关附甲素、关附庚素的新用途

摘要

本发明提供了关白附中的二萜类生物碱关附甲素、关附庚素在抑制药物代谢酶活性方面的应用。关附甲素、关附庚素可直接抑制CYP2D6的活性，减慢药物(底物)代谢，增强药效，而对其他代谢酶活性没有影响。

权利要求

1.关附甲素在制备药物代谢酶抑制剂中的应用，所述药物代谢酶为CYP2D6。

2.一种药物组合物在制备药物代谢酶抑制剂中的应用，所述药物组合物含有活性成分关附甲素，并且含有一种或几种可药用的辅料；

其中，所述药物代谢酶为CYP2D6。

说明书

关附甲素、关附庚素的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及二萜类生物碱的新用途，具体涉及关附甲素、关附庚素在制备抑制药物代谢酶活性药物中的应用。

背景技术

[0002] 关白附为中药毛莨科黄花乌头Aconitum coreanum(Levl，)Rapaics的块根，为常见中药之一，主治心痛血痹，具有祛风，燥湿，化痰，止痛作用，民间用药疗效好。其化学成份主要有关附庚素(Guanfu base G，GFG)，关附甲素(Guanfu base A，GFA)等，二者均为二萜类生物碱。其中关附甲素为首次发现的全新结构类型的安全、有效的广谱抗心律失常一类新药。

[0003] 细胞色素P450(CYP)是一个由结构和功能相关的基因超家族(superfamily)编码的同工酶所组成的超家族酶系，虽然CYP2D6的含量只占肝脏中所有CYP同工酶的2％～5％，但是它参与代谢的药物却占所有临床应用药物的四分之一左右，因此CYP2D6是CYP酶系中一种非常重要的药物代谢酶。

[0004] 在药物筛选过程中，特异性CYP2D6抑制剂可用于药物相互作用的预测研究，而本发明涉及的关白附中的二萜类生物碱，主要成分为关附甲素及其盐酸或硫酸盐、关附庚素及其盐酸或硫酸盐对CYP2D6的特异性抑制作用目前没有文献报道。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的在于公开关附甲素在制备药物代谢酶抑制剂中的新用途，关附甲素能减慢药物代谢，进而提高药效。

[0006] 本发明的另一个目的在于公开关附庚素在制备药物代谢酶抑制剂中的新用途，关附庚素能减慢药物代谢，进而提高药效。

[0007] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0008] 关附甲素在制备药物代谢酶抑制剂中的应用。

[0009] 所述药物代谢酶优选为细胞色素P450酶系中的一种或几种；进一步优选为CYP2D6。

[0010] 所述关附甲素可以是游离碱或无机酸盐的形式；优选为盐酸盐或硫酸盐。

[0011] 关附庚素在制备药物代谢酶抑制剂中的应用。

[0012] 所述药物代谢酶优选为细胞色素P450酶系中的一种或几种；进一步优选为CYP2D6。

[0013] 所述关附庚素可以是游离碱或无机酸盐的形式；优选为盐酸盐或硫酸盐。

[0014] 本发明所述关附甲素、关附庚素可以从市场购买，也可以从关白附中提取分离或通过化学合成的方法得到，其结构式如下：

[0015]

[0016] 关附甲素(GFA)：R1＝R3＝-Ac；R2＝H

[0017] 关附庚素(GFG)：R1＝R2＝R3＝-Ac。

[0018] 一种药物组合物在制备药物代谢酶抑制剂中的应用，所述药物组合物含有活性成分关附甲素，并且含有一种或几种可药用的辅料；

[0019] 所述药物代谢酶优选为细胞色素P450酶系中的一种或几种；进一步优选为CYP2D6。

[0020] 所述关附甲素可以是游离碱或无机酸盐的形式；优选为盐酸盐或硫酸盐。

[0021] 一种药物组合物在制备药物代谢酶抑制剂中的应用，所述药物组合物含有活性成分关附庚素，并且含有一种或几种可药用的辅料；

[0022] 所述药物代谢酶优选为细胞色素P450酶系中的一种或几种；进一步优选为CYP2D6。

[0023] 所述关附庚素可以是游离碱或无机酸盐的形式；优选为盐酸盐或硫酸盐。

[0024] 本发明所述药物代谢酶CYP2D6所代谢的药物化合物及其盐的分子结构特征为：在化合物分子结构中距离氧化位点5～7A处有一个氮原子。包括抗抑郁药如阿米替林、丙咪嗪、氯米帕明、地昔帕明、去甲替林、氟西汀、帕罗西汀、顽发克星等；β受体阻滞剂如卡维地洛、普萘洛尔、美托洛尔、阿普洛尔、丁呋洛尔、噻吗洛尔、布尼洛尔等；抗精神病药如氯丙嗪、奋乃静、瑞斯哌东、托哌酮等；抗高血压药如胍喹啶、吲哚拉明、乌拉地尔等；抗心绞痛药如派克昔林、特罗地林等；镇痛药如曲马多；止咳平喘药如可待因、右美沙芬等；抗心律失常药如恩卡尼、司巴丁、氟卡尼、普罗帕酮、美西律、茚丙胺。

[0025] 本发明所述关附甲素和关附庚素可以按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液等制剂。

[0026] 为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。

[0027] 本发明所述关附甲素、关附庚素可直接抑制CYP2D6的活力，从而减慢药物(底物)代谢，增强药效，而对其他代谢酶活性没有影响。试验表明，关附甲素、关附庚素均可在人肝微粒体系统中有效地直接抑制右美沙酚的氧位脱甲基反应的进行，其中关附庚素、关附甲素IC50均为nM级。

附图说明

[0028] 图1A：盐酸关附甲素对CYP1A2代谢能力的影响。

[0029] 图1B：盐酸关附甲素对CYP2C9代谢能力的影响。

[0030] 图1C：盐酸关附甲素对CYP2C19代谢能力的影响。

[0031] 图1D：盐酸关附甲素对CYP2D6代谢能力的影响。

[0032] 图1E：盐酸关附甲素对CYP3A4代谢能力的影响(米达唑仑作为底物)。

[0033] 图1F：盐酸关附甲素对CYP3A4代谢能力的影响(睾酮作为底物)。

[0034] 图1G：盐酸关附甲素对CYP2E1代谢能力的影响。

[0035] 图2：奎尼丁对CYP2D6代谢能力的影响。

[0036] 图3：盐酸关附庚素对CYP2D6代谢能力的影响。

[0037] 图4A：盐酸关附甲素对CYP2D6抑制的酶动力学：Dixon图。

[0038] 图4B：盐酸关附甲素对CYP2D6抑制的酶动力学：Cornish-Bowden图。

[0039] 图5A：盐酸关附庚素对CYP2D6抑制的酶动力学：Dixon图。

[0040] 图5B：盐酸关附庚素对CYP2D6抑制的酶动力学：Cornish-Bowden图。

[0041] 图6：奎尼丁对CYP2D6*1重组酶代谢能力的影响(IC50≈0.03μmol/L)。

[0042] 图7：盐酸关附甲素对CYP2D6*1重组酶代谢能力的影响(IC50≈0.1μmol/L)。

[0043] 图8A：盐酸关附甲素对CYP2D6*1重组酶的抑制酶动力学：Dixon图。

[0044] 图8B：盐酸关附甲素对CYP2D6*1重组酶的抑制酶动力学：Cornish-Bowden。

[0045] 实验例

[0046] 实验例1人肝微粒体实验考察盐酸关附甲素对CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4，CYP2E1代谢能力的影响

[0047] 1实验材料和仪器：

[0048] 1.1实验药品

[0049] 混合人肝微粒体(HLM)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司(简称瑞德)，由10名捐献者的肝脏制得，其CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2E1活性由瑞德鉴定，含蛋白浓度10mg/500μl。奥美拉唑钠盐(sodium omeprazole)、氢溴酸右美沙芬(dextromethorphan hydrobromide)、马来酸咪达唑仑(midazolam maleate)、左氧氟沙星(levofloxacin)购自中国药品生物制品检定所；非那西丁(phenacetin，PN)购自Sigma公司；甲苯磺丁脲(tolbutamide)、睾酮(testosterone)购自Fluka公司。实验药物盐酸关附甲素标准品购自中国药品生物制品检定所，阳性对照药物奎尼丁购自Sigma公司。

[0050] Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KCl、MgCl2·6H2O购自南京化学试剂厂；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)购自Sigma公司。其余试剂均为市售分析纯。

[0051] 微粒体缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液，含：0.1M KCl、0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4；pH＝7.4。

[0052] NADPH能量再生系统：临用新配。含：10mM G-6-P、0.5mM NADP+、10mM MgCl2、1U/mL G6PDH。

[0053] 1.2仪器

[0054] 美国热电公司Finnigan高效液相色谱-四极杆串联质谱联用仪(含Finnigan Surveyor高效液相色谱系统、Finnigan TSQ Quantum Discovery max质谱系统、电喷雾离子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan数据处理软件)。

[0055] GENIE VORTEX-2涡旋混合装置；EPPENDORF高速冷冻离心机；Milli-Q Gradient A1超纯水机(Millipore Inc，USA)。

[0056] 2实验方法：

[0057] 实验组：选取0，0.04，0.2，0.8，2，10，50，100和200μmol/L九个浓度的盐酸关附甲素与人肝微粒体，及混合探针底物(底物及其代表亚型和终浓度分别为：非那西丁CYP1A2/70μmol/L，甲苯磺丁脲CYP2C9/70μmol/L，奥美拉唑CYP2C19/20μmol/L，右美沙芬CYP2D6/5μmol/L，咪达唑仑CYP3A4/5μmol/L，睾酮CYP3A4/75μmol/L，氯唑沙宗CYP2E1/60μmol/L)与人肝微粒体(终浓度为0.2mg/mL)在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为20min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1％。0℃冰浴终止反应后，用含内标(左氧氟沙星，200ng/mL)的甲醇溶液(1∶1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，18000rpm离心10min后定量转移50μL上清液，以5μL进样。同时设立不加盐酸关附甲素(以溶剂二甲基亚砜代替)的空白对照。以未被抑制的酶活性百分数为纵坐标；以盐酸关附甲素的浓度(μM)为横坐标作图。

[0058] 对照组：选取0，0.005，0.02，0.08，0.4，2μmol/L五个浓度的奎尼丁与人肝微粒体及右美沙芬/5μmol/L于37℃与人肝微粒体(终浓度为0.2mg/mL)在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为20min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1％。0℃冰浴终止反应后，用含内标(左氧氟沙星，200ng/mL)的甲醇溶液(1∶1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，18000rpm离心10min后定量转移50μL上清液，以5μL进样。同时设立不加奎尼丁(以溶剂二甲基亚砜代替)的空白对照。以未被抑制的酶活性百分数为纵坐标；以奎尼丁的浓度(μM)为横坐标作图。

[0059] 3实验结果：

[0060] 实验结果见图1和图2。结果显示，阳性对照药物奎尼丁的IC50为0.05μM，盐酸关附甲素的IC50为0.078～0.48μM，表明盐酸关附甲素可以有效地抑制CYP2D6酶的活力，而对其他代谢酶无影响。

[0061] 实验例2人肝微粒体实验考察盐酸关附庚素对CYP2D6单底物代谢能力的影响。

[0062] 1实验材料和仪器：

[0063] 1.1实验材料

[0064] 混合人肝微粒体(HLM)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，由10名捐献者的肝脏制得，其CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2E1活性由瑞德鉴定，含蛋白浓度10mg/500μl。

[0065] 氢 溴 酸 右 美 沙 芬 (dextromethorphan hydrobromide) 左 氧 氟 沙 星(levofloxacin)购自中国药品生物制品检定所。盐酸关附庚素购自中国药品生物制品检定所。

[0066] Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KCl、MgCl2·6H2O购自南京化学试剂厂；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)购自Sigma公司。其余试剂均为市售分析纯。

[0067] 微粒体缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液，含：0.1M KCl、0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4；pH＝7.4。

[0068] NADPH能量再生系统：临用新配，含：10mM G-6-P、0.5mM NADP+、10mM MgCl2、1U/mL G6PDH。

[0069] 1.2仪器

[0070] 美国热电公司Finnigan高效液相色谱-四极杆串联质谱联用仪(含Finnigan Surveyor高效液相色谱系统、Finnigan TSQ Quantum Discovery max质谱系统、电喷雾离子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan数据处理软件)。

[0071] GENIE VORTEX-2涡旋混合装置；EPPENDORF高速冷冻离心机；Milli-Q Gradient A1超纯水机(Millipore Inc，USA)。

[0072] 2实验方法：

[0073] 选取0，0.05，0.2，1，4，20，100mol/L浓度的关附庚素与与人肝微粒体(终浓度为0.2mg/mL)，及右美沙芬/5μmol/L于37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为20min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1％。
0℃冰浴终止反应后，用含内标(左氧氟沙星，200ng/mL)的甲醇溶液(1∶1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，18000rpm离心10min后定量转移50μL上清液，以5μL进样。同时设立不加盐酸关附庚素(以溶剂二甲基亚砜代替)的空白对照。以未被抑制的酶活性百分数为纵坐标；以盐酸关附庚素的浓度(μM)为横坐标作图。

[0074] 3实验结果

[0075] 实验结果见图3。结果显示，盐酸关附庚素的IC50为0.25μM，表明关附庚素可以有效地抑制CYP2D6酶的活力。

[0076] 实验例3人肝微粒体实验考察盐酸关附甲素和盐酸关附庚素对CYP2D6单底物抑制类型的的考察

[0077] 1实验材料和仪器：

[0078] 1.1实验材料

[0079] 混合人肝微粒体(HLM)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，由10名捐献者的肝脏制得，其CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2E1活性由瑞德鉴定，含蛋白浓度10mg/500μl。

[0080] 氢 溴 酸 右 美 沙 芬 (dextromethorphan hydrobromide) 左 氧 氟 沙 星(levofloxacin)购自中国药品生物制品检定所。盐酸关附甲素、盐酸关附庚素标准品均购自中国药品生物制品检定所。

[0081] Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KCl、MgCl2·6H2O购自南京化学试剂厂；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)购自Sigma公司。其余试剂均为市售分析纯。

[0082] 微粒体缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液，含：0.1M KCl、0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4；pH＝7.4。

[0083] NADPH能量再生系统：临用新配，含：10mM G-6-P、0.5mM NADP+、10mM MgCl2、1U/mL G6PDH。

[0084] 1.2仪器

[0085] 美国热电公司Finnigan高效液相色谱-四极杆串联质谱联用仪(含Finnigan Surveyor高效液相色谱系统、Finnigan TSQ Quantum Discovery max质谱系统、电喷雾离子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan数据处理软件)。

[0086] GENIE VORTEX-2涡旋混合装置；EPPENDORF高速冷冻离心机；Milli-Q Gradient A1超纯水机(Millipore Inc，USA)。

[0087] 2实验方法：

[0088] 选取0，0.2，0.5，1，2，5μmol/L浓度的盐酸关附甲素和0，2，5，10，20，50μmol/L浓度的盐酸关附庚素分别与三个浓度水平的探针底物(底物及其代表亚型和终浓度分别为：右美沙芬，CYP2D6，1/5/20μmol/L)，在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为20min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1％。0℃冰浴终止反应后，用含内标(左氧氟沙星，200ng/mL)的甲醇溶液(1∶1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，18000rpm离心10min后定量转移50μL上清液，以5μL进样。控制孵育体系中有机溶剂甲醇的含量在1％。

[0089] 3实验结果

[0090] 实验结果见图4和图5。结果显示，盐酸关附甲素和盐酸关附庚素对CYP2D6酶的活力的抑制是非竞争性的，Ki值分别为1.72和10.14μM。实验例4人肝微粒体实验考察关附甲素对CYP2D6重组酶单底物代谢能力的影响

[0091] 1实验材料和仪器：

[0092] 1.1实验材料

[0093] 重组酶：人CYP2D6重组酶购自BD公司，浓度为1000pmol/ml。

[0094] 试剂：Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KCl、MgCl2·6H2O购自南京化学试剂厂；乙腈(色谱纯)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)购自Sigma公司。

[0095] 微粒体缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液，含：0.1M KCl、0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4；pH＝7.4。

[0096] NADPH能量再生系统：临用新配(根据重组酶说明书确定)，含：3.3mM G-6-P、+1.3mM NADP、3.3mM MgCl2、0.4U/mL G6PDH

[0097] 探针底物：丁呋洛尔，体系终浓度为5μM；对应工作液浓度分别为1mM。

[0098] 抑制剂：GFA，体系终浓度为0.01，0.04，0.2，1，4，20μM；对应工作液浓度为2μM，8μM，40μM，200μM，800μM，4mM。

[0099] 1.2仪器

[0100] 高效液相色谱-四极杆串联质谱联用仪(含日本岛津高效液相色谱系统(LC-20A)、美国AB质谱系统(API4000)、电喷雾离子源、及Analyst1.5.1工作站)。

[0101] GENIE VORTEX-2涡旋混合装置；EPPENDORF高速冷冻离心机；Milli-Q Gradient A1超纯水机(Millipore Inc，USA)。

[0102] 2实验方法：

[0103] 实验组：选取0，0.01，0.04，0.2，1，4，20μM浓度的关附甲素与人CYP2D6重组酶(终浓度为10pmol/mL)，及探针底物(丁呋洛尔，体系终浓度为5μM)在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为10min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1％。0℃冰浴终止反应后，用含内标(含非那西丁(2μg/ml)的乙腈溶液(1∶1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，18000rpm离心10min，定量转移50μL上清液，以1μL进样。同时设立不加关附甲素(为空白溶剂乙腈对照组)的空白对照。以未被抑制的酶活性百分数为纵坐标；以关附甲素的浓度(μM)为横坐标作图。

[0104] 对照组：选取0，0.002，0.01，0.04，0.2，1，4μmol/L浓度的奎尼丁与人CYP2D6重组酶(终浓度为10pmol/mL)及探针底物(丁呋洛尔，体系终浓度为5μM)在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为10min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1％。0℃冰浴终止反应后，用含内标(含非那西丁(2μg/ml)的乙腈溶液(1∶1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，18000rpm离心10min，定量转移50μL上清液，以1μL进样。同时设立不加奎尼丁(为空白溶剂乙腈对照组)的空白对照。以未被抑制的酶活性百分数为纵坐标；以奎尼丁的浓度(μM)为横坐标作图。

[0105] 3实验结果

[0106] 实验结果见图6和图7。结果显示，奎尼丁对人重组酶抑制的IC50为0.03μM，盐酸关附甲素对人重组酶抑制的IC50为0.1μM，表明关附甲素可以有效地抑制CYP2D6重组酶的活力。

[0107] 实验例5人肝微粒体实验考察盐酸关附甲素对CYP2D6重组酶单底物抑制类型的的考察

[0108] 1实验材料和仪器：

[0109] 1.1实验材料

[0110] 重组酶：人CYP2D6重组酶购自BD公司，浓度为1000pmol/ml。

[0111] 试剂：Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KCl、MgCl2·6H2O购自南京化学试剂厂；乙腈(色谱纯)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)购自Sigma公司。

[0112] 微粒体缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液，含：0.1M KCl、0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4；pH＝7.4。

[0113] NADPH能量再生系统：临用新配(根据重组酶说明书确定)，含：3.3mM G-6-P、+1.3mM NADP、3.3mM MgCl2、0.4U/mL G6PDH

[0114] 底物：丁呋洛尔，体系终浓度为2μM，4μM，10μM；对应工作液浓度分别为400μM，0.8mM，2mM。

[0115] 抑制剂：GFA，体系终浓度为0.04，0.2，1，4μM；对应工作液浓度为8μM，40μM，200μM，800μM。

[0116] 1.2仪器

[0117] 高效液相色谱-四极杆串联质谱联用仪(含日本岛津高效液相色谱系统(LC-20A)、美国AB质谱系统(API4000)、电喷雾离子源、及Analyst1.5.1工作站)。

[0118] GENIE VORTEX-2涡旋混合装置；EPPENDORF高速冷冻离心机；Milli-Q Gradient A1超纯水机(Millipore Inc，USA)。

[0119] 2实验方法：

[0120] 实验组：选取0，0.04，0.2，1，4μM浓度的关附甲素与人CYP2D6重组酶，及探针底物(丁呋洛尔，体系终浓度为2μM，4μM，10μM)在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为10min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1％。0℃冰浴终止反应后，用含内标(非那西丁2μg/ml)的乙腈溶液(1∶1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，18000rpm离心10min，定量转移50μL上清液，以1μL进样。同时设立不加关附甲素(以乙腈代替)的空白对照。以未被抑制的酶活性百分数为纵坐标；以关附甲素的浓度(μM)为横坐标作图。

[0121] 3实验结果

[0122] 实验结果见图8。结果显示，盐酸关附甲素对CYP2D6重组酶的活力的抑制是非竞争性的，Ki值为0.4μM。

具体实施方式

[0123] 实施例1

[0124] 取盐酸关附甲素、蔗糖、玉米淀粉、硬脂酸镁按重量比1∶16∶5∶0.3的比例共10g，按常规方法制成胶囊剂。

[0125] 实施例2

[0126] 取硫酸关附庚素、蔗糖、玉米淀粉、硬脂酸镁按重量比1∶16∶5∶0.3的比例共10g，按常规方法制成片剂。

[0127] 实施例3

[0128] 取盐酸关附甲素1g，按常规工艺制成静脉注射剂。