牛奶中雌激素的定量检测方法

摘要

本发明提供了一种牛奶中雌激素的定量检测方法，包括步骤：1)对牛奶样品进行衍生化预处理；及2)通过在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，测定牛奶样品中雌激素的含量。本发明采用样品衍生化测定，极大提高了检测灵敏度；采用二维液相色谱-串联质谱系统进行检测，实现样品的在线自动化净化，极大提高了样品的检测效率；且本发明的分析方法回收率好、自动化程度高、操作简单易行，能够快速同步分析样品中多种痕量雌激素的含量。

权利要求

1.牛奶中雌激素的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）对牛奶样品进行丹磺酰氯衍生化预处理；

2）通过在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，测定牛奶样品中雌激素的含量；

步骤1）中丹磺酰氯衍生化具体方法为：

取3mL牛奶样品，加入3种氘标记的雌激素内标蜗旋混匀；样品加入30%的三氯乙酸

100μL沉降蛋白；混匀后加入等体积混合的乙酸乙酯和正己烷溶剂8mL，震荡提取10min，

10000转离心10min后，分离上层溶液用氮气吹干；重复提取样品2次，将氮气吹干的残渣用1mL乙腈溶解，50℃孵育5min后蜗旋混匀30s，-20℃冷冻30min；然后样品于10000转离心5min，将上层溶液转移至另一试管中蒸干，加入150μL碳酸氢钠缓冲液蜗旋重新溶解样品，然后加入150μL丹磺酰氯丙酮溶液混匀，60℃衍生化5min，用0.22μm微孔滤膜过滤样品，供下一步检测使用；

步骤2）具体操作为：

I.绘制标准曲线：

称取8份空白牛奶样品，每份3mL，分别添加相同浓度的3种氘标记的雌激素内标，内标的终浓度为50ng/L，依次添加不同浓度的雌激素标准品，使其终浓度分别为0ng/L、2.0ng/L、5.0ng/L、10.0ng/L、20.0ng/L、40.0ng/L、80.0ng/L和100ng/L；样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析；以添加样品中被测组分峰面积和内标物峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标绘制标准曲线；

II.牛奶样品中雌激素的定量：

将步骤1）预处理后的牛奶样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，用标准曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内；

固相萃取采用的洗脱条件为：

步骤 总时间(min) 流速(μL/min) 流动相A(%) 流动相B(%)

0 0.00 500 45.0 55.0

1 2.50 500 45.0 55.0

2 2.60 500 1.0 99.0

3 4.00 500 1.0 99.0

4 4.20 100 45.0 55.0

5 13.00 100 45.0 55.0其中流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：0.1%甲酸甲醇；

液相色谱分析条件为：

步骤 总时间(min) 流速(μL/min) 流动相C(%) 流动相D(%)

0 0.00 450 50.0 50.0

1 2.50 450 50.0 50.0

2 9.50 450 15.0 85.0

3 10.00 450 5.0 95.0

4 11.00 450 5.0 95.0

5 11.50 450 50.0 50.0

6 13.00 450 50.0 50.0其中流动相C：0.1%甲酸水；流动相D：0.1%甲酸乙腈；

质谱分析条件为：离子源：电喷雾离子化源，正离子方式检测；离子源电压：+5500V；

温度：500℃；源内气体1为N2，压力65psi；气体2为N2，压力55psi；气帘气体为N2，压力

15psi；扫描方式为多反应离子监测；碰撞气为N2，压力5psi；

所述雌激素为雌酮、α-雌二醇、β-雌二醇和雌三醇中的一种或多种。

说明书

牛奶中雌激素的定量检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及食品检验领域，具体地说，涉及牛奶中雌激素的定量检测方法。 背景技术

[0002] 近十年来，雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。类雌激素内分泌干扰物(EDCs)是一类能够与雌激素受体结合，干扰体内正常激素分泌，导致生殖细胞质量下降，以及三致(致癌、致畸、致突变)等严重危害的化合物。雌激素会导致人类内分泌失衡，尤其是低剂量长期暴露对特定人群(如胎儿、新生婴儿以及青春期前的儿童)产生了严重的影响，如性早熟、肥胖等已演变为社会问题。雌激素的另一大危害就是其致癌作用。国外流行病学调查显示近几十年睾丸癌、子宫癌等发病率呈逐年上升趋势，患癌人数增长与食物结构的改变尤其是肉、蛋、奶等动物产品的增加显著相关。鉴于动物源性食品中雌激素对人类健康的重要影响，有必要对牛奶中雌激素含量进行监控，以保护婴幼儿等易暴露人群的健康。建立牛奶中雌激素高灵敏度检测方法，对于食品中雌激素含量的本底调查和开展风险评估工作，具有重要意义。

[0003] 实现雌激素的科学风险评估，高灵敏度检测方法是关键。欧盟指令2003/74/EC[42]规定动物产品中类固醇激素检测方法必须足够灵敏，能够区分正常生理水平以及滥用和误用导致的激素超标现象。但动物产品中雌激素往往在ppt(ng/L)级，一般的化学检测方法难以达到。利用色谱与质谱联用技术为检测痕量激素水平提供了可能。但由于雌激素结构稳定以及非极性特征，难以离子化或离子化效率低是其检测难点。另外，雌激素的液相色谱-串联质谱检测都需要使用负离 子检测模式，灵敏度很低。即使运用先进的LC-MSMS(API5000)检测雌激素，灵敏度也只能达到0.1μg/kg，难以满足动物产品中雌激素痕量检测的要求。提高检测灵敏度是牛奶中雌激素检测的关键。利用衍生试剂测定牛奶中的雌激素，可大大提高检测灵敏度，但由于衍生化造成额外基质干扰，导入钠、钾等金属离子，对质谱检测器危害严重。因此建立高效的样品提取方法，有效去除基质干扰成为亟待解决的问题。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对牛奶样品基质复杂，正常情况下雌激素含量低，检测方法要求极高等问题，提供一种高灵敏度、高精准度、在线快速提取样品的分析技术，实现对牛奶样品中痕量雌激素的定量快速自动化测定。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种牛奶中雌激素的定量检测方法，包括以下步骤：1)对牛奶样品进行衍生化预处理；2)通过在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，测定牛奶样品中雌激素的含量。其中所述雌激素为雌酮、α-雌二醇、β-雌二醇和雌三醇中的一种或多种。

[0006] 优选地，步骤1)中所述衍生化为丹磺酰氯衍生化。具体操作为： [0007] 取3mL牛奶样品，加入3种氘标记的雌激素内标蜗旋混匀；样品加入30％的三氯乙酸100μL沉降蛋白；混匀后加入等体积混合的乙酸乙酯和正己烷溶剂8mL，震荡提取10min，10000转离心10min后，分离上层溶液用氮气吹干；重复提取样品2次，将氮气吹干的残渣用1mL乙腈溶解，50℃孵育5min后蜗旋混匀30s，-20℃冷冻30min；然后样品于10000转离心5min，将上层溶液转移至另一试管中蒸干，加入150μL碳酸氢钠缓冲液蜗旋重新溶解样品，然后加入150μL丹磺酰氯丙酮溶液混匀，50℃衍生化5min，用0.22μm微孔滤膜过滤样品，装入进样瓶中供下一步检测使用。

[0008] 在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析包括：将进样瓶中的样品上样，进行在线固相萃取和二维液相色谱串联质谱分析。在线固相萃取二维液相色谱串联质谱系统搭建如图1所示。在线固相萃取二维液相色谱串联质谱(online SPE LC-MS/MS)包括了双色谱泵，交换阀以及在线富集柱。其中泵A用于样品在线净化，泵B用于样品色谱柱分离分析。样品首先通过富集柱洗脱杂质并保留目标化合物，然后运用柱交换技术进入分析柱进行测定，实现样品的半自动化提取。

[0009] I.绘制标准曲线，基质添加内标法定量：

[0010] 称取8份空白牛奶样品，每份3mL，分别添加相同浓度的3种氘标记的雌激素内标，内标的终浓度为50ng/L，依次添加不同浓度的雌激素标准品，使其终浓度分别为0ng/L、2.0ng/L、5.0ng/L、10.0ng/L、20.0ng/L、40.0ng/L、80.0ng/L和100ng/L；样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析；以添加样品中被测组分峰面积和内标物峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标绘制标准曲线；

[0011] II.牛奶样品中雌激素的定量：

[0012] 将步骤1)预处理后的牛奶样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，用标准曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

[0013] 所述固相萃取采用的样品净化、洗脱条件(包括流速和梯度)见表1。 [0014] 表1固相萃取采用的洗脱条件

[0015]步骤 总时间(min) 流速(μL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 0.00 500 45.0 55.0
1 2.50 500 45.0 55.0
2 2.60 500 1.0 99.0
3 4.00 500 1.0 99.0
4 4.20 100 45.0 55.0
5 13.00 100 45.0 55.0

[0016] 其中流动相A：0.1％甲酸水；流动相B：0.1％甲酸甲醇。

[0017] 优 选 地，固 相 萃 取 使 用 的 样 品 净 化 柱 为 strata-X on-line SPEcartridge(Phenomenex公司)。

[0018] 所述液相色谱分析条件(梯度洗脱步骤及流速)见表2。

[0019] 表2液相色谱分析条件(梯度洗脱步骤及流速)

[0020]步骤 总时间(min) 流速(μL/min) 流动相C(％) 流动相D(％)
0 0.00 450 50.0 50.0
1 2.50 450 50.0 50.0
2 9.50 450 15.0 85.0
3 10.00 450 5.0 95.0
4 11.00 450 5.0 95.0
5 11.50 450 50.0 50.0
6 13.00 450 50.0 50.0

[0021] 其中流动相C：0.1％甲酸水；流动相D：0.1％甲酸乙腈。

[0022] 液相色谱分析柱为Eclipse Plus，Phenyl-Hexyl，2.1x100mm，3.5μm(Agilent公司)。

[0023] 其中样品净化和样品分析之间阀切换的时间表为：

[0024]

[0025] 质谱分析条件为：

[0026] 离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正离子方式检测；离子源电压：+5500V；温度：500℃；源内气体1(GS1，N2)压力65psi；气体2(GS2，N2)压力55psi；气帘气体(N2)压力
15psi；扫描方式为多反应离子监测(MRM)；碰撞气(CAD，N2)压力5psi。

[0027] 本发明的优点是：

[0028] (一)本发明采用样品衍生化测定，极大提高了检测灵敏度；采用二维液相色谱-串联质谱系统进行检测，实现样品的在线自动化净化，极大提高了样品的检测效率。 [0029] (二)本发明的分析方法回收率好、自动化程度高、操作简单易行，能够快速同步分析样品中多种痕量雌激素的含量。

附图说明

[0030] 图1为在线固相萃取二维液相色谱系统模拟图，其中图1A为进样模式，图1B为测定模式。

[0031] 图2为0.05μg/L标准品溶液的色谱图，色谱图依次为：图2A为雌酮(保留时间RT＝7.13min)，图2B为雌酮内标(保留时间RT＝7.11min)，图2C为β-雌二醇(保留时间RT＝6.44min)和α-雌二醇(保留时间RT＝6.61min)，图2D为β-雌二醇内标(保留时间RT＝6.41min)，图2E为雌三醇(保留时间RT＝4.65min)，图2F为雌三醇内标(保留时间RT＝4.64min)。

[0032] 图3为雌酮(E1)、α-雌二醇(α-E2)、β-雌二醇(β-E2)、雌三醇四种雌激素的标准曲线。横坐标为雌激素浓度(ng/L)，纵坐标为雌激素峰面积与内标物峰面积比值。 具体实施方式

[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 [0034] 实施例1检测样品的预处理

[0035] 取3mL均匀混合的牛奶样品，加入3种氘标记雌激素内标，蜗旋混匀。内标最终浓度为50ppt。接着，向样品中加入30％的三氯乙酸100μL，混匀。加入8mL乙酸乙酯和正己烷(1∶1)溶剂，震荡提取10min后，10000转离心10min。转移上清液，50℃水浴条件下氮气吹干。重复提取两次。将氮气吹干的残渣用1mL乙腈溶解，50℃孵 育5min，蜗旋混匀30s，室温静置5min，置于-20℃冷冻30min。样品在4℃条件下10000转离心5min，上清液转移至另一试管中，50℃水浴条件下氮气吹干。用150μL碳酸氢钠缓冲液(100mM，pH＝
10.5)蜗旋溶解残渣，然后加入150μL浓度为1mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液混匀。快速置于
60℃水浴锅中衍生化5min。样品快速离心1min，用0.22μm有机微孔滤膜过滤，装入进样瓶中待测。

[0036] 实施例2利用在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析雌激素浓度 [0037] 在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱选择的条件：2台Agilent 1200SL液相色谱二元泵，G1367C型自动进样器，G1316B型柱温箱配Valco六通阀。质谱仪为API 5000配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.2数据处理软件，

[0038] 样品净化用strata-X在线固相萃取小柱(20mm×2.0mm×20μm，购自Phenomenex公司)。样品分析用Eclipse Plus苯己基柱(2.1mm×100mm×3.5μm，购自Agilent公司)。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正离子方式检测；离子源电压：+5500V；温度：500℃；源内气体1(GS1，N2)压力65psi；气体2(GS2，N2)压力55psi；气帘气体(N2)压力15psi；扫描方式为多反应离子监测(MRM)；碰撞气(CAD，N2)压力5psi。

[0039] 液相色谱-串联质谱联用对四种雌激素的检测下限均为0.5ng/L。 [0040] 实施例3标准曲线的绘制

[0041] 以基质添加内标法进行定量测定。内标法标准曲线的绘制包括：准备空白牛奶样品，称取8份，每份3mL。分别添加相同浓度的内标，内标的终浓度为50ng/L。依次添加不同浓度的雌激素标准品，使标准曲线的标准点最终浓度分别为0ng/L、2.0ng/L、5.0ng/L、10.0ng/L、20.0ng/L、40.0ng/L、80.0ng/L和100ng/L。上述基质添加标准按与样品相同方法进行提取和液相色谱-串联质谱测定，以添加样品中被测组分峰面积和内标物峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分浓 度与内标物浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内(图2A-图2F，图3)。

[0042] 实施例4样品回收率的测定

[0043] 准备一份牛奶样品，称取7份，每份3mL。标号0-6。0号样品设为空白，1-2号，每个样品添加10ng/L标准品；3-4号，每个样品添加20ng/L标准品；5-6号，每个样品添加100ng/L标准品。另外准备相同浓度的标准溶液，进行低、中、高三个浓度的样品回收率实验。通过标准添加样品中待测物的峰面积扣除空白样品中待测物的峰面积与标准溶液的峰面积比值计算样品回收率，结果见表3。

[0044] 表3添加回收实验结果

[0045]

[0046] 实施例5利用在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱检测牛奶中雌激素的含量 [0047] 采集待测牛奶样品，带回实验室进行处理分析。每个样品设2个重复测定。取3mL样品，加入内标后混匀。加入8mL乙酸乙酯和正己烷(1∶1)溶剂，震荡提取10min。在10000转下离心10min，收集上清液于另一试管中，50℃水浴条件下氮气吹干。重复提取样品2次。将氮气吹干的残渣用1mL乙腈溶解，50℃孵育5min，蜗旋混匀30s。室温静置5min，置于-20℃冷冻30min。样品在4℃条件下10000转离心5min，上清液转移至另一试管中，
50℃水浴条件下氮气吹干。用 150μL碳酸氢钠缓冲液(100mM，pH＝10.5)蜗旋溶解残渣，然后加入150μL浓度为1mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液混匀。快速置于60℃水浴锅中衍生化
5min。样品快速离心1min，用0.22μm有机微孔滤膜过滤，装入进样瓶中待测。 [0048] 利用在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱测定上述待测样品的雌激素浓度。在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱选择的条件：API5000型串联四级杆质谱仪(Applied Biosystem公司，美国)。配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.2数据处理软件。
液相色谱部分的仪器条件：2台Agilent 1200SL液相色谱二元泵，G1367C型自动进样器，G1316B型柱温箱配Valco六通阀。二维液相色谱的安装见图1。样品净化用strata-X在线固相萃取小柱(20mm×2.0mm×20μm)，Phenomenex公司。样品分析用Eclipse Plus苯己基柱(2.1mm×100mm×3.5μm)，Agilent公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正离子方式检测；离子源电压：+5500V；温度：500℃；源内气体1(GS1，N2)压力65psi；气体2(GS2，N2)压力55psi；气帘气体(N2)压力15psi；扫描方式为多反应离子监测(MRM)；碰撞气(CAD，N2)压力5psi。液相色谱流动相为：

[0049] (1)样品在线净化流动相A：0.1％甲酸水；流动相B：0.1％甲酸甲醇。梯度洗脱步骤为0-2.5min，55％B，流速500μl/min；2.5-2.6min，99％B，流速500μl/min；2.6-4.0min，99 ％ B，流 速500μl/min；4.0-4.2min，55 ％B，流 速 100μl/min；4.2-13.0min，55％B，流速100μl/min。

[0050] (2)样品色谱柱分离流动相C：0.1％甲酸水；流动相D：0.1％甲酸乙腈。具体的梯度洗脱步骤及流速为0-2.5min，50％B；2.5-9.5min，上升到85％B；9.5-10.0分钟，上升到95％B；10-11min，保持95％B；11-11.5min，回到50％B，11.5-13min，保持50％B。整个色谱分离过程流速为450μl/min。

[0051] 样品净化及分析阀切换时间表为：0min，阀位置为左，1.0min， 阀位置切换至右。2.5min，阀位置切换回左位。

[0052] 检测结果如表4所示。

[0053] 表4牛奶样品中四种雌激素的含量(pg/mL)

[0054]

[0055] 注：N.D.表示未检出。

[0056] 从表4结果可知，本发明建立的检测方法能够高灵敏度、高精准度地检测到牛奶样品中的痕量雌激素。

[0057] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。