DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法

摘要

DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法，已知一段核酸序列的待检样本中的至少一个单碱基的各种可能变化的确定是通过一个杂交到固定的样本核酸序列上的至少一个碱基延伸的组合检测来确定的。本发明的最大优点是实现了分析的序列片段中至少一个碱基变化的同时检测。由于序列是已知的，在没有4个核苷酸全部加入到延伸反应体系的情况下，引物会延伸到与没有加入的核苷酸互补的核苷酸单体前终止。基于这个原理，按照不同序列检测的具体情况，可以设计不同的延伸方法，将荧光标记过的核苷酸单体延伸到序列需要检测的碱基位置，从而获得待检测信息。

权利要求

1.一种DNA芯片组合延伸检测多单样Kras基因12、13密码子突变的方法，其特征在于步骤为：(1)将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板；

(2)用一对PCR引物分别将所有样本中待检测的包含Kras基因12、13密码子的序列进行PCR扩增，其中上游引物：5’-CGTCTGCAGTCAACTGGAATT ；下游引物：5’-NH2-TTTTTTTTT CCTGACATACTCCCAAGGAAA；

(3)将 PCR产物用异丙醇沉淀，并用乙醇洗涤2次后干燥除去乙醇；

(4)用pH=9碳酸缓冲液溶解所有样本PCR产物，充分溶解的PCR产物用于点样制作三张相同的DNA芯片，点样时记录样本在DNA芯片上的位置编码，同一DNA芯片上每个样本DNA芯片上只有一个阵点，或有多个重复；

(5)各加入2μM的延伸引物5’-TTTGAACACCATCAACCTCGA分别与三张芯片杂交；

(6)在第一张DNA芯片上加入1μM Cy5-dTTP和1μM Cy3-dGTP的延伸反应液，进行延伸反应；延伸反应完成后，再加入1μM Cy5-dATP的延伸反应液进行延伸反应；在第二张DNA芯片上加入含有2μM dCTP的延伸反应液，延伸反应完成后，洗去未参与延伸反应的dCTP，然后加入含有0.1μM/1μM 的dGTP /Cy3-dGTP和0.1μM/1μM 的dATP/Cy5-dATP的延伸反应液，进行延伸反应；在第三张DNA芯片上加入含有2μM dCTP和2μM dATP的延伸反应液，延伸反应完成后，洗去未参与延伸反应的dCTP和dATP，然后加入含有0.1μM/1μM 的dTTP /Cy5-dTTP和0.1μM/1μM 的dGTP/Cy3-dGTP的延伸反应液，进行延伸反应；

(7)反应结束后，洗去未参与延伸反应的标记物，然后扫描，并记录三张DNA芯片上每个位置Cy5和Cy3荧光的信号强度；根据第一、第二和第三张芯片扫描的结果，确定DNA芯片上每个阵点样本的DNA序列，实现所有样本Kras基因12、13密码子序列的检测：阵点在第一、第二张芯片扫描无明显的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy5信号，则序列为GAT GGC；

阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5和Cy3信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则序列为GCT GGC；

阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，且Cy5信号的强度是Cy3信号强度的2倍，则序列为GTT GGC；

阵点在第一芯片、第三张芯片扫描具有Cy5信号，第二张芯片扫描无明显荧光信号，则序列为AGT GGC；

阵点在第一、第二张、第三张芯片扫描均具有Cy3信号，则序列为CGT GGC；

阵点在第一、第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则序列为TGT GGC；

阵点在第一张芯片扫描无明显的荧光信号，第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3的信号，则序列为GGT GGC。

说明书

DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种低成本单碱基核酸序列变化DNA芯片检测方法，尤其涉及一种多样本、多位点的准确性高，成本低，通量高的核酸序列单碱基变化检测方法。

背景技术

[0002] 随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在诸多基因变异中，SNP是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志。SNP既与单基因遗传病相关，也可能与多基因遗传病相关。目前已经确定4000多种遗传疾病是由单碱基突变引起的，而一些重大疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病、抑郁症、哮喘等，是受众多基因以及环境因子共同作用，通过对于某一特定疾病的基因组样本中大量突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。SNP分析，除对疾病预防、用药选择、新药研发、疾病预后等诸多个体化医药学领域具有十分关键的影响，还对制药业、乃至整个生物学的广泛领域和最基本的遗传与变异等重大课题，具有极大的促进作用。人类基因组单体型图计划(HapMap Project)的实施启动了在整个基因组范围内寻找SNP位点的计划。国际上十大制药巨头公司和Wellcome Trust联合组成了SNP协作组，我国南方基因组中心和北方(华大)基因中心均在开展各民族SNP基因位点的筛查工作。我国国家高技术研究发展计划(“十一五”863计划)生物和医药技术领域第二批重大项目申请指南中提供了上亿资金实施“重大疾病的分子分型和个体化诊疗”重大项目，将以肿瘤(肺癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、白血病)、心血管疾病(动脉粥样硬化)、老年神经变性病(老年性痴呆、帕金森病)、精神系统疾病(抑郁症和精神分裂症)、糖尿病和慢性肝病等作为研究对象，建立重大疾病临床标本库和资料库以及临床试验网络，研究开发出针对上述疾病的易感人群筛选、临床前期发现、早期病人诊断及指导个体化治疗相关的特异性分子标记物，建立各种疾病的分子分型标准。这些公用数据的不断结累和丰富，无疑将会建立起疾病和基因间的紧密关系。在这种状况下，就某种疾病而言，需要检测的SNP位点可能从百万级的数量下降至数千个或数百个不等。当可以从数千个甚至数百个SNP位点不需要在从数十亿个碱基序列得到特定研究目的必要信息时，其巨大的科学与经济价值已不言而喻。因此，生物科技紧接着面临如何快速、可靠地对已知SNP位点进行检测的问题，因此，这将标记着巨大的商业机会蕴涵在其中，并成为为众多商家看好的潜在的巨大市场。

[0003] 与为数有限的蛋白质测序和DNA序列分析方法相比，基因突变(包括SNP)分析的基本方法在数量上已达20余种。种类繁多的分析方法，既反映了研究基因突变(包括SNP)分析方法在生物学和医学领域所受到的重视程度，也反映出任一单个方法尚无法满足后基因时代对基因突变(包括SNP)分析的要求。目前基于PCR产物微阵列芯片的检测方法，主要包括双荧光标记的特异性探针杂交(Ji，et al.Mutation Research-fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，2004，548(1-2)，97-105)、双荧光标记的探针连接(Tang，et al.Human mutation，2009，30(10)：1460-1468)、以及单碱基延伸(Shan，al.Clinica Chimica Acta，2009，(1-2)，11-17)这三类方法来实现基因型的高通量检测的。然而，这三类方法都只针对检测序列中一个位置的一种碱基(如碱基A)变化成另外一种碱基(如碱基T)的形式。在这种情况下，所有的样本只有三类模板：即纯合子A、纯合子T和杂合子A/T。而当检测序列的变化一个位置的一种碱基(如碱基A)变化成其它三个碱基(如个G、C、T)，或者二个碱基，其所有的样本的模板就大大增加，比如人类KRAS基因12、13密码子上的突变则与结直肠癌患者的个体化用药相关，但因其有7种突变(G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D)，就没有办法采用上述这三类微阵列芯片方法来实现对样本的有效检测。高通量DNA测序技术是近年来发展起来的高技术之一，通过一次合成反应实现对合成核苷酸类型或者数目的有效判读实现未知DNA序列的测定。在高通量合成测序方法中，一种是通过限制加入核苷酸的种类，即是简单地每次只加一种核苷酸的方法，要么通过检测反应实时释放出可识别的分子(焦磷酸测序技术、离子半导体测序技术、荧光焦磷酸测序技术等)，或者识别掺入合成链中的标记分子确定碱基个数；另一种是通过3’端羟基可逆封闭核苷酸单体(Illumina公司测序技术等)，或者采用虚拟可逆终止核苷酸单体(Helicos BioSciences公司测序技术等)一次将四种核苷酸加入测序反应，但只发生合成一个核苷酸的方法来实现碱基种类的确定。而当多个自由3端羟基的核苷酸进行合成测序时，即使用不同标记物标记不同的核苷酸种类，也无法知道那种核苷酸发生合成反应在前，那种核苷酸发生合成反应在后，而无法判断具体的序列。而当测定序列为只有可能的几种方式之一的情况下，采用多个自由3端羟基的核苷酸进行合成时，是可以确定具体的序列的。

发明内容

[0004] 技术问题：本发明提出一种多核苷组合延伸的、单碱基核酸序列变化DNA芯片检测方法，将样本一段已知核酸序列中的单碱基的各种可能变化的确定是通过杂交到固定的样本核酸序列上的至少一个碱基延伸的组合检测来确定。

[0005] 技术方案：一种DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法，已知一段核酸序列的待检样本中的至少一个单碱基的各种可能变化的确定是通过一个杂交到固定的样本核酸序列上的至少一个碱基延伸的组合检测来确定的，具体步骤为：

[0006] 步骤1)扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行平行扩增；

[0007] 步骤2)DNA芯片及微阵列的制备：将不同待检样本的扩增产物经过浓缩后点样于能与上述PCR引物5’端修饰活性基团结合、经过修饰的玻璃片上，使不同待检样本的PCR产物的一条单链固定在玻璃片上，构建得到包含所有待检样本的一组DNA芯片或者一张芯片上的一组DNA微阵列；

[0008] 步骤3)检测：根据检测位点所包含的可能信息，在不同的DNA芯片或者一张芯片的几个DNA微阵列进行延伸检测；a)在DNA芯片经过变性、并杂交测序引物后，进行包含荧光标记的核苷酸延伸，并记录所有样本该次延伸的结果；b)在DNA芯片经过变性、并杂交测序引物后，先用非标记的核苷酸延伸到需要检测的碱基位置，然后进行包含荧光标记的核苷酸延伸，并记录所有样本该次延伸的结果；c)根据需要，变换不同的非标记、标记的核苷酸延伸方式，按照步骤b)的方式实施检测；最后，将所有检测中不同样本的信息集合，从而实现多样本中一个或者多个单碱基的各种可能变化的检测。

[0009] 所述荧光单体为不同荧光染料标记不同的dNTP单体或者ddNTP。

[0010] 所述PCR引物5’端修饰的活性基团是在热条件下稳定的氨基、生物素或丙烯酰胺，所述玻璃片的修饰基团分别为醛基、羧基、亲和素或丙烯。

[0011] 一种DNA芯片组合延伸检测多单样Kras基因12、13密码子突变的方法，步骤为：

[0012] 将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板；

[0013] 用一对PCR引物分别将所有样本中待检测的包含Kras基因12、13密码子的序列进行PCR扩增，其中上游引物：5’-CGTCTGCAGTCAACTGGAATT；下游引物：5’-NH2-TTTTTTTTTCCTGACATACTCCCAAGGAAA；

[0014] 将PCR产物用异丙醇沉淀，并用乙醇洗涤2次后干燥除去乙醇；

[0015] 用pH＝9碳酸缓冲液溶解所有样本PCR产物，充分溶解的PCR产物用于点样制作三张相同的DNA芯片，点样时记录样本在DNA芯片上的位置编码，同一DNA芯片上每个样本DNA芯片上只有一个阵点，或有多个重复；

[0016] 各加入2uM的延伸引物5’-TTTGAACACCATCAACCTCGA分别与三张芯片杂交；

[0017] 在第一张DNA芯片上加入1uM Cy5-dTTP和1uM Cy3-dGTP的延伸反应液，进行延伸反应；延伸反应完成后，再加入1uM Cy5-dATP的延伸反应液进行延伸反应；在第二张DNA芯片上加入含有2uM dCTP的延伸反应液，延伸反应完成后，洗去未参与延伸反应的dCTP，然后加入含有0.1uM/1uM的dGTP/Cy3-dGTP和0.1uM/1uM的dATP/Cy5-dATP的延伸反应液，进行延伸反应；在第三张DNA芯片上加入含有2uM dCTP和2uM dATP的延伸反应液，延伸反应完成后，洗去未参与延伸反应的dCTP和dATP，然后加入含有0.1uM/1uM的dTTP/Cy5-dTTP和0.1uM/1uM的dGTP/Cy3-dGTP的延伸反应液，进行延伸反应；

[0018] 反应结束后，洗去未参与延伸反应的标记物，然后扫描，并记录三张DNA芯片上每个位置Cy5和Cy3荧光的信号强度；根据第一、第二和第三张芯片扫描的结果，确定DNA芯片上每个阵点样本的DNA序列，实现所有样本Kras基因12、13密码子序列的检测：

[0019] 阵点在第一、第二张芯片扫描无明显的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy5信号，则序列为GAT GGC；

[0020] 阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5和Cy3信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则序列为GCT GGC；

[0021] 阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，且Cy5信号的强度大约是Cy3信号强度的2倍，则序列为GTT GGC；

[0022] 阵点在第一芯片、第三张芯片扫描具有Cy5信号荧光信号，第二张芯片扫描无明显荧光信号，则序列为AGT GGC；

[0023] 阵点在第一、第二张、第三张芯片扫描均具有Cy3信号，则序列为CGT GGC；

[0024] 阵点在第一、第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则序列为TGT GGC；

[0025] 阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy5的信号，第三张芯片扫描具有Cy5信号，则序列为GGT GAC；

[0026] 阵点在第一张芯片扫描无明显的荧光信号，第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3的信号，则序列为GGT GGC。

[0027] 有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：

[0028] 1.本发明的最大优点是实现了分析的序列片段中至少一个碱基变化的同时检测。由于序列是已知的，在没有4个核苷酸全部加入到延伸反应体系的情况下，引物会延伸到与没有加入的核苷酸互补的核苷酸单体前终止。基于这个原理，按照不同序列检测的具体情况，可以设计不同的延伸方法，将荧光标记过的核苷酸单体延伸到序列需要检测的碱基位置，从而获得待检测信息。

[0029] 2.本发明在保持现有基于DNA芯片的检测方法的准确性、灵敏度的前提下，能够快速、简单地实现不同样本的高通量检测。每个样本经PCR扩增后，扩增产物固定于DNA芯片上，并记录样本位置具体的信息。。这样相同的DNA芯片经过相同的延伸引物的几个多碱基延伸检测后，根据每次延伸检测信息的组合来判断每个样本中碱基变化的具体信息。而现有的基于DNA芯片的检测方法则很难实现一个碱基各种可能的变化形式以及多个碱基各种可能的变化形式(尤其是涉及对多个位置碱基的这种变化形式)的有效检测。

附图说明

[0030] 图1是本发明以拟订序列AGCA突变为(GGCA、CGCA、TGCA、ACCA、AACA、ATCA)的7种可能为序列的多碱基延伸DNA芯片检测基因方法的示意图。图1(a)和(b)为不同样本的PCR产物构成的包含7种可能序列的二张相同的DNA芯片。图中1为PCR产物的模板，2为芯片载体，3为测序引物(测序引物后面的碱基为延伸反应后合成上去的碱基)，*代表Cy5标记，”代表Cy3标记。

[0031] 图2是本发明以检测Kras基因12、13密码子(GGT GGC)常见的7种突变(GAT GGC、GCT GGC、GTT GGC、AGT GGC、CGT GGC、TGT GGC、GGT、GAC)的多碱基延伸DNA芯片检测基因方法的示意图。图2(a1)表示第一张芯片加入Cy5-dTTP和Cy3-dCTP的结果示意图。图2(a2)表示第一张芯片加入Cy5-dATP的结果示意图。图2(b1)表示第二张芯片加先入dCTP反应结束后再加入Cy5-dATP和Cy3-dGTP的结果示意图。图2(b2)表示第三张芯片加先入dCTP和dATP反应结束后再加入Cy5-dTTP和Cy3-dGTP的结果示意图。图中1为PCR产物的模板，2为芯片载体，3为测序引物(测序引物后面的碱基为延伸反应后合成上去的碱基)，*代表Cy5标记，”代表Cy3标记。

[0032] 图3是本发明用组合延伸检测碱基连续突变的方法检测Kras基因12、13密码子(GGT GGC)常见的7种突变(GAT GGC、GCT GGC、GTT GGC、AGT GGC、CGT GGC、TGT GGC、GGT GAC)中8个典型样本在DNA芯片上的排布及其延伸扫描图。(1)样本在芯片上的排布(2)第一张芯片Cy3扫描图(3)第一张芯片Cy5扫描图(4)第二张芯片Cy3扫描图(5)第二张芯片Cy5扫描图(6)第三张芯片Cy3扫描图(7)第三张芯片Cy5扫描图其中，第一张芯片c点Cy5和Cy3扫描无明显荧光信号，第二张芯片Cy5扫描图的c点的亮度大约是第三张芯片Cy3扫描图c点亮度的2倍，可以说明，第二张芯片c点的上模板连上了两个Cy5-dTTP。同时，第一张芯片c点Cy5和Cy3扫描无明显荧光信号，第二张芯片Cy5扫描图的h点的亮度和第三张芯片Cy3扫描图h点的亮度差不多。由此可见，第二张芯片的h点上的模板连上了一个Cy5-dTTP。由此，可以区分连上两个Cy5-dTTP的模板是含有GTT GGC的序列，为
3号模板，连上一个GTT GGC的h点是8号模板。其他模板的区分可以按照实施例2所讲的方法。

具体实施方式

[0033] 以下将结合附图对本发明作进一步说明。

[0034] 实施例1

[0035] 结合图1说明，将所有待检测的样本提取DNA并进行PCR扩增后，其PCR产物1通过5’端修饰基团固定在芯片载体2上(如果PCR引物修饰了氨基，则用表面修饰醛基的玻璃载片固定；如果PCR引物修饰了生物素，则用表面修饰亲合素的玻璃载片固定)，构建DNA芯片，记录不同样本在DNA芯片上的点样位置，同一DNA芯片上可以只有一个微阵列，也可以有多个微阵列。微阵列中每个模板可以只点一个点，也可以点多个点。当PCR产物固定在玻片上后，对其进行变性。变性过后，将测序引物杂交到单链的模板上。当测序引物与模板杂交后，进行多碱基延伸的序列分析：

[0036] 在第一张DNA芯片的微阵列上加入含有dTTP/Cy5-dTTP(＝0.1uM/1uM)和dCTP/Cy3-dCTP(＝0.1uM/1uM)的延伸反应液，在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应，反应条件：50℃反应10分钟。反应结束后，用2×SSC+10％SDS和0.2×SSC+1％SDS洗液洗去未参与延伸反应的Cy5-dTTP和Cy3-dCTP标记物，再用氮气吹干，然后用扫描仪(如北京博奥生物芯片有限责任公司的Luxscan-10K/A等)扫描，并记录DNA芯片上每个位置Cy5和Cy3荧光的信号强度。

[0037] 在第二张DNA芯片的微阵列上加入含有dTTP(2uM)的延伸反应液，在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应，反应条件：50℃反应10分钟，延伸反应结束后，用1×TEMP，1％BSA，0.1MDTT清洗缓冲液洗净片子、吹干，然后加入0.025U/μL的Apyrase，室温反应5分钟降解未参与延伸反应的dTTP，用1×TEMP，1％BSA，0.1M DTT清洗缓冲液洗涤，然后加入含有dATP/Cy5-dATP(＝0.1uM/1uM)和dGTP/Cy3-dGTP(＝0.1uM/1uM)的延伸反应液，反应结束后，用2×SSC+10％SDS和0.2×SSC+1％SDS洗液洗去未参与延伸反应的Cy5-dATP和Cy3-dGTP标记物，再用氮气吹干，然后扫描，并记录DNA芯片上每个位置Cy5和Cy3荧光的信号强度。

[0038] 根据第一和第二张芯片扫描的结果，确定DNA芯片上每个阵点(样本)的DNA序列(参见表1)：

[0039] 如果阵点在第一张芯片扫描结果同时具有Cy5和Cy3信号，第二张芯片扫描无明显的荧光信号，则属于编号为1的序列(AGCA)；

[0040] 如果阵点在第一张芯片扫描结果为Cy3，第二张芯片扫描无明显的荧光信号，则属于编号为2的序列(GGCA)；

[0041] 如果阵点在第一张芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描结果为Cy3，则属于编号为3的序列(CGCA)；

[0042] 如果阵点在第一张芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描结果为Cy5，则属于编号为4的序列(TGCA)；

[0043] 如果阵点在第一张芯片扫描结果为Cy5，第二张芯片扫描结果为Cy3，且第二张芯片上Cy3的强度大致为第一张芯片上Cy5的强度的2倍，则属于编号为5的序列(ACCA)；

[0044] 如果阵点在第一张芯片扫描结果为Cy5，第二张芯片扫描结果为Cy3，且第一张芯片上Cy5的强度大致为第二张芯片上Cy3的强度的2倍，则属于编号为6的序列(AACA)；

[0045] 如果阵点在第一张芯片扫描结果为Cy5，第二张芯片扫描同时具有Cy5和Cy3信号，则属于编号为7的序列(ATCA)。

[0046] 表1：拟订序列AGCA突变为NNCA的组合多碱基延伸检测结果

[0047]序列编号 检测序列 第1张芯片结果 第2张芯片结果
1 AGCA Cy5+Cy3 -
2 GGCA Cy3+Cy3 -
3 CGCA - Cy3
4 TGCA - Cy5
5 ACCA Cy5 Cy3+Cy3
6 AACA Cy5+Cy5 Cy3
7 ATCA Cy5 Cy3+Cy5

[0048] 注：下划线标注的碱基是待检测的突变碱基

[0049] 实施例2

[0050] 结合图2和图3说明，将所有待检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板，并通过引物(上游引物：5’-CGTCTGCAGTCAACTGGAATT；下游引物：5’-NH2-TTTTTTTTTCCTGACATACTCCCAAGGAAA)分别将所有样本中待检测的包含Kras基因12、13密码子的序列进行PCR扩增，扩增后的PCR产物5’端就连接上了氨基，方便连接到修饰过醛基的玻片上，将PCR产物用异丙醇沉淀，并用乙醇洗涤2次后干燥除去乙醇。本例中所用玻片的修饰基团是羧基。将所用模板用碳酸缓冲液(pH 9.0)稀释到终浓度为20μM，点样制作三张相同的DNA芯片，每张DNA芯片包含一个微阵列。每个阵列中含有8个模板，编号是a～h，这8个模板包含了Kras基因常见的7种突变和一种非突变的模板，经过对这些模板的检测，可以确定模板属于哪种突变。点样后8个模板样本在玻片上的分布如图3-1所示。各加入2uM的延伸引物5’-TTTGAACACCATCAACCTCGA分别与三张芯片杂交。

[0051] 在第一张DNA芯片的微阵列上加入含有1uM Cy5-dTTP和1uM Cy3-dGTP的延伸反应液，在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应(图2-a1)，反应条件：50℃反应10分钟。延伸反应结束后，用2×SSC+10％SDS和0.2×SSC+1％SDS洗液洗去未参与延伸反应的Cy5-dTTP和Cy3-dGTP标记物，用氮气吹干。然后扫描芯片，并记录DNA芯片上每个位置Cy5和Cy3荧光的信号强度。扫描完成后，继续加入1uM Cy5-dATP的延伸反应液，在聚合酶的作用下进行延伸反应(图2-a2)，反应条件：50℃反应10分钟。反应结束后，用2×SSC+10％SDS和0.2×SSC+1％SDS洗液洗去未参与延伸反应的标记物Cy5-dATP，然后扫描(北京博奥生物芯片有限责任公司的Luxscan-10K/A)，并记录DNA芯片上每个位置Cy5和Cy3荧光的信号强度(图3-2，图3-3)。

[0052] 在第二张DNA芯片的微阵列上加入含有dCTP(2uM)的延伸反应液，在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应，反应条件为：50℃反应10分钟。延伸反应结束后，用2×SSC+10％SDS和0.2×SSC+10％SDS洗净片子，吹干。在微阵列的相应区域加入0.025U/μL的Apyrase，室温反应5分钟降解未参与延伸反应的dCTP，并用1×TEMP，1％BSA，0.1M DTT清洗缓冲液洗涤，然后加入含有dGTP/Cy3-dGTP(＝0.1uM/1uM)和dATP/Cy5-dATP(＝0.1uM/1uM)的延伸反应液(图2-b1)，在50℃反应10分钟，反应结束后，用2×SSC+10％SDS和0.2×SSC+1％SDS洗液洗去未参与延伸反应的标记物Cy3-dGTP和Cy5-dATP，用氮气吹干。然后扫描芯片，并记录DNA芯片上每个点的Cy5和Cy3荧光的信号强度(图3-4，图
3-5)。

[0053] 在第三张DNA芯片的微阵列上加入含有dCTP(2uM)和dATP(2uM)的延伸反应液，在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应，反应条件为：50℃反应10分钟，延伸反应结束后，用用1×TEMP，1％BSA，0.1MDTT清洗缓冲液洗净片子，吹干，然后加入0.025U/μL的Apyrase，室温反应5分钟降解未参与延伸反应的的dCTP和dATP，并用1×TEMP，1％BSA，0.1M DTT清洗缓冲液洗涤，然后加入含有dTTP/Cy5-dTTP(＝0.1uM/1uM)和dGTP/Cy3-dGTP(＝0.1uM/1uM)的延伸反应液，50℃反应10分钟(图2-b1)，反应结束后，用2×SSC+10％SDS和0.2×SSC+1％SDS洗液洗去未参与延伸反应的标记物Cy5-dTTP和Cy3-dGTP，用氮气吹干。然后扫描芯片，并记录DNA芯片上每个点Cy5和Cy3荧光的信号强度(图3-6，图3-7)。

[0054] 根据第一、第二和第三张芯片扫描的结果，确定DNA芯片上每个阵点(样本)的DNA序列(参见表2)：

[0055] 如果阵点在第一、第二张芯片扫描无明显的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy5信号，则属于编号为1的序列(GAT GGC)；

[0056] 如果阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5和Cy3信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则属于编号为2的序列(GCT GGC)；

[0057] 如果阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，且Cy5信号的强度大约是Cy3信号强度的2倍，则属于编号为3的序列(GTT GGC)；

[0058] 如果阵点在第一芯片、第三张芯片扫描具有Cy5信号荧光信号，第二张芯片扫描无明显荧光信号，则属于编号为4的序列(AGT GGC)；

[0059] 如果阵点在第一、第二张、第三张芯片扫描均具有Cy3信号，则属于编号为5的序列(CGT GGC)；

[0060] 如果阵点在第一、第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则属于编号为6的序列(TGT GGC)；

[0061] 如果阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy5的信号，第三张芯片扫描具有Cy5信号，则属于编号为7的序列(GGT GAC)；

[0062] 如果阵点在第一张芯片扫描无明显的荧光信号，第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3的信号，则属于编号为8的序列(GGT GGC)。

[0063] 表2：Kras基因12、13密码子突变的组合多碱基延伸检测结果

[0064]序列编号 检测序列 第1张芯片结果 第2张芯片结果 第3张芯片结果
1 GAT GGC - - Cy5
2 GCT GGC - Cy5+Cy3 Cy3
3 GTT GGC - Cy5+Cy5 Cy3
4 AGT GGC Cy5 - Cy5
5 CGT GGC Cy3 Cy3 Cy3
6 TGT GGC Cy5 Cy5 Cy3
7 GGT GAC - Cy5 Cy5
8 GGT GGC - Cy5 Cy3

[0065] 注：下划线标注的碱基是待检测的突变碱基