一株铁还原菌及应用

摘要

本发明公开了一株Fontibacter ferrireducens sp.nov.CCTCC NO:M2011498及其在铁还原中的应用。本发明菌株SgZ-2，其具有较强的厌氧铁还原能力，在环境修复方面具有潜在的应用价值。

权利要求

1.铁还原菌Fontibacter ferrireducens SgZ-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2011498。

2.权利要求1所述铁还原Fontibacter ferrireducens菌SgZ-2在土壤原位修复中的应用。

说明书

一株铁还原菌及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株新菌种及其在环境工程中的应用，具体涉及一株铁还原Fontibacterferrireducenssp. nov.菌新种，及其在铁还原中的应用。

背景技术

[0002] 石油、农药的大量使用以及城市垃圾中的有害物质大量渗入土壤，土壤的有机污染已经成为巨大的环境问题。我国的人口多，土地资源有限，随着城市化的进展，土壤有机污染的问题尤为突出。

[0003] 土壤污染的修复有两种，一种为异位修复，即将污染土壤转移至他处填埋或处理，避免其危害人类安全。这种方法不可避免地会破坏土壤的结构，且很难用于深层污染土壤的修复，操作成本高，已经逐渐被弃用。另一种为原位修复，是在污染源就地处理污染物的一种生物处理技术。20世纪90年代，美国在10年间花费上千亿美元以鼓励新兴的原位土壤修复技术，其中土壤气相抽取（soil vapor extraction）、生物通风（bio-venting）和空气喷射（air sparging）因其效率高、成本低，设计灵活和操作简单等特点而得到迅速发展，是应用最广的原位土壤修复方法。但是，这种通气法依然无法有效修复难以通气的污染土壤，如深层土壤和水浸土壤。

[0004] 铁在地壳中平均含量约为5.6%，主要以三价铁氧化物的形式存在。在厌氧土壤中，如水浸土壤和深层土壤中，三价铁为丰度最高的电子受体。腐殖质是富含醌基的、非均相的天然有机混合物，是土壤有机质的主体，约占土壤有机碳的60～80%。据统计，在某些淹水土壤和淡水沉积物中，微生物的Fe（Ⅲ）呼吸（还原）/腐殖质呼吸直接导致了80%以上的有机物碳化降解，远高于其他厌氧呼吸的总和。因此，厌氧条件下，如微生物可同时利用腐殖质和三价铁作为电子受体，可以更好地将有机污染物矿化，更为有效实现原位土壤修复。

[0005] Fontibacter 属属于鞘脂杆菌科（Cyclobacteriaceae），最初由Kampfer等人于2010年设立。在其论文（Fontibacter flavus gen. nov., sp. nov., a member of the family ‘Cyclobacteriaceae’, isolated from a hot spring， Peter Kämpfer et al. IJSEM September 2010 vol. 60 no. 9 2066-2070）发表时，该属下仅有一个种Fontibacter flavus。至今，未发现具有铁还原能力的Fontibacter 菌株。

发明内容

[0006] 本 发 明 的 目 的 在 于 提 供 一 株 具 有 铁 还 原 能 力 的 新 菌 种：Fontibacterferrireducenssp. nov. SgZ-2。

[0007] 本发明的另一个目的在于提供上述菌株在土壤原位修复中的应用。

[0008] 申请人于2011年10月28日将菌株提交位于湖北武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，中国典型培养物保藏中心于2011年12月31日收到申请人提供的菌株Fontibacterferrireducenssp. nov. SgZ-2，保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC M2011498，建议的分类命名为Fontibacterferrireducens SgZ-2，已于2012年1月10日鉴定保藏的菌株是存活的。

[0009] 本发明的菌株Fontibacterferrireducenssp. nov. SgZ-2，在厌氧条件下可利用腐殖质和三价铁为电子受体，加速有机物的降解，因此可以有效地原位去除土壤中的有机污染物，低成本的实现土壤的原位修复，同时不会破坏土壤的结构，有利于土地资源的利用，在环境修复方面具有广泛的应用前景。

[0010] 附图说明：

[0011] 图1：本发明菌株的5000×透射电镜照片；

[0012] 图2：本发明菌株的3000×透射电镜照片；

[0013] 图3：本发明菌株的16S rRNA基因系统发育树；

[0014] 图4-7：本发明菌株使用不同电子供体还原不同Fe（III）的实验结果图。

具体实施方式

[0015] 菌株SgZ-2的富集和分离

[0016] 从持续运行3个月的污泥微生物燃料电池中，撕取阳极生物膜浸泡于20 mL灭菌的矿物盐培养基中，矿物盐培养基（MSM）的组成是：0.6 g NaH2PO4、0.25 g NH4Cl、 0.1 g KCl、0.2 g酵母提取物、10.0ml维生素溶液、10.0ml微量元素溶液，并添加有0.5 mM 的AQDS和5 mM的葡萄糖分别作为电子受体和电子供体，pH调节至7.2，其中，维生素溶液是每升去离子水中含2.0 mg生物素、2.0 mg叶酸、VB6 10.0 mg维生素、5.0 mg硫胺素、5.0 mg核黄素、5.0 mg烟酸、5.0 mg泛酸钙、0.1 mg维生素B12、5.0 mg对氨基苯甲酸、5.0 mg硫辛酸；微量元素溶液是每升去离子水中含1.5 g氨三乙酸、3.0 g MgSO4·7H2O、0.5 g MnSO4·H2O、
1.0 g NaCl、0.1 g FeSO4·7H2O、0.1 g CoCl2·6H2O、0.1 g CaCl2、0.1 g ZnSO4·7H2O、0.01 g CuSO4·5H2O、0.01 g AlK(SO4)2·12H2O、0.01 g H3BO3、0.01 g Na2MoO4·2H2O；

[0017] 往已接种的富集培养基中充混合气（N2/CO2=80/20）15分钟，鼓气完毕盖橡胶盖加铝盖密封，置于厌氧工作站，30℃静置培养，观察培养液的颜色变化情况；

[0018] 5d后，培养液颜色从无色变为橙黄色时，将培养液涂布至MSM琼脂（20g 琼脂、1 mM AQDS和 5 mM 葡萄糖）上，30℃厌氧工作站厌氧（N2/CO2=80/20）培养；

[0019] 筛选平板上呈红色的为可进行AQDS还原的菌落，使用TSA或TSB培养基进行分离，得到菌株SgZ-2。

[0020] 菌株SgZ-2的形态特征

[0021] 1）菌体形态特性

[0022] 菌株SgZ-2为革兰氏阴性菌，不产芽孢，；透射电子显微镜结果（图1和2）显示菌株无鞭毛，棒状，宽约0.2-0.4 μm，长约1.5-3.0μm。

[0023] ）菌落形态特性

[0024] 菌落为橙色，凸起，边缘呈圆形，直径约2-4 mm。

[0025] 菌株SgZ-2的生理生化特征

[0026] 根据《伯杰细菌鉴定鉴定手册》第九版所述的标准程序测试菌株的生理生化特征，以及利用API ID32GN、20E、ZYM实验条检测其他的理化性质并与Fontibacter flavus CCM T7650 进行比较，菌株SgZ-2为非发酵型兼性厌氧菌，结果见下表：

[0027]

[0028] 菌株SgZ-2生长的最佳NaCl含量为1%，生长温度为15～37℃（最佳生长温度为25～30℃），最佳生长pH 7.0。在营养琼脂上生长良好，在MacConkey琼脂上不生长。

[0029] 菌株SgZ-2可利用葡萄糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖发酵产酸，但是不能利用甘露醇、肌醇、鼠李糖、苦杏仁苷和阿拉伯糖发酵产酸；可以利用葡萄糖、水杨苷、蜜二糖、海藻糖、山梨醇、蔗糖和麦芽糖作为单一碳源，不可以利用甘露醇、阿拉伯糖、丙酸、癸酸、戊酸、柠檬酸（盐）、组氨酸、2-酮葡萄糖酸盐、3-羟丁酸、水杨酸、脯氨酸、鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、核糖、肌醇、衣康酸、辛二酸、乙酸盐、乳酸盐、丙氨酸、5-酮基-葡萄糖酸盐、水杨酸、糖原或丝氨酸作为单一碳源。

[0030] 菌株SgZ-2的化学分类学特征

[0031] 为确定发明菌株的分类地位，测定了菌株SgZ-2细胞的脂肪酸含量，并与TFontibacter flavus CCM 7650 进行比较，结果如表2所示。

[0032]*

[0033] Summed feature 3 包括 C16:1ω6c 和/或 C16:1ω7c; Summed feature 8 包括17:1 iso I/anteiso B 、17:1 anteiso B/iso I三种组分的一种或几种;Summed feature
9包括 17:1 isoω9c和/或16:0 10-甲基。

[0034] 菌株SgZ-2的分子分类地位

[0035] 提取发明菌株的总DNA；以提取的DNA为模板，扩增细菌的16S rRNA基因，得到几乎完整（1429bp）的16S rRNA序列，将PCR扩增产物回收纯化后进行测序，所得序列在GenBank中的基因登录号为JQ348962。

[0036] 通过EzTaxon server 2.1网站的在线比对工具进行比对，16S rRNA基因序列分析结果显示，菌株SgZ-2与Fontibacter 属内唯一成员Fontibacter flavus CCM7650的16S rRNA基因序列相似性最高，为99.4%，而与其他属内菌株的相似性均小于94%。

[0037] 使用Neighbor-joining方法构建的系统发育树如图3所示。在Neighbor-joiningT方法构建的系统发育树中，菌株SgZ-2与Fontibacter flavus CCM 7650 处于不同的亚枝。
T

[0038] 为进一步确定SgZ-2与Fontibacter flavus CCM 7650 之间的分类学关系，按Ezaki et al. (1989)描述的方法对其进行DNA-DNA杂交。结果显示菌株SgZ-2与TFontibacter flavus CCM 7650 的DNA-DNA相关性很低（正交35.7%，反交40%），远低于同种的鉴定标准70%，表明菌株SgZ-2是一个新的菌种。

[0039] 综合上述的形态学特征、生理生化特性及系统发育分析，本发明菌株应归于Fontibacter 属，且界定为新种，将其命名为Fontibacter ferrireducens sp. nov.。

[0040] 菌株SgZ-2在不同电子供体下对不同Fe（Ⅲ）的还原作用

[0041] 1) 采用液体培养基配方：每升去离子水中0.25g NH4Cl、0.678g NaH2PO4·2H2O、0.1g KCl、2.94g NaHCO3、1.59g Na2CO3，维生素溶液和微量元素溶液各10.0 mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同分离培养基)；灭菌后，体系中添加10 mM的葡萄糖作为电子供体，并分别添加25 mM的四种铁氧化物（水铁矿、针铁矿、纤铁矿和赤铁矿）作为电子受体；

[0042] 2) 从保存菌株SgZ-1的斜面挑取菌苔接种至TSB培养基中，于30℃，180 rpm摇床活化菌体18小时，使细菌数量达到指数生长期；

[0043] 3) 4℃，6000 rpm离心10 min，去上清液，碳酸缓冲液重新悬浮，重复上述操作2次，最终悬浮液的浓度达到OD600约1.2；

[0044] 4) 加入1 ml 菌体悬浮液作为处理，同时分别设置使用未添加菌株SgZ-2的培养基和添加菌株SgZ-2但未添加葡萄糖的培养基作为对照，相同条件下培养；

[0045] 5) 每隔5天取混合均匀的4 ml培养液于16ml 0.5mol/l HCl溶液中180转/分振荡1.5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(II)显色，采用紫外分光光度计在510 nm处测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的铁还原能力。

[0046] 试验结果如图4～7所示，菌株SgZ-2可以利用葡萄糖为电子供体还原铁氧化物，其中，对水铁矿的还原效率最高，其次依次是纤铁矿、针铁矿和赤铁矿。