柑橘溃疡病的PCR检测方法

摘要

一种柑橘溃疡病的PCR检测方法，是以柑橘溃疡病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B )的核苷酸序列设计的。本检测方法所使用的这对引物有别于其它检测方法，可以用于快速检测出柑橘溃疡病。

权利要求

1.一种柑橘溃疡病的PCR检测方法，其特征在于：该方法是以柑橘溃疡病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为：正向引物：5’- CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT -3’ 反向引物：5’- GGTTGACCGTGGTTTCCCATA -3’；

上述特异性引物的设计是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因的核苷酸序列，PCR产物大小为750bp。

说明书

柑橘溃疡病的PCR检测方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种柑橘溃疡病的检测方法，尤指一种检测柑橘溃疡病(Xanthomonas axonopodis pv.citri)的PCR(聚合酶链式反应)方法。背景技术：

[0002] 柑橘溃疡病(Cirtus Bacterial Canker Disease，CBCD)是一种在部分柑橘栽培地区严重发生的由地毯草黄单胞柑橘致病变种[Xanthomonas axonopodis pv.citrri(Hasse)Dye]所引起的检疫性细菌病害。在自然条件下，该病菌可随风雨传播、扩散，主要侵染途径为气孔、皮孔或伤口，可侵染植物的叶片、叶茎、枝条以及果实，导致植物体的衰弱和枯死，严重的情况下能造成植株大量落叶、落果，甚至全株死亡；染病果实即使未脱落，也会在其表皮形成开裂、结疤状溃疡斑，大大降低果实的外观、品相，对其销售和出口造成不良影响。且该病菌传播能力强，一旦在新区发生，则需要大量的人力物力进行防治，造成很大的经济损失。

[0003] 目前，该病菌已经被列为我国进境和国内检疫性有害生物。美国、巴西、阿根廷、土耳其、伊朗、西班牙、意大利等全球30多个许多国家和地区，都将其列为检疫性有害生物，对柑橘溃疡病菌实施检疫，并禁止其出口和输入。

[0004] 商业化生产中，柑橘溃疡病近距离和中距离传播的主要途径是风雨、虫害产生的伤口和植株之间的相互摩擦。此外，在果园管理维护中的嫁接、修剪、喷灌等人为活动也有利于柑橘溃疡病在植株间的传播。其远距离传播则主要通过种苗、接穗、砧木的运输交易来实现，含细菌的包装物、集装箱、园艺工具也有一定的传播可能。因此，建立快速、高效的柑橘溃疡病菌检测技术，是防治柑橘溃疡病的重要基础。目前，通过PCR技术检测柑橘溃疡病，主要是利用王中康等人根据柑橘溃疡病菌全基因组中独有的保守蛋白基因序列而筛选到特异 引物(YF5：5’-TTC GGC GTC AAC AAC CTG-3’；JYR5：5’-AAC TCC AGC ACA TAC GGG TC-3’)。王中康等人建立的柑橘溃疡病菌检测方法虽然具有较高的灵敏度，但有时会扩增到3条大小不同的片段，影响了该引物的适用性。发明内容：

[0005] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种能准确鉴定柑橘溃疡病的PCR检测方法。该方法所使用的一对引物是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列，本检测方法所使用的这对引物有别于其它检测技术。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种柑橘溃疡病的PCR检测方法，该方法是以柑橘溃疡病菌的特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。该特异性引物为：

[0007] 正向引物(XCG1F)：5’-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3’(如SEQID No：1所示)， [0008] 反向引物(XCG2R)：5’-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3’(如SEQID No：2所示)。 [0009] 上述特异性引物的设计是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列，PCR产物大小为750bp。

[0010] 对本发明方法详细叙述如下：

[0011] 一、引物设计：

[0012] 本发明人利用原核生物进化过程中核酸序列的保守性，从NCBI搜索并下载柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri strain ICMP 10022)的促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列(序列号为EU499045)，运用Premier软件得到一些候选引物，最后通过筛选，设计出一对引物：

[0013] 引物1(XCG1F)：5’-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3’

[0014] 引物2(XCG2R)：5’-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3’。

[0015] 将引物1和引物2分别经BLAST检索，见下表1及表2，结果表明，与引物1和引物2的序列100％覆盖且100％相同的全部是柑橘溃疡病菌的核苷酸序列。

[0016] 表1柑橘溃疡病菌引物1(XCG1F)的BLAST结果

[0017]

[0018] 表2柑橘溃疡病菌引物2(XCG2R)的BLAST结果

[0019]

[0020] 由此，设计出一对特异性引物：

[0021] 正向引物(XCG1F)：5’-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3’

[0022] 反向引物(XCG2R)：5’-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3’。

[0023] 上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，预期PCR产物为750个碱基。 [0024] 二、PCR过程：

[0025] 用上述引物对对柑橘溃疡病菌进行PCR检测，PCR反应体系为20μl，具体见下表3：

[0026] 表3PCR反应体系各主要成分及用量

[0027]

[0028] 反应条件：95℃预变性4min，然后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，在此条件下进行32个循环，最后72℃再延伸7min。

[0029] 将冷却至50-60℃的1.0％琼脂糖胶液倒入制胶板内，待胶完全凝固后拨出梳子，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

[0030] 取反应产物3μl与Loading Buffer和SYBR Green核酸凝胶染液按3∶6∶3混合，取10μl混合液进行电泳进行检测，以2000bp DNA Ladder作为标准分子。采用电压1110V，电泳时间30min，用紫外凝胶成像系统观察，结果扩增出750bp的条带，与预期的大小相符。

[0031] 将所扩增到的片段回收，并连接到T-载体上，再转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态中，挑选白色菌落进行测序，将序列进行 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，结果表明所扩增的序列与柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodispv.citri)的gyrB基因有非常高的一致性。(见下表4)，仅个别碱基发生了变化。表明这对引物完全可以用于快速检测柑橘溃疡病菌。

[0032] 表4用特异引物对扩增片段的BLAST结果

[0033]

[0034] 与现有技术相比，本发明的优点是：本方法所使用的引物对是基于柑橘溃疡病菌的转促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列设计的，该引物对有别于其它检测技术，可以用于快速检测出柑橘溃疡病，从而极早防治。附图说明：

[0035] 图1是用本发明的特异性引物作PCR的电泳结果图。

[0036] 图中：从左至右的电泳带依次为：1-Marker、2-11为病株(其中2来自洪江市大红甜橙的果实，3来自洪江市大红甜橙的叶片，4来自洪江市香柚的叶片，5来自双峰县甜橙的果实，6是来自来自双峰县纽荷尔脐橙的果实、7来自衡南县脐橙的叶片，8来自衡南县脐橙的果实，9来自石门县脐橙的果实，10来自石门县脐橙的叶片，11来自石门县冰糖橙的果实)、12-阴性对照。具体实施方式：

[0037] 实施例1

[0038] 用本发明中的特异性引物对来自湖南省主要柑橘产区的溃疡病株上分离到的病原菌进行PCR，见图1，结果柑橘溃疡病菌为阳性，扩增出750个碱基的条带。说明本发明的这对特异性引物对柑橘溃疡病菌是特异的，可快速检测出柑橘溃疡病。