本发明是一种螺旋藻多糖的应用。螺旋藻多糖用于制备抑制肿瘤生长的制剂、用于制备对细胞有抗氧化作用的制剂、用于制备NF-KB免疫制剂。螺旋藻水洗灌胃给药方式对S180肿瘤有抑制作用，给药结束时，螺旋藻水提水洗多糖100mg/kg的T/C%为58.95%，肿瘤重量与对照组比较有显著差异（p
一种螺旋藻多糖的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种螺旋藻多糖的应用。
背景技术
[0002] 螺旋藻是一类低等植物，属于蓝藻门，颤藻科。它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。蓝藻的细胞结构原始，且非常简单，它生长于水体中，在显微镜下可见其形态为螺旋丝状。 有关螺旋藻多糖抗肿瘤活性研究已有报道，但多数为粗多糖，抗肿瘤活性是来源于哪种多糖，其明确结构如何，未见报道。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种螺旋藻多糖的应用。
[0004] 本发明的螺旋藻多糖用于制备抑制肿瘤生长的制剂。
[0005] 本发明的螺旋藻多糖用于制备对细胞有抗氧化作用的制剂。
[0006] 本发明的螺旋藻多糖用于制备NF-KB免疫制剂。
[0007] 本发明的螺旋藻多糖对S180小鼠肉瘤实验，发现小鼠口服螺旋藻多糖的水提和碱提部分均有部分抑制肿瘤生长的作用。进一步实验，用水提多糖的水洗、0.2、0.3、0.5 mol/l Nacl洗脱对小鼠脾细胞进行增殖实验的研究，发现水提多糖的水洗脱部分有较强的促进脾细胞增殖的作用，再在体内验证其组分对S180肉瘤的抑制作用。结果表明，螺旋藻水洗灌胃给药方式对S180肿瘤有抑制作用，给药结束时，螺旋藻水提水洗多糖100mg/kg的T/C%为58.95%，肿瘤重量与对照组比较有显著差异（p < 0.05）。
[0008] 用小鼠免疫器官的脾细胞进行免疫细胞的增殖实验，结果表明：螺旋藻水洗多糖40、200、1000ug/ml均对脾细胞有促进增殖作用，T/C%分别为148.96%、166.89%、182.99%与不加药组有显著差异（p < 0.05）。螺旋藻0.2mol/l Nacl洗脱多糖8ug/ml和40ug/ml对脾细胞也有促进增值作用，T/C%分别为179.88%和202.81%与不加药组有显著差异（p <
0.05）。
[0009] 用细胞在内毒素LPS等外界刺激物作用下，LPS通过结合到TLR4 受体后，导致通过MyD88 依赖的和TRIF 的两条途径激活NF-κB，实验时同时给予受试药物，检测在药物作用下是否抑制NF-κB的激活。同时不给予外界刺激，单独给予药物处理，检测在药物作用下是否激活NF-κB。结果，螺旋藻水提水洗40、200、1000ug/ml剂量组均对NF-κB有抑制，抑制率分别为：99.9%、97.6%和92.0%。
[0010] 用双氧水诱导PC12细胞损伤模拟老年患者由于ROS的过度积累而导致的神经元退化，研究多糖的抗衰老作用及其可能的机制。结果，螺旋藻多糖四组分在40、200ug/ml的时候，均对PC12细胞有抗氧化作用，与H2O2-400uM组比较均有显著性差异。
附图说明
[0011] 图1.螺旋藻多糖对S180移植瘤的瘤重图。
[0012] 图2.螺旋藻多糖对S180小鼠移植模型的动物体重的生长曲线图。
[0013] 图3.肿瘤照片。
[0014] 图4.螺旋藻水提多糖水洗脱多糖组分对S180移植瘤的瘤重图。
[0015] 图5.螺旋藻水提多糖水洗脱多糖组分对S180小鼠移植模型的动物体重的生长曲线图。
[0016] 图6.肿瘤照片。
[0017] 图7.螺旋藻纯化多糖对小鼠脾细胞增值实验（T/C%）。
[0018] 图8.各组药物与未经双氧水处理组比较。
[0019] 图9.各组样品对NF-κB的抑制率图。
[0020] 具体实施方式
[0021] 实施例1：
[0022] 本发明的螺旋藻多糖用于制备抑制肿瘤生长的制剂。
[0023] 具体实验如下：
[0024] 一、粗多糖的抗S180小鼠肉瘤实验
[0025] 1．试验材料和方法
[0026] 1.1 受试样品：螺旋藻水提多糖，褐色干粉，干燥器避光保存。螺旋藻碱提多糖，浅绿色干粉，干燥器避光保存。
[0027] 供试样品精密称量，无菌工作台中将药物粉末配制成最高剂量，再梯度稀释到低剂量，分装在离心管内4度保存，每天取样给药。
[0028] 1.2试验动物：ICR小鼠，6周龄，雌性，36只，购自上海斯莱克动物资源中心。
[0029] 1.3剂量分组
[0030] 试验剂量分组设置见下表：Group Compound Animals Route Dose(mg/kg) Schedule
1 Control(Saline) 6 po 0.1ml/10g,BW Qd*9
2 螺旋藻-H2O 6 po 200mg/kg Qd*9
3 螺旋藻-H2O 6 po 500mg/kg Qd*9
4 螺旋藻-OH 6 po 200mg/kg Qd*9
5 螺旋藻-OH 6 po 500mg/kg Qd*9
6 CTX 6 ip 30mg/kg Qd*9
[0031] 1.4试验方法：移植模型的建立：S180细胞经ICR小鼠腹水传代，实验时取腹水1：5稀释后，以0.2ml/mouse 接种至小鼠右侧腋，接种第二天开始给药，连续给药9天。
[0032] 试验期间每周测定两次动物体重。每日观察记录临床症状。给药结束时，取肿瘤称重。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率T/C（%），计算公式为：T/C（%）=(T/C) ´100%。T为治疗组瘤重，C为阴性对照组瘤重。
[0033] 疗效评价标准：T/C（%）£ 60%并经统计学分析p<0.05为有效。
[0034] 2．结果：螺旋藻水提单剂量200和500 mg/kg ，螺旋藻碱提单剂量200和500 mg/kg ，每日灌胃给药连续9天，进行S180小鼠移植模型的药效学试验。结果表明，此提取物灌胃给药方式对S180肿瘤有部分抑制作用。给药结束时，螺旋藻水提多糖的T/C%分别为58.50%和44.66%。螺旋藻碱提多糖的T/C%分别为48.79%和47.94% 。 各组剂量T/C%<60%肿瘤重量与对照组比较有显著差异（p<0.05），但SD过大，待进一步研究。试验过程中未见其他药物相关毒性反应。
[0035] 螺旋藻多糖对S180移植瘤的抑制作用Tumor(g) T/C(%)
Control（saline） 1.37±0.20
螺旋藻-H2O200mg/kg,po 0.80±0.52* 58.50
螺旋藻-H2O500mg/kg,po 0.61±0.58* 44.66
螺旋藻-OH200mg/kg,po 0.67±0.31* 48.79
螺旋藻-OH500mg/kg,po 0.66±0.57* 47.94
CTX30mg/kg,ip 0.30±0.10** 21.72
[0036] *：p<0.05, compare with control group; **：p<0.01, compare with control group.
[0037] 二、纯化多糖的抗S180小鼠肉瘤实验
[0038] 1．试验材料和方法
[0039] 1.1 受试样品：螺旋藻水提多糖水洗脱多糖组分，白色干粉，由干燥器避光保存。供试样品精密称量，无菌工作台中将药物粉末配制成最高剂量，再梯度稀释到低剂量，分装在离心管内-20度保存，每天取样给药。
[0040] 1.2试验动物：ICR小鼠，6周龄，雌性，40只，购自上海斯莱克动物资源中心。
[0041] 1.3剂量分组
[0042] 试验剂量分组设置见下表：Group Compound Animals Route Dose(mg/kg) Schedule
1 Control(Saline) 8 po 0.1ml/10g,BW Qd*10
2 螺旋藻-1 8 po 30mg/kg Qd*10
3 螺旋藻-1 8 po 100mg/kg Qd*10
4 螺旋藻-1 8 po 300mg/kg Qd*10
5 CTX 8 ip 30mg/kg Qd*10
[0043] 1.4试验方法：移植模型的建立：S180细胞经ICR小鼠腹水传代，实验时取腹水1：5稀释后，以0.2ml/mouse 接种至小鼠右侧腋，接种第二天开始给药，连续给药10天。
[0044] 试验期间每周测定两次动物体重。每日观察记录临床症状。给药结束时，取肿瘤和脾脏称重。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率T/C（%），计算公式为：T/C（%）=(T/C)´100%。T为治疗组瘤重，C为阴性对照组瘤重。
[0045] 疗效评价标准：T/C（%）£ 60%并经统计学分析p<0.05为有效。
[0046] 2．结果：螺旋藻水提多糖水洗脱多糖组分单剂量30、100和300 mg/kg，每日灌胃给药连续10天，进行S180小鼠移植模型的药效学试验。结果表明，此提取物灌胃给药方式对S180肿瘤有抑制作用。给药结束时，螺旋藻水提水洗多糖100 mg/kg的T/C%为58.95%，肿瘤重量与对照组比较有显著差异（p < 0.05）。试验过程中未见其他药物相关毒性反应。
[0047] 螺旋藻水提多糖水洗脱多糖组分对S180移植瘤的抑制作用 Tumor(g) Spleen(g) T/C(%)
Control 1.19±0.39 0.23±0.07
螺旋藻-130mg/kg,PO 1.49±0.30 0.23±0.05 125.26
螺旋藻-1100mg/kg,PO 0.70±0.25* 0.20±0.00 58.95
螺旋藻-1300mg/kg,PO 1.50±0.32 0.21±0.06 126.32
CTX30mg/kg,ip 0.81±0.27* 0.19±0.04 68.42
[0048] *：p<0.05, compare with control group; **：p<0.01, compare with control group。
[0049] 实施例2：
[0050] 螺旋藻多糖用于制备对细胞有抗氧化作用的制剂。
[0051] 一、多糖对小鼠脾细胞增殖实验
[0052] 1．试验材料和方法
[0053] 1.1细胞和样品准备
[0054] 取6-8周龄小鼠，颈椎脱臼小鼠，迅速取脾，放在一盘冷的HBSS内使其尽快冰浴，去除上皮细胞和脂肪组织，研磨过100眼网筛，离心250 g，5分钟。弃去上清液，用低渗透Gey’s (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3)溶液消除红细胞，约2分钟后，用冷的HBSS洗三次细7
胞。加入10％胎牛血清的RPMI - 1640培养液，调整细胞悬液浓度至（1 × 10 cells/ml），
6
然后放入96孔培养版100 μL/孔（1 × 10 cells/well），然后加入刀豆蛋白A（Sigma公司的C - 2010， 5微克/毫升），同时用100 μl培养基设立空白对照。所有样品一式三份。将在37℃条件下，5％二氧化碳培养箱培养了48小时。
[0055] 多糖样品：螺旋藻粗多糖经过DEAE树脂柱，以蒸馏水、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl依次洗脱所得多糖组分。
[0056] 1.2检测：使用ELISA法对细胞增殖的BrdU定量试剂盒（罗氏＃11647229001）。加入BrdU标记20μL/孔，重新再培养6小时或过夜。离心300 g,10分钟，然后快速弹出培养液，在60℃干燥1 h。参考BrdU试剂盒说明书，依次加入FixDenat、anti-BrdU-POD、底物直到颜色适合光度检测。加入25 μl/well 2 N H2SO4终止液，5分钟内在450 nm处测量参考690 nm的吸光度。
[0057] OD Test - OD blank
[0058] T/C (%) = *100
[0059] OD Control-OD blank
[0060] 2．结果：用螺旋藻水提多糖组分以蒸馏水、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl洗脱，得到四个组分进行小鼠脾细胞增殖实验的研究。结果表明：螺旋藻水洗多糖40、200、1000μg/ml均对脾细胞有促进增殖作用，T/C%分别为148.96%、166.89%、182.99%与不加药组有显著差异（p < 0.05）。螺旋藻0.2mol/l Nacl洗脱多糖8ug/ml和40ug/ml对脾细胞也有促进增值作用，T/C%分别为179.88%和202.81%与不加药组有显著差异（p < 0.05）。
[0061] 螺旋藻纯化多糖对小鼠脾细胞增值实验（T/C%）
[0062]
[0063] *：p < 0.05, compare with control group; **：p < 0.01, compare with control group
[0064] 二、对双氧水诱导神经细胞死亡保护作用研究
[0065] 过氧化氢(H2O2 ) 是活性氧族(reac2tiveoxygenspecies , ROS) 的主要成分之一,可以跨膜扩散进入细胞内,是一种比较常用的细胞氧化应激诱导剂,广泛用于诱导细胞凋亡模型。因而本研究利用双氧水诱导PC12细胞损伤模拟老年患者由于ROS的过度积累而导致的神经元退化，研究多糖的抗衰老作用及其可能的机制。
[0066] 1. 材料
[0067] 1.1多糖的配置：螺旋藻水提粗多糖经过DEAE柱依次用水，0.2, 0.3, 和0.5 M NaCl洗脱多糖组分，四组分用PBS配置成10 mg/ml的储存液，-20度保存，实验时用培养基稀释成1 mg/ml、200μg/ml、40μg/ml的工作浓度进行药物处理。
[0068] 1.2 试剂：CCK-8 (日本同仁化学研究所) ；DMEM培养基（ HyClone，Thermo scientific, USA）；马血清；新生小牛血清； 30% 过氧化氢
[0069] 1.3 仪器：CO2细胞培养箱；倒置显微镜；分析天平；冷冻高速离心机；全波长酶标仪
[0070] 2. 方法
[0071] 2.1 PC12 细胞培养和处理：PC12 细胞株由ATCC所提供,保存于液氮中，用含10 %马血清、5 %新生小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基培养。置于37°C饱和湿度、含5% CO2和95%空气的恒温箱中培养,直接吹打无需胰蛋白酶消化传代，待细胞传至10～20代时进行试验。4
[0072] 2.2 H2O2 处理：PC12细胞以1 × 10 细胞/孔的密度接种于96孔板内，贴壁24 h后给予螺旋藻不同组分处理，浓度分别为40μg/ml、200μg/ml和1 mg/ml，给药20 min后给予400μM过氧化氢处理，处理期间全程给药，空白对照组比较。
[0073] 2.3 WST比色分析：过氧化氢处理4 h后,每孔加入20μl CCK-8 ,37 ℃孵育2 h 后,酶标仪上450 nm波长处测定吸光度值。
[0074] 2.4统计学处理：采用SPSS 统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(x ±s) 表示,两组间比较采用独立样本t 检验,多组间比较采用单因素方差分析。
[0075] 3. 结果
[0076] 各组药物与未经双氧水处理组比较
[0077]
[0078] *：p<0.05, compare with H2O2-400uM; **：p<0.01, compare with H2O2-400uM.[0079] 实施例3：
[0080] 螺旋藻多糖用于制备NF-KB免疫制剂。实验如下：
[0081] 螺旋藻多糖靶向NF-κB信号通路免疫活性筛选
[0082] 1. 材 料
[0083] 1.1 药物配置：用螺旋藻水提粗多糖组分经DEAE树脂柱以蒸馏水、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液依次洗脱，得到四个组分进行针对NF-κB免疫抑制活性筛选。样品分别用PBS配制成10 mg/ml储存液，-20度保存，实验事用培养基稀释成40μg/ml、200μg/ml、1000μg/ml的工作浓度进行药物处理。
[0084] 1.2 试 剂 ：LPS（Sigma, L6529）；CCLR（Reporter LysisBuffer,Promega,28303701）；Luciferin (Promega,E4550)
[0085] 1.3 仪器：分析天平；全波长酶标仪；高速离心机
[0086] 2. 方法
[0087] 2.1 细胞培养：293细胞是人肾上皮细胞系由中科院上海生命科学院细胞库购买,保存于液氮中，293/NF-κB-Luc 细胞用NF-kB-luc报告基因来检测NF-κB的激活程度，用含10 %胎牛血清（Gibco公司）的DMEM高糖培养基培养。置于37℃饱和湿度、含5%CO2和95%空气的恒温箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
[0088] 2.2 检测
[0089] 1)收集细胞293/ NF-κB-Luc ，以5 × 105/ml的细胞浓度接种于96孔细胞培养版, 100 μl/孔, 37℃, 5% CO2 培养过夜。
[0090] 2)药物处理：每组药物以40μg/ml、200μg/ml、1000μg/ml 的终浓度给药，100μl/每孔，每组三复孔。
[0091] 3)抑制活性检测：药物处理15分钟后，用终浓度1 μg/ml的LPS刺激细胞激活NF-κB，继续培养6小时，空白组不加LPS以同体积培养基做对照。
[0092] 4)激活活性检测：药物处理组和空白组均不加LPS加同体积培养基,对照组加终浓度1 μg/ml的LPS刺激细胞激活NF-κB，继续培养6小时。
[0093] 5)弃去培养液，用20 μl/孔1 × CCLR 溶解细胞。
[0094] 6)加40 μl/孔 Luciferin, 在10分钟内读取 RLU 值。
[0095] 7)计算：
[0096]
[0097] 3. 结果：
[0098] 各组样品对NF-κB的抑制率
[0099]
[0100] 各组样品对NF-κB的激活率
[0101]
[0102] 本发明的螺旋藻多糖的化学结构特征为：主链由1, 4-连接α-D-葡萄糖构成，平均每8个主链残基上有一个分支，取代在分支点的6位，分支由1个或2个1®6连接的葡萄糖构成，结构式如下：
[0103]
[0104] 并按以下方法制备：
[0105] 取5.0 kg 螺旋藻生药材，加20 L 95%工业乙醇，室温下浸泡七天，以除去脂溶性小分子。倾去乙醇，固体物置于通风处晾干，然后用沸水进行提取，每次加入水约30 L，提取时间为4小时，用苯酚-硫酸法检测提取液的糖含量，至糖反应不明显为止，共计提取5次。每次的提取液经过滤后合并，加热浓缩至小体积，对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，1：1(v/v)加入30%的三氯乙酸溶液去除蛋白，在4度条件下反应4小时、加10%NAOH溶液中和至pH值为7左右后扎袋对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积的95%工业乙醇，静置过夜。离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得水提粗多糖LXZ-W为99 g。
[0106] 沸水提取后的固体残渣在4 ℃下用5% (v/v) NaOH溶液20 L浸提3小时，间歇搅拌，过滤，用10%(v/v) HCl溶液中和至pH 7左右，扎袋对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积 的95%工业乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得碱提粗多糖LXZ-N 6.4 g。
[0107] 水提螺旋藻粗多糖用DEAE-纤维素阴离子交换柱（50 cm × 5 cm）层析进行分离，用去离子水和不同离子强度（0.1，0.2，0.3和0.5 mol/L）的NaCl溶液进行分步洗脱，利用DEAE-纤维素对不同结构多糖的吸附力不同的特点将粗多糖分成不同的组分多糖。水提粗多糖LXZ（10 g）上样（10 g样品溶于100 ml去离子水，离心后上样），分别从去离子水、0.1、0.2，0.3和0.5 mol/L NaCl溶液的洗脱液中分离得到五个组分，洗脱液对去离子水透析，透析内液减压浓缩并冷冻干燥，所得产物分别命名为LXZ-W，LXZ-0.1，LXZ-0.2，LXZ-0.3，LXZ-0.5。
[0108] 取LXZ-W样品100 mg，用10ml的0.2mol/L氯化钠溶解，离心，上清液上S-300凝胶柱，用0.2 mol/L氯化钠洗脱液洗脱得LXZ-W-300组分，经HPLC检测为一纯多糖，分子量4
在7.4 × 10 Da左右。
[0109] 仪器设备：
[0110] SHB－III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸易有限公司。
[0111] 85-2型恒温磁力搅拌器：上海思乐仪器有限公司。
[0112] DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。
[0113] N-1100D-WD真空旋转蒸发仪：日本EYELA公司。
[0114] UV260 可见分光光度计：日本Shimadzu。
[0115] GL-21M低温高速离心机：上海离心机研究所有限公司。
[0116] Labconco大型冷冻干燥机：美国Labconco公司。
[0117] Edwards小型冷冻干燥机：英国Edwards公司。
[0118] LKB 2211 自动收集器：瑞典 LKB公司。
