段序列为金鱼Tgf2转座子自主完全剪切或野生型基因序列（图11）。上述结果进一步证明了实施例4、5获得的金鱼基因组Tgf2转座子插入侧翼序列的正确性。
[0055] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。