基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽及其应用

摘要

本发明涉及一种基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽(LRMs)具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，可以降低CpG DNA攻击小鼠的血清TNF-α浓度，提高被攻击小鼠生存率，其可用于制备防治细菌脓毒症药物。本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段LRR11及基于LRR11的新型多肽(LRMs)还具有缓解类风湿关节炎大鼠关节病变症状的作用，其可用于制备防治类风湿关节炎药物。

权利要求

1.一种基于人TLR9受体功能区片段LRR11的多肽，其特征在于，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的基于人TLR9受体功能区片段LRR11的多肽在制备防治细菌脓毒症药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。

4.权利要求1所述的基于人TLR9受体功能区片段LRR11的多肽在制备防治类风湿关节炎药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述注射剂经肌肉、静脉、皮下注射或关节腔内局部注射给药。

说明书

基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型多肽及其应用，具体地说，涉及一种基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽及其应用。

背景技术

[0002] 炎症是由大量炎性细胞产生的介质参与的复杂现象，其中值得注意的是细胞因子的作用。细胞因子是由机体的免疫细胞及非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽类因子，它既是机体应激反应的需要，又是应激组织损伤发生和发展的病理基础。由单核/吞噬细胞分泌的细胞因子包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白细胞介素(interleukin，IL)等，广泛参与多种炎症反应过程，如细菌性感染因素引起的脓毒症(Sepsis)和自身免疫缺陷引起的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)。

[0003] 脓毒症(sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合症(Systemic inflammatory response sydrome，SIRS)，病死率高达50％-60％，至今尚无有效治疗药物。大量研究表明，细菌菌体上或菌体内的病原分子通过被机体免疫细胞，尤其是单核/吞噬细胞系统相关模式识别受体识别，激活单核/吞噬细胞系统大量释放TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等多种炎性细胞因子，导致脓毒症的发生。

[0004] 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的以关节病变为主自身免疫性疾病，临床表现为关节疼痛肿胀、功能下降，致残率高达40％以上。RA的发病机制与多种因素有关，细菌或病毒的感染可能是诱发类风湿关节炎的首要因素，机体免疫机制尤其是细胞免疫在类风湿性关节炎发病机制起着突出作用，在炎症部位的关节积液和滑膜组织中，可检测到大量T淋巴细胞和单核/吞噬细胞产生的多种细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5IL-6、IL-8、IFN等。大量研究表明，TNF-α是RA免疫反应及病理过程中的关键因子。RA病人TNF-α水平明显高于正常对照，与疾病的活动期呈正相关，同时TNF-α水平也可在病变关节滑膜液中升高。体外实验证明TNF-α在免疫级联反应中通过促进IL-1和其他细胞因子分泌，以及刺激免疫细胞活化，最终导致关节软骨和骨质的破坏。

[0005] 综上所述，脓毒症和类风湿关节炎发病机制中TNF-α等炎性细胞因子发挥了重要作用，因此寻找能够特异抑制TNF-α等释放的药物，对于防治脓毒症和类风湿关节炎具有重要意义。

[0006] 细菌菌体上或菌体内的病原分子主要包括内毒素(lipopolysacchride，LPS)、肽聚糖(peptidoglycan，PG)、细菌DNA(CpG DNA)等，识别LPS、PG、CpG DNA等病原分子的模式识别受体是Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)。目前认为，CpG DNA在革兰阳性菌或革兰阴性菌所引起的感染和炎症反应中均起着重要作用，而TLR9是CpG DNA的模式识别受体。TLR9为I型跨膜受体，由胞外区、跨膜区和胞内区组成，胞外区结构域有25个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)，与识别CpG DNA有关，目前发现，其中最有可能的与CpG DNA结合有关的关键位点的是LRR2、LRR5、LRR8和LRR11。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽(LRMs)，其具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，可以降低CpG DNA攻击小鼠的血清TNF-α浓度，提高被攻击小鼠生存率。

[0008] 本发明提供的基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽(LRMs)，其具有抑制TNF-α等细胞因子释放的作用，可以缓解RA模型大鼠关节病变症状，提高大鼠生存质量。

[0009] 为实现本发明的目的，本发明提供的基于人TLR9受体功能区片段LRR11及基于LRR11的新型突变多肽(LRMs)，具有LRR11及SEQ ID NO：1-10所示氨基酸序列中的至少一种：

[0010] QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRR11

[0011] QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM1

[0012] QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM2

[0013] QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM3

[0014] QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM4

[0015] QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLV；LRM5

[0016] QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM6

[0017] QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM7

[0018] QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM8

[0019] QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM9

[0020] QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLV；LRM10

[0021] 基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0022] 本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段LRR11及基于LRR11的新型突变多肽(LRMs)具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，可以降低CpG DNA攻击小鼠的血清TNF-α浓度，提高被攻击小鼠生存率，其可用于制备防治细菌脓毒症药物。所述药物优选为注射剂。

[0023] 本发明所述的一种基于人TLR9受体功能区片段LRR11及基于LRR11的新型突变多肽(LRMs)还具有缓解类风湿关节炎大鼠关节病变症状的作用，其可用于制备防治类风湿关节炎药物。所述药物优选为注射剂，所述注射剂可以经肌肉、静脉、皮下注射或关节腔内局部注射给药。

[0024] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

[0025] 图1表示LRR多肽(200μM)与CpG DNA 2006的结合能力测定；

[0026] 图2表示LRR多肽(0.15μM、0.45μM、1.5μM)对CpG DNA(1.5μM)刺激小鼠腹* **腔巨噬细胞释放TNF-α的影响，p＜0.05，p＜0.01vsCpG DNA组。

具体实施方式

[0027] 下面实施例为进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

[0028] 为了获得基于人TLR9受体功能区片段LRR11及基于LRR11的新型突变多肽(LRMs)，发明人从人TLR9受体功能区的结构入手进行。

[0029] 人TLR9受体为I型跨膜受体，由1032个氨基酸残基组成，分为胞外区(aa 1～818)、跨膜区(aa 819～839)和胞内区(aa 840～1032)。其中，胞外区由信号肽(aa 1～
25)和25个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats，LRRs，aa 26～818)组成，与识别、结合配体有关；胞内区则含有TIR同源区(Toll/IL-1receptor domain，TIR)，TIR能够招募衔接蛋白MyD88及其它含有TIR结构域的衔接蛋白，激活MyD88依赖的信号转导通路，最终活化核转录因子NFκB和AP-1，导致细胞因子的大量释放，这也是脓毒症产生的分子机制。

[0030] 对人TLR9受体一级结构的分析表明，TLR9胞外段含有25个LRRs；空间构象分析表明：TLR9胞外段25个LRRs形成一个马蹄形弯曲的螺线管结构，内径约5nm，外径约8nm，形成较大的空间。其中LRR2、LRR5、LRR8、LRR11后跟随的氨基酸序列在TLR9胞外段马蹄形凹面形成环状结构，推测可能与TLR9结合CpG DNA有关。理论上说，如果有药物可以干扰CpG DNA与TLR9结合位点的结合，将能够抑制CpG DNA介导的信号转导，抑制炎症因子释放，治疗细菌脓毒症。

[0031] 发明人合成了LRR2、LRR5、LRR8、LRR11的多肽，利用生物传感器技术分别与CpG DNA 2006(5′-TCG TCG TTA AGT CGT TAAGTC GTT-3′)进行了亲和力测定，结果显示LRR11与CpG DNA结合能力最高，亲和峰值达4000arc second(角秒或者弧度/秒)，Kd值为13.2μM；LRR2、LRR5与CpG DNA亲合力相对较低，约在500arc second；LRR8与CpG DNA几无结合能力。我们初步认为LRR11最有可能是CpG DNA的结合位点，并进行了一系列功能实验。

[0032] 首先，发明人发现LRR11多肽量效依赖性抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α。LRR11多肽与CpG DNA(1.5μμM)按摩尔浓度比分别为0.1∶1、0.3∶1和1∶1混合后，在摩尔比为0.1∶1时，LRR11多肽(0.15μμM)对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α无抑制作用；在摩尔比为0.3∶1和1∶1时，LRR11多肽对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α有显著抑制作用，并且具有明显的量效依赖性。

[0033] 在体外实验的基础上，发明人发现LRR11多肽可降低CpG DNA攻击小鼠动物死亡率，并降低血清TNF-α水平。小鼠先腹腔注射D-氨基半乳糖溶液(600mg/kg)进行敏化，1h后取出小鼠，先尾静脉注射CpG DNA(4mg/kg)，然后立即尾静脉注射LRR11(3mg/kg)，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，测定TNF-α释放水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRR11可明显降低CpG DNA攻击小鼠动物死亡率，并可明显降低血清TNF-α水平。

[0034] 发明人进一步发现LRR11多肽可降低热灭活大肠杆菌(含有天然CpG DNA)攻击小鼠动物死亡率，并降低血清TNF-α水平。先尾静脉注射热灭活大肠杆菌，然后立即尾静脉注射LRR11，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，测定TNF-α释放水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRR11可明显降低热灭活大肠杆菌攻击小鼠动物死亡率，并可一定程度降低血清TNF-α水平。

[0035] 发明人还发现LRR11多肽可明显减轻II型胶原皮内注射诱导形成的RA模型大鼠踝关节肿胀程度，对RA模型大鼠具有一定的保护作用。

[0036] 在上述工作基础上，发明人拟采用生物信息学技术和定点突变技术对LRR11多肽进行结构改造，以获得作用更强的LRR11新型多肽。

[0037] 结合国内外文献和生物信息学分析，发明人推测LRR11多肽序列中含有的5个碱性氨基酸最可能与TLR9结合CpG DNA结构域功能相关。将其中一个位点突变后并人工合成了突变多肽LRM1(多肽序列为QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV)，功能实验表明LRM1具有较LRR11更强的抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，体内实验结果也表明LRM1较LRR11对CpG DNA攻击小鼠的保护作用更强。该结果初步证实了研究人员的推测，即上述几个碱性氨基酸位点与其功能密切相关。筛选基于上述几个碱性氨基酸位点的一系列LRR11突变体(LRMs)，可以获得具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α作用的新型多肽序列。

[0038] 发明人经过筛选，获得了LRR11及10条基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽(LRMs)，其氨基酸序列如下：

[0039] QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0040] QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0041] QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0042] QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0043] QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0044] QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLV；

[0045] QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0046] QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0047] QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0048] QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLV；

[0049] QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLV。

[0050] 本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽可采用本领域常规方法合成，比如固相Fmoc法(具体请参照实施例2)。

[0051] 实施例1通过生物信息学技术和基因定点突变技术，获取基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽基因序列及其编码的氨基酸序列

[0052] 1、从Genbank数据库中获取人TLR9受体(Toll-like receptor 9，简称TLR9)基因序列(Genbank Accession Number：NM_017442)。

[0053] 2、采用生物信息学技术结合文献分析，从人TLR9受体胞外段中获得4条LRR序列(leucine-rich repeats)，分别为LRR2(SLRHLNLKWNCPPVGLSPMHFPCHMTIEPSTFLAVP)、LRR5(ALRFLFMDGNCYYKNPCRQALEVAPGALLGLG)、LRR8(ALRVLDVGGNCRRCDHAPNPCMECPRHFPQLHPDTFSHLS)、LRR11(QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV)，这4条LRR序列后跟随的氨基酸序列在TLR9胞外段马蹄形凹面形成环状结构，推测可能与TLR9结合CpG DNA有关。

[0054] 3、人工合成了LRR2、LRR5、LRR8、LRR11多肽。生物传感器的生物素样品池上CpG DNA 2006(5′-TCG TCG TTA AGT CGT TAAGTC GTT-3′)的包被按照Thermo公司样品池包被流程进行。应用生物传感器技术检测LRR2、LRR5、LRR8、LRR11多肽与CpG DNA的结合能力。结果显示LRR11与CpG DNA结合能力最高，亲和峰值达4000arc second，Kd值为13.2μM；LRR2、LRR5与CpG DNA亲合力相对较低，约在500arc second；LRR8与CpG DNA几无结合能力(图1)。

[0055] 4、采用小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒ELISA法测定LRR2、LRR5、LRR8、LRR11多肽对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的影响。LRR多肽与CpG DNA(1.5μM)按摩尔浓度比分别为0.1∶1、0.3∶1和1∶1混合后，在摩尔比为0.1∶1时，LRR多肽(0.15μM)对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α无抑制作用(p＞0.05)；在摩尔比为0.3∶1和1∶1时，LRR2多肽对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α有显著抑制作用(p＜0.05)，LRR11多肽抑制作用更为显著(p＜0.01)，而LRR5、LRR8多肽则无抑制作用。结果说明LRR5和LRR8多肽在各个浓度对CpGDNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α均无抑制作用，LRR2和LRR11多肽均能显著抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α，呈量效关系(图2)。

[0056] 5、采用CpG DNA攻击小鼠模型观察LRR11多肽对小鼠的保护作用。小鼠先腹腔注射D-氨基半乳糖溶液(600mg/kg)进行敏化，1h后取出小鼠，先尾静脉注射CpG DNA(4mg/kg))，然后立即尾静脉注射LRR11(3mg/kg)，对照组给予无菌生理盐水(NS)，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，4000rpm离心5min，取上清-20℃保存，待测TNF-α释放水平。
生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRR11可明显降低CpG DNA攻击小鼠动物死亡率(表1)，并可明显降低血清TNF-α水平(表2)。

[0057] 表1.LRR11对CpG DNA攻击小鼠的保护作用

[0058]

[0059] 表2.LRR11可降低CpG DNA攻击小鼠血清TNF-.α水平

[0060]

[0061] 6、采用热灭活大肠杆菌攻击小鼠模型观察LRR11多肽对小鼠的保护作用。先尾静脉注射热灭活大肠杆菌，然后立即尾静脉注射LRR11，对照组给予无菌生理盐水(NS)，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，4000rpm离心5分钟，取上清-20℃保存，待测TNF-α释放水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRR11可明显降低热灭活大肠杆菌攻击小鼠动物死亡率(表3)，并可一定程度降低血清TNF-α水平(表4)。

[0062] 表3.LRR11对热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护作用

[0063]

[0064] 表4.LRR11可降低热灭活大肠杆菌攻击小鼠血清TNF-.α水平

[0065]

[0066] 7、采用II型胶原皮内注射诱导大鼠RA模型，观察LRR11多肽对RA模型大鼠的保护作用。将乳化的II型胶原以7ml/kg的剂量在大鼠的背部或尾根部进行多点皮内注射，一周后加强免疫一次，诱导RA模型形成。选取肿胀度大于50％的大鼠，随机分组后于大鼠右后踝关节滑囊局部注射LRR11多肽，对照组给予注射用生理盐水(NS)。用游标卡尺测量大鼠右后踝关节前后径与左右径之和，从而分别计算肿胀度。结果显示，LRR11多肽治疗组大鼠踝关节肿胀程度较对照组明显减轻(表5)。上述治疗效果不仅在LRR11关节腔注射中被观察到，在LRR11经肌肉注射(im)、静脉注射(iv)或皮下注射(ihyp)等全身给药方式中也可观察到类似治疗效果(表6)。

[0067] 表5.LRR11关节囊局部给药对II型胶原诱导的RA模型大鼠的保护作用[0068]

[0069] 表6.LRR11全身给药对II型胶原诱导的RA模型大鼠的保护作用

[0070]

[0071]

[0072] 8、采用生物信息学技术分析，发明人发现LRR11中含有5个碱性氨基酸位点，分别为：3-R、4-K、13-K、14-R及19-H，这5个位点很可能是LRR11关键功能位点。对上述位点进行单位点突变和多位点组合突变，设计获得LRR11及10条基于LRR11的新型多肽(LRMs)。

[0073] 序列如下：

[0074] QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRR11

[0075] QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM1

[0076] QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM2

[0077] QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM3

[0078] QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM4

[0079] QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLV；LRM5

[0080] QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM6

[0081] QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM7

[0082] QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM8

[0083] QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLV；LRM9

[0084] QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLV；LRM10

[0085] 实施例2新型多肽的合成方法

[0086] 本发明所述的方法采用固相Fmoc法，简单地说，是固相支持物上被Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的单体氨基酸去保护后暴露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将后者连接到固相支持物上，使肽链从C-端向N-端延伸。

[0087] 1、基本材料：

[0088] (1)固相支持物与连接分子：固相FMOC法通常选择的支持物为羧基树脂如王氏树脂。载体树脂的溶胀状况对缩合试剂及羧基组分的自由扩散，对肽链之间的聚集等与缩合反应有关的因素有明显影响。采用1％～2％交联度的王氏树脂，可以使载体有较好的溶胀性，且有较大的网络空间足以容纳不断增长的肽链，而且利于反应物在载体中扩散。羧基树脂通常采用二环己基碳二亚胺(DCC)或羧基二咪唑作为连接分子，使反应溶液中被保护的氨基酸与其形成共价键，从而固定到树脂上。

[0089] (2)单体：合成所用单体为经化学修饰的α-氨基酸，含下面几个功能基团。

[0090] ①α-氨基上9-芴甲氧羰基(Fmoc)，保护基，缩合前脱去。

[0091] ②羧基上酯基，保护基，缩合前脱去。

[0092] ③精氨酸侧链上金刚烷氧羰基(Adoc)，保护基，肽链裂解时脱去。

[0093] ④组氨酸咪唑环上2，2，2-三氟-1-苄氧羰基，保护基，肽链裂解时脱去。

[0094] 2、反应步骤：

[0095] 合成的第一步，将第一个氨基酸共价连接到固相支持物上。加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使被保护氨基酸的羧基端与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定。

[0096] 合成的第二步，去保护。采用碱性溶剂如哌啶-CH2Cl2或哌啶-DMF去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。

[0097] 合成的第三步，激活和交联。采用活化剂DCC暴露出下一个氨基酸的羧基，活化的单体与固相支持物上游离的氨基反应交联，形成肽键。

[0098] 重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，直到合成完成。

[0099] 3、合成后处理：

[0100] (1)洗脱和脱保护：用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从固相支持物上洗脱下来，并脱除保护基。

[0101] (2)粗品的HPLC分析：采用HPLC法分析粗品纯度，分析柱粒径3-10μm，在几分钟内即可分析粗品纯度。

[0102] (3)纯化：反相HPLC法纯化粗品。多肽通过疏水作用连到柱填料上，渐次降低离子强度进行洗脱。

[0103] (4)定量：采用紫外分光光度法测定多肽紫外吸收来定量。

[0104] (5)冻干：洗脱下来的多肽用冷冻干燥机进行冻干处理，可延长保存时间。

[0105] (6)储存：冻干的多肽可以在-70℃条件下可以保存一年以上。需要注意的是避免紫外线等剧烈的物理环境，避免反复冻融。

[0106] 实施例310条LRMs新型多肽抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子的活性鉴定

[0107] 分离并培养小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为1×106/ml，加入48孔板内，每孔400μl，置37℃CO2孵箱培养6h。预先将LRMs多肽与CpG DNA按照1∶1比例混合，加入培养孔内(CpG DNA终浓度1.5μM)，在37℃CO2孵箱培养4h。取培养上清，采用小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒ELISA法测定细胞培养上清终TNF-α的浓度，明确上述10条LRMs多肽抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子的能力。此次实验结果表明上述10条LRMs多肽均有不同程度抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子的能力(见下表7)。

[0108] 表7.LRMs对CpG DNA诱导小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的影响

[0109]

[0110]

[0111] *p＜0.05，**p＜0.01vs CpGDNA

[0112] 实施例410条LRMs新型多肽对CpG DNA攻击脓毒症模型小鼠的保护作用[0113] 清洁级昆明种小白鼠120只(第三军医大学实验动物中心提供)，体重20±0.5g/只，雌雄各半，随即分为对照组、CpG DNA攻击组、LRM1+CpG DNA组、LRM2+CpG DNA组、LRM3+CpG DNA组、LRM4+CpG DNA组、LRM5+CpG DNA组、LRM6+CpG DNA组、LRM7组+CpG DNA组、LRM8组+CpG DNA组、LRM9组+CpG DNA组、LRM10组+CpG DNA组。小鼠先腹腔注射D-氨基半乳糖溶液(600mg/kg)进行敏化，1h后取出小鼠，先尾静脉注射CpG DNA(4mg/kg)，对照组给与注射用生理盐水，其余组尾静脉注射LRMs新型多肽(3mg/kg)，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，4000rpm离心5min，取上清-20℃保存，待测血清TNF-α水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，10条LRMs新型多肽可不同程度地降低CpG DNA攻击小鼠动物死亡率(表8)，并可明显降低血清TNF-α水平(表9)，其中以LRM1和LRM6保护作用最强。上述治疗效果不仅在静脉注射中，而且在经肌肉注射或皮下注射中也被观察到。

[0114] 表8.LRMs对CpG DNA攻击小鼠的保护作用

[0115]

[0116] 表9.LRMs可降低CpG DNA攻击小鼠血清TNF-α水平

[0117]**

[0118] p＜0.01vs CpG DNA

[0119] 实施例510条LRMs新型多肽对CpG DNA诱导的大鼠膝关节滑膜细胞释放细胞因子的影响3

[0120] 无菌取出大鼠双侧膝关节滑膜组织，剪成1～2mm 大小，贴壁法培养。每隔1～2d换培养液1次，待滑膜成纤维细胞长出组织块较多后，弃除组织块，待细胞长满后，用胰酶消化细胞传代培养2次后进行实验。

[0121] 调整细胞悬液浓度为1×106/ml，加入48孔板内，每孔400μl，置37℃CO2孵箱培养6h。预先将LRMs多肽与CpG DNA按照1∶1比例混合，加入培养孔内(CpG DNA终浓度1.5μM)，在37℃CO2孵箱培养4h。取培养上清，采用小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒ELISA法测定细胞培养上清终TNF-α的浓度，明确上述10条LRMs多肽抑制CpG DNA刺激大鼠膝关节滑膜细胞释放细胞因子的能力。此次实验结果表明上述10条LRMs多肽均可明显抑制CpG DNA刺激大鼠膝关节滑膜细胞释放细胞因子的能力(见下表10)。

[0122] 表10.LRMs对CpG DNA诱导大鼠膝关节滑膜细胞释放TNF-α的影响[0123]

[0124]

[0125] *p＜0.05，**p＜0.01vs CpG DNA

[0126] 实施例610条LRMs新型多肽对II型胶原诱导的类风湿关节炎模型大鼠的保护作用

[0127] 清洁级近交系wistar大白鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，体重150士10g，雌性。首先建立II型胶原诱导的RA大鼠模型：将乳化的II型胶原以7ml/kg的剂量在大鼠的背部或尾根部进行多点皮内注射，一周后加强免疫一次，同样在背部或尾根部多点皮内注射乳化的II型胶原，剂量为3ml/kg。用游标卡尺测量大鼠右后踝关节前后径与左右径之和，从而分别计算肿胀度，计算公式为：(发病后所测值-发病前所测值)/发病前所测值×100％。选取55只肿胀度大于50％的大鼠，随机分为对照组和LRM1～LRM10治疗组，每组5只。LRM1～LRM10治疗组分别于大鼠右后踝关节滑囊局部注射LRM1～LRM10多肽(3mg/kg)，对照组给予注射用生理盐水，给药后每8h加强注射一次，剂量与第一次给药相同。给药3天后用游标卡尺测量大鼠右后踝关节前后径与左右径之和，计算保护率(消肿度)，计算公式为：(给药前所测值-给药后所测值)/给药前所测值×100％。结果显示，LRM1～LRM10多肽治疗组大鼠踝关节肿胀程度较对照组均有一定程度减轻，其中以LRM1、LRM2、LRM6和LRM7治疗效果较强。上述结果提示，LRM1～LRM10多肽对RA模型大鼠具有治疗作用，可减轻其关节肿胀程度，提高实验动物生存质量(表11)。上述治疗效果不仅在LRMs关节腔注射中被观察到，在LRMs经肌肉注射、静脉注射或皮下注射等全身给药方式中也可观察到类似治疗效果。

[0128] 表11.LRMs对II型胶原诱导的RA模型大鼠的保护作用

[0129]

[0130]

[0131] 实施例710条LRMs新型多肽对CpG DNA皮下注射诱导的类风湿关节炎模型大鼠的保护作用

[0132] 清洁级近交系wistar大白鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，体重150士10g，雌性。首先建立CpG DNA1826诱导的大鼠RA模型：大鼠于右后足跖皮下注射CpG DNA1826(1mg/kg)，一周后加强免疫一次，诱发AA发生。用游标卡尺测量大鼠右后踝关节前后径与左右径之和，从而分别计算肿胀度，计算公式为：(发病后所测值-发病前所测值)/发病前所测值×100％。选取55只肿胀度大于50％的大鼠，随机分为对照组和LRM1～LRM10治疗组，每组5只。LRM1～LRM10治疗组分别于大鼠右后踝关节滑囊局部注射LRM1～LRM10多肽(3mg/kg)，对照组给予注射用生理盐水，给药后每8h加强注射一次，剂量与第一次给药相同。给药3天后用游标卡尺测量大鼠右后踝关节前后径与左右径之和，计算保护率(消肿度)，计算公式为：(给药前所测值-给药后所测值)/给药前所测值×100％。结果显示，LRM1～LRM10多肽治疗对CpG DNA诱导的类风湿性关节炎大鼠有更好的保护作用，大鼠踝关节肿胀程度较对照组均明显减轻，其中仍以LRM1、LRM2、LRM6和LRM7治疗效果较强(表12)。
上述治疗效果不仅在LRMs关节腔注射中被观察到，在LRMs经肌肉注射、静脉注射或皮下注射等全身给药方式中也可观察到类似治疗效果。

[0133] 表12.LRMs对CpG DNA皮下注射诱导的RA模型大鼠保护作用

[0134]

[0135] 实施例810条LRMs新型多肽对CpG DNA关节腔内局部注射诱导的类风湿关节炎模型大鼠的保护作用

[0136] 清洁级近交系wistar大白鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，体重150士10g，雌性。首先建立CpG DNA1826诱导的大鼠RA模型：大鼠于右后踝关节腔内单次注射CpG DNA1826(0.3mg/kg)，诱发AA发生。用游标卡尺测量大鼠右后踝关节前后径与左右径之和，从而分别计算肿胀度，计算公式为：(发病后所测值-发病前所测值)/发病前所测值×100％。选取55只肿胀度大于50％的大鼠，随机分为对照组和LRM1～LRM10治疗组，每组5只。LRM1～LRM10治疗组分别于大鼠右后踝关节滑囊局部注射LRM1～LRM10多肽(3mg/kg)，对照组给予注射用生理盐水，给药后每8h加强注射一次，剂量与第一次给药相同。给药3天后用游标卡尺测量大鼠右后踝关节前后径与左右径之和，计算保护率(消肿度)，计算公式为：(给药前所测值-给药后所测值)/给药前所测值×100％。结果显示，LRM1～LRM10多肽治疗对CpG DNA关节腔内局部注射诱导的类风湿性关节炎大鼠同样有良好的保护作用，保护效果较CpG DNA皮下注射诱导的类风湿关节炎模型保护效果更加明显，其中LRM1、LRM2、LRM3、LRM4、LRM6、LRM7和LRM9治疗效果均达到30％以上(表13)。上述治疗效果不仅在LRMs关节腔注射中被观察到，在LRMs经肌肉注射、静脉注射或皮下注射等全身给药方式中也可观察到类似治疗效果。

[0137] 表13.LRMs对CpG DNA关节腔内局部注射诱导的RA模型大鼠的保护作用[0138]

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