比伐卢定-聚乙二醇化复合物

摘要

本发明涉及比伐卢定的聚乙二醇化复合物，其制备方法，含有它们的药物组合物及用途。本发明中的比伐卢定的聚乙二醇化复合物指对比伐卢定序列中第5位到第8位的任一甘氨酸进行半胱氨酸替代后进行聚乙二醇化修饰后得到既保持比伐卢定活性又延长其半衰期的新结构化合物。本发明中的比伐卢定的聚乙二醇化复合物在治疗或预防血栓类疾病的药物中的应用，包括在不稳定型心绞痛，外周动脉介入治疗，心肺移植手术及防栓治疗中的药物中的应用。

权利要求

1.一种比伐卢定（bivalirudin，BVLD）—聚乙二醇复合物，其特征在于所述复合物为对比伐卢定序列中由N-端到C-端第5位到第8位的任一甘氨酸进行半胱氨酸替代后在半胱氨酸侧链进行聚乙二醇化修饰后得到的化合物； 所述复合物为具有式（Ⅰ）结构的化合物：

X

[Cys（PEG-M）]-BVLD (Ⅰ)

其中

X为5-8中的任意整数，表示比伐卢定序列中的第5位到第8位任一甘氨酸被半胱氨酸替代；PEG为RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R=H或CH3，n=5-1000；Cys为半胱氨酸，它通过其侧链硫原子与M基团共价相连。

2.根据权利要求1所述比伐卢定—聚乙二醇复合物，其中该复合物的结构为

7 7 7

[Cys(mPEG2000-MAL)]-BVLD，[Cys(mPEG5000-MAL)]-BVLD和[Cys(mPEG10000-MAL)] -BVLD。

3.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1-2中至少一种比伐卢定—聚乙二醇复合物和药用辅料。

4.根据权利要求1-2中任一项权利要求所述的比伐卢定—聚乙二醇复合物在制备用于治疗或预防血栓类疾病的药物中的应用，其特征在于所述药物用于治疗不稳定型心绞痛、外周动脉介入治疗、心肺移植手术及防栓治疗。

5.根据权利要求1所述的比伐卢定—聚乙二醇复合物的制备方法，其特征在于包括 X将[Cys]-BVLD溶于纯水中，用碳酸氢钠调节pH到7～8，加入2-3倍摩尔当量的PEG，室温搅拌反应2-3小时，用反相高效液相色谱（RP-HPLC）监测反应进程和分离目标产物，目X标产物经冷冻干燥得比伐卢定—聚乙二醇复合物[Cys(PEG-MAL)]-BVLD，其中的PEG为马来酰亚胺基聚乙二醇、乙烯砜基聚乙二醇或碘代乙酰胺基聚乙二醇。

说明书

比伐卢定-聚乙二醇化复合物

【技术领域】

[0001] 本发明涉及比伐卢定的聚乙二醇化复合物，其制备方法，含有它们的药物组合物以及其在治疗或预防血栓类疾病的药物中的应用，包括在不稳定型心绞痛、外周动脉介入治疗、心肺移植手术及防栓治疗中的药物中的应用。【背景技术】

[0002] 动脉粥样硬化等引发的血栓病已经成为世界上首位死亡原因，其发病率在我国呈上升趋势，而抗凝药在该病的治疗中极为重要。在目前众多的抗凝药中，Medicines公司的TM比伐卢定(Angiomax )是FDA于2000年批准上市的一种抗凝新药，其抗凝成分是水蛭素类似物(片段)。这种药是凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂，无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，其均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。它克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺点，在不稳定型心绞痛、外周动脉介入治疗、心肺移植手术及防栓治疗中显示出良好的作用。

[0003] 但比伐卢定对凝血酶活性位点的抑制持续时间较短，在人体内的半衰期约25分钟。要实现对凝血酶活性位点的长时间抑制，有时需要反复多次注射给药。而比伐卢定价格昂贵，多次反复用药大大增加了患者的就医成本，因此，开发长效、稳定、经济的类似药物或制剂十分必要。

[0004] 蛋白药物经聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰后能显著延长作用，增强水溶性和稳定性，降低免疫原性和抗原性，已有多个PEG修饰的蛋白药物上市。本发明通过在比伐卢定结构中引入半胱氨酸，以实现对比伐卢定进行定点聚乙二醇化修饰的方法及应用尚未见文献报道。【发明内容】

[0005] 本发明的目的之一是提供比伐卢定-聚乙二醇复合物。化学合成多肽药物比伐卢定是凝血酶的直接抑制剂，它克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺点，在不稳定型心绞痛、外周动脉介入治疗、心肺移植手术及防栓抗栓治疗中显示出良好的作用。但比伐卢定的单次剂量为250毫克，目前价格为每克1000元左右。本研究希望通过合成比伐卢定的PEG化修饰产物，能延长比伐卢定的半衰期，减少用药剂量或给药频率，将为比伐卢定带来更广阔的市场，创造更大的经济效益和社会效益。比伐卢定来源于水蛭素复合物，由20个氨基酸残基组成的多肽，分子量是2180，其结构式为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。研究表明其N-端Pro-Arg-Pro和C-端Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu是其与凝血酶结合的两个关键位点，5到8位的4个甘氨酸只是起连接作用，因此选择5、6、7位或8位的甘氨酸进行修饰是理想的位点。

[0006] 本发明所述的比伐卢定(bivalirudin，BVLD)-聚乙二醇复合物为对比伐卢定序列中第5位到第8位(由N-端到C-端)的任一甘氨酸进行半胱氨酸替代后在半胱氨酸侧链进行聚乙二醇化修饰后得到的新结构化合物，所述复合物为具有式(I)结构的化合物：

[0007] [Cys(PEG-M)]X-BVLD (I)

[0008] 其中

[0009]

[0010] X为5-8中的任意整数，表示比伐卢定序列中的第5位到第8位任一甘氨酸被半胱氨酸替代；PEG为RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；Cys为半胱氨酸，它通过其7
侧链硫原子与M基团共价相连。具体地，该复合物的结构包括[Cys(mPEG2000-MAL)]-BVLD，
7
[Cys(mPEG5000-MAL)]-BVLD和[Cys(mPEG10000-MAL)]-BVLD。

[0011] 本发明的另一个目的是提供比伐卢定聚乙二醇复合物的制备方法，所述的制备方X法包括：将[Cys]-BVLD溶于纯水中，用碳酸氢钠调节pH到7～8，加入2-3倍摩尔当量的PEG，室温搅拌反应2-3小时，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)监测反应进程和分离目标产X
物，目标产物经冷冻干燥得比伐卢定-聚乙二醇复合物[Cys(PEG-MAL)]-BVLD，其中PEG为马来酰亚胺基聚乙二醇、乙烯基聚乙二醇或碘代乙酰基聚乙二醇。

[0012] 本发明以在7位引入半胱氨酸替代甘氨酸，然后进行聚乙二醇修饰为例：先采用7
通用的固相多肽合成策略合成7位由半胱氨酸取代甘氨酸的比伐卢定，即[Cys]-比伐卢定，其氨基酸序列为

[0013] D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu7
-Glu-Tyr-Leu-OH，然后将[Cys]-比伐卢定与mPEG-MAL发生加成反应得到比伐卢定-聚乙
7
二醇复合物[Cys(mPEG-MAL)]BVLD。这种比伐卢定聚乙二醇复合物是通过引入到比伐卢定序列中的半胱氨酸的巯基与mPEG-MAL反应制备得到的，PEG及其复合物的结构与mPEG-MAL和肽链中巯基反应的过程如下所示：

[0014]

[0015] [Cys]7-比伐卢定的具体制备步骤包括氨基酸树脂的制备、替代度的测定、偶联氨7
基酸、裂解肽树脂得到[Cys]-比伐卢定粗品，经反相-高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，冻
7
干得到[Cys]-比伐卢定纯品干粉。

[0016] 本发明中，先将纯化后的[Cys]7-比伐卢定溶于水中，接着用饱和碳酸氢钠溶液将pH调节到弱碱性，如pH为7-8之间，然后分别加入2-3摩尔当量的平均分子量为2000、5000、10000的mPEG-MAL，在室温下反应2-3小时。通过RP-HPLC对反应进行监测、目标产物分离与纯度分析。

[0017] 目标产物[Cys(mPEG-MAL)]7-BVLD结构通过进行氨基酸组成分析、HPLC和质谱(MALDI-TOF-MS)分析得到确证。

[0018] 新结构的比伐卢定-聚乙二醇复合物经抗凝活性评价，凝血酶原时间(PT)，凝血酶时间(TT)以及活化部分凝血活酶时间(APTT)实验结果表明其保持了比伐卢定的抗凝活性。基于聚乙二醇修饰药物研究的已有知识可以推知比伐卢定的聚乙二醇修饰又延长了其半衰期。

[0019] 本发明还有一个目的是提供所比伐卢定-聚乙二醇复合物，含有它们的药物组合物以及其在治疗或预防血栓类疾病的药物中的应用，以及用于治疗不稳定型心绞痛、外周动脉介入治疗、心肺移植手术及防栓治疗中的药物中的用途。本发明的药物组合物含有至少一种比伐卢定-聚乙二醇复合物和药用辅料。

[0020] 本发明采用简便易行的方法，制备得到新结构的既能保持比伐卢定的抗凝活性又延长其抗凝时间的比伐卢定聚乙二醇复合物。【附图说明】

[0021] 附图1为[Cys]7-BVLD的HPLC分析图谱。

[0022] 附图2为[Cys]7-BVLD的ESI-MS分析图谱。

[0023] 附图3为[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD的HPLC分析图谱。

[0024] 附图4为[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD的MALDI-TOF-MS分析图谱。

[0025] 附图5为[Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD的HPLC分析图谱。

[0026] 附图6为[Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD的MALDI-TOF-MS分析图谱。

[0027] 附图7为[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD的HPLC分析图谱。

[0028] 附图8为[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD的MALDI-TOF-MS分析图谱。

具体实施方式

[0029] 本发明所用的氨基酸构型除特殊说明外均为L-型，使用的相关缩写词具有如下的含义：

[0030] tBu：叔丁基

[0031] 2-CTC Resin：2-氯三苯甲基氯树脂

[0032] DCM：二氯甲烷

[0033] DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺

[0034] DMF：N，N-二甲基甲酰胺

[0035] EDT：1，2-乙二硫醇

[0036] Fmoc：9-芴甲氧羰基

[0037] HOBt：1-羟基苯并三氮唑

[0038] NMP：N-甲基吡咯烷酮

[0039] Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

[0040] TFA：三氟乙酸

[0041] Ts-Cl：对甲苯磺酰氯

[0042] Fmoc-Arg(Pbf)-OH：N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸

[0043] Fmoc-Asn(Trt)-OH：N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-天冬氨酸

[0044] Fmoc-Asp(OtBu)-OH：N-芴甲氧羰基-三苯甲基-L-天冬酰胺

[0045] Fmoc-Cys(Trt)-OH：N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸

[0046] Fmoc-Glu(OtBu)-OH：N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-谷氨酸

[0047] Fmoc-Gly-OH：N-芴甲氧羰基甘氨酸

[0048] Fmoc-Ile-OH：N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸

[0049] Fmoc-Leu-OH：N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸

[0050] Fmoc-D-Phe-OH：N-芴甲氧羰基-D-苯丙氨酸

[0051] Fmoc-Phe-OH：N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸

[0052] Fmoc-Pro-OH：N-芴甲氧羰基-L-脯氨酸

[0053] Fmoc-Tyr(tBu)-OH：N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-酪氨酸

[0054] MALDI-TOF-MS：基质辅助激光解吸附时间飞行质谱

[0055] PEG-MAL：马来酰亚胺基聚乙二醇

[0056] 本发明中，Kaiser检测法主要采用的试剂为茚三酮，反应呈紫色或蓝色表明树脂上有游离的氨基存在，表明偶联未完全。

[0057] 下面结合具体的实例对本发明做进一步的详细说明，但本发明不限于以下实施例。

[0058] 实施例1[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD的制备

[0059] 称取mPEG2000-OH 20g(10mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷50mL，固体溶解后再加入三乙胺7.5mL(50mmol)和对甲苯磺酰氯9.5g(Ts-Cl，50mmol)，室温搅拌反应。TLC检测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加入50mL无水乙醚沉淀出固体，再加水将固体溶解，分液，分出水层，用无水乙醚50mL洗涤2次，水相再用二氯甲烷75mL萃取2次，收集有机相，干燥过夜。旋蒸去溶剂，加无水乙醚沉降出固体。干燥后得到mPEG2000-OTs 14.2g，收率71％。

[0060] 将mPEG-OTs 14g(7mmol)溶于30mL DMF，加入的邻苯二甲酰亚胺 钾盐3.88g(21mmol)，氮气保护下，120℃反应4h。减压旋蒸除去溶剂，加入无水乙醇，加入水合肼
4.5mL，加热回流4h。减压旋蒸除去溶剂，加入二氯甲烷100mL，滤去不溶物，用饱和氯化钠溶液50mL洗三次，无水Na2SO4干燥12h，滤去干燥剂，减压旋蒸除去溶剂，乙醚沉降，抽滤，干燥后得mPEG2000-NH210.8g，收率77％。

[0061] 将mPEG2000-NH210g(5mmol)溶于20mL DMF中，加入马来酸酐4g，80℃搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，乙醚沉降，滤集固体，干燥后得9.5g。将固体溶于30mL乙酸酐，加入无水乙酸钠4.9g，100℃搅拌反应45min。滤除反应液中的固体，向反应液中加入10倍体积的水，然后用二氯甲烷萃取水相三次，有机相经饱和氯化钠溶液洗三次后，无水Na2S04干燥
12h。过滤，减压旋蒸除去溶剂，乙醚沉降，离心，抽滤，干燥得mPEG2000-MAL 6.8g，收率68％。

[0062] 称取2-CTC Resin 3.8g(5mmol，1.3mmol/g)至反应器中，加入适量DMF洗涤后，抽掉溶液，加入适量DCM溶涨约30min。称取2.9g的Fmoc-Leu-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，加入1/3总体积量的DIPEA(1.4mL)于上述氨基酸溶液中，搅拌均匀，冰水浴10～15min。待树脂溶涨结束后，抽掉DCM，将溶解好的保护氨基酸料液倒入反应器中，反应10～
15min后，加入2/3总体积的DIPEA(2.85mL)，室温反应3～4h。反应结束后，抽掉反应液，加入适量DMF洗涤3次，加入体积之比为17∶2∶1的DCM、甲醇、DIPEA的混合溶液封闭未反应的基团，封闭两次，每次约20min。封闭结束后，加入适量体积的DMF洗涤3次，再用无水甲醇洗涤收缩2次，每次约10分钟。真空干燥，得到约Fmoc-Leu-CTC树脂4.6g，测得替代度为0.52mmol/g。

[0063] 称取Fmoc-Leu-CTC Resin 3.5g(1.82mmol，0.52mmol/g)于反应器中，加入适量DCM溶涨约30min，抽掉。加入适量的20％哌啶/DMF溶液脱保护2次，第一次为10min，第二次为20min，两次脱保护之间需加入适量DMF洗涤。脱完保护后再用适量DMF洗涤5次，每次洗涤1min。Kaiser法检测，树脂呈深蓝色，表明Fmoc已脱除。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH 1.1g，HOBt 0.6g置烧杯中，加入适量DMF溶解，将烧杯放入冰浴中冰浴约5min，再加入DIC 1.3mL到溶液中，冰浴活化10～15min后加入反应器中，室温反应2～3h。反应2h后，Kaiser法检测，若观察到树脂和溶液都显浅黄色，则表明反应已经完全，若反应3h后，Kaiser法检测7
树脂仍呈蓝色，则需重复偶联。根据[Cys]-比伐卢定的序列，从C端到N端，重复以上操作步骤，依次偶联完最后一个氨基酸Fmoc-D-Phe-OH并脱除N-末端的Fmoc保护基团后得到
7
全保护[Cys]-BVLD-肽树脂：D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-CTC树脂。将肽树脂干燥后得16g。将肽树脂加入到预先冰冻的150mL裂解液中(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚＝90/5/3/2)，室温裂解约2.5小时，然后过滤并在冷冻的无水乙醚
7
中沉降。离心，洗涤，真空干燥约14h，得到[Cys]-BVLD的粗肽3.2g。上述所得的粗肽经
7
HPLC纯化，冻干后得[Cys]-BVLD1.4g，纯度96％，总收率34％。

[0064] 称取[Cys]7-比伐卢定220mg，溶于纯水中，用碳酸氢钠调节pH到7～8，加入mPEG2000-MAL 600mg，室温 反应2小时，用RP-HPLC分离 产物，冻干后 得
7
[Cys(mPEG2000-MAL)]-BVLD 294mg，纯度大于95％，收率70％。

[0065] [Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD经MALDI-TOF-MS分析，发现在4232附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Asp，1.99(2)；Glu，4.11(4)；Pro，
3.09(3)；Arg，0.96(1)；Gly，4.21(4)；Tyr，1.07(1)；Phe，1.92(2)；Ile，0.99(1)；Leu，
0.98(1)。

[0066] 实施例2[Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD的制备

[0067] 称取mPEG5000-OH 25g(5mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷100mL，固体溶解后再加入三乙胺7.5mL(5mmol)和对甲苯磺酰氯9.5g(Ts-Cl，50mmol)，室温搅拌反应。TLC检测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加入150mL无水乙醚沉淀出固体，再加水将固体溶解，分液，分出水层，用无水乙醚100mL洗涤2次，水相再用二氯甲烷150mL萃取2次，收集有机相，干燥过夜。旋蒸除去溶剂，加无水乙醚沉降出固体，过滤，干燥后得到mPEG5000-OTs 21.6g，收率86％。

[0068] 将mPEG5000-OTs 20g(4mmol)溶于30mL DMF，加入的邻苯二甲酰亚胺钾盐2.2g(12mmol)，氮气保护下，120℃反应4h。减压旋蒸除去溶剂，加入无水乙醇，加入水合肼
2.0mL，加热回流4h。减压旋蒸除去溶剂，加入二氯甲烷100mL，滤去不溶物，用饱和NaCl溶液50mL洗三次，无水Na2SO4干燥12h，滤去干燥剂，减压旋蒸除去溶剂，乙醚沉降，抽滤，干燥，得mPEG5000-NH217.5g，收率82％。

[0069] 将mPEG5000-NH215g(3mmol)溶于30mL DMF中，加入马来酸酐1.25g，80℃搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，乙醚沉降，滤集固体，干燥后得13.8g。将固体溶于30mL乙酸酐，加入无水乙酸钠5g，100℃搅拌反应45min。滤除反应液中的固体，向反应液中加入10倍体积的水，然后用二氯甲烷萃取水相三次，有机相经饱和氯化钠溶液洗三次后，无水Na2SO4干燥12h。过滤，减压旋蒸除去溶剂，乙醚沉降，离心，抽滤，干燥得mPEG5000-MAL 12.6g，收率
80％。

[0070] 称取[Cys]7-比伐卢定220mg，溶于纯水中，用碳酸氢钠调节pH到7～8，加入mPEG5000-MAL 1.25g，室温 反应3小时，用RP-HPLC分离 产物，冻干后 得
7
[Cys(PEG5000-MAL)]-BVLD 587mg，纯度大于95％，收率81％。

[0071] [Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD经MALDI-TOF-MS分析，在7322附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Asp，2.00(2)；Glu，4.31(4)；Pro，3.18(3)；Arg，1.03(1)；Gly，4.13(4)；Tyr，1.02(1)；Phe，1.82(2)；Ile，1.06(1)；Leu，1.03(1)。

[0072] 实施例3[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD的制备

[0073] 称取mPEG10000-OH 25g(2.5mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷100mL，固体溶解后再加入三乙胺3.75mL(2.5mmol)和对甲苯磺酰氯4.75g(Ts-Cl，25mmol)，室温搅拌反应。TLC检测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加入150mL无水乙醚沉淀出固体，再加水将固体溶解，分液，分出水层，用无水乙醚100mL洗涤2次，水相再用二氯甲烷150mL萃取2次，收集有机相，干燥过夜。旋蒸去溶剂，加无水乙醚沉降出固体，过滤，干燥后得到mPEG10000-OTs
24g，收率92％。

[0074] 将mPEG10000-OTs 20g(2mmol)溶于30mL DMF，加入的邻苯二甲酰亚胺钾盐1.1g(6mmol)，氮气保护下，120℃反应4h。减压旋蒸除去溶剂，加入无水乙醇，加入水合肼
1.0mL，加热回流4h。减压旋蒸除去溶剂，加入二氯甲烷100mL，滤去不溶物，用饱和NaCl溶液50mL洗三次，无水Na2SO4干燥12h，滤去干燥剂，减压旋蒸除去溶剂，乙醚沉降，抽滤，干燥，得mPEG10000-NH217.2g，收率86％。

[0075] 将mPEG10000-NH215g(1.5mmol)溶于30mL DMF中，加入马来酸酐0.625g，80℃搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，乙醚沉降，滤集固体，干燥后得14.5g。将固体溶于30mL乙酸酐，加入无水乙酸钠2.5g，100℃搅拌反应45min。滤除反应液中的固体，向反应液中加入10倍体积的水，然后用二氯甲烷萃取水相三次，有机相经饱和NaCl溶液洗三次后，无水Na2SO4干燥12h。过滤，减压旋蒸除去溶剂，乙醚沉降，离心，抽滤，干燥得mPEG10000-MAL 13.6g，收率90％。

[0076] 称取[Cys]7-BVLD 110mg，溶于 纯水中，用碳 酸氢钠 调节pH到7～ 8，加 入mPEG10000-MAL 1.0g，室 温 反 应3小 时，用RP-HPLC 分 离 产 物，冻 干 后 得7
[Cys(PEG10000-MAL)]-BVLD 1065mg，纯度大于95％，收率89％。

[0077] [Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD经MALDI-TOF-MS分析，在11973附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Asp，1.95(2)；Glu，4.06(4)；Pro，2.92(3)；Arg，0.96(1)；Gly，4.21(4)；Tyr，1.06(1)；Phe，1.92(2)；Ile，1.01(1)；Leu，0.97(1)。

[0078] 实施例4比伐卢定-聚乙二醇复合物的抗凝活性评价

[0079] 4.1凝血酶原时间(PT)的测定

[0080] 将PT试剂和受检血浆，置37℃水浴中预温5min。取试管1支，加入受检血浆0.1mL，37℃水浴中预温30s，再加入预温的PT试剂0.2mL，混匀，立即启动秒表计时。不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，记录所需时间。重复3次，取平均值，同时作正常对照。

[0081] 将PT试剂和受检血浆，置37℃水浴中预温5min。取试管1支，加入受检血浆0.1mL，并加入一定量的比伐卢定或其修饰物使其终浓度如下表所示，37℃水浴中预温30s，再加入预温的PT试剂0.2mL，混匀，立即启动秒表计时。不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，记录所需时间。重复3次，取平均值。

[0082] PT实验结果表明比伐卢定-聚乙二醇复合物均具有良好的抗凝效果，其中7 7
[Cys(mPEG5000-MAL)]-BVLD和[Cys(mPEG10000-MAL)]-BVLD抗凝效果优于比伐卢定，且差异在3s以上，具有统计学意义(表1)。

[0083] 表1比伐卢定-聚乙二醇复合物的PT实验结果(正常对照平均值：27.4s)[0084]

[0085] 4.2血浆凝血酶时间(TT)测定

[0086] 取受检血浆0.1mL于试管中，加入一定量的比伐卢定或其修饰物，置37℃水浴中，预温5min，再加入25U/mL的凝血酶试剂，同时启动秒表记录血浆凝固时间，重复3次，取平均值，作为正常对照。

[0087] 取受检血浆0.1mL于试管中，加入一定量的比伐卢定或其修饰物使其终浓度如下表所示，置37℃水浴中，预温5min，再加入0.1mL标准化“凝血酶”试剂，同时启动秒表记录血浆凝固时间，重复3次，取平均值。

[0088] TT实验结果表明比伐卢定-聚乙二醇复合物保持有良好的抗凝效果，其中7 7
[Cys(mPEG2000-MAL)]-BVLD和[Cys(mPEG5000-MAL)]-BVLD抗凝效果优于比伐卢定，且差异在3s以上，具有统计学意义(表2)。

[0089] 表2比伐卢定-聚乙二醇复合物的TT实验结果(正常对照平均值：18.0s)[0090]

[0091] 4.2血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)测定

[0092] 取APTT反应液0.1mL和血浆0.1mL，并加入5μL生理盐水，置37℃水浴中预温3min。再加入预温的APTT催化剂0.1mL，混匀，立即启动秒表计时。不断地倾斜试管至有絮状沉淀生成时，记录所需时间。重复2次，取平均值，同时作正常对照。

[0093] 取APTT反应液0.1mL和受检血浆0.1mL于塑料离心管中，并加入5μL的比伐卢定及其修饰物至其终浓度为下表中所示，置37℃水浴中预温3min。再加入预温的APTT催化剂0.1mL，混匀，立即启动秒表计时。不断地倾斜试管至有絮状沉淀生成时，记录所需时间。重复2次，取平均值。

[0094] 表3比伐卢定及其修饰物的APTT实验结果(正常对照平均值：33.6s)

[0095]

[0096] 在比伐卢定-聚乙二醇复合物都保持了抗凝活性的基础上，基于聚乙二醇修饰药物研究的已有知识可以推知比伐卢定的聚乙二醇修饰会延长其半衰期。