H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒。该试剂盒可用于检测或辅助检测H5亚型禽流感病毒抗血清，所述试剂盒中含有独立包装的如下a)或b)的蛋白作为检测抗原：a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。实验证明，本发明的试剂盒可特异地检测含有H5亚型禽流感病毒的待测动物抗血清，灵敏度达1∶800，准确率达92％以上，适用于检测鸡、鸭、鹅、野鸟、猪、牛和人等来源的H5亚型禽流感病毒抗血清，既可用于H5亚型禽流感的早期诊断，又可用于抗体监测，在生产实际中的流行病学调查和抗体监测方面非常实用。

权利要求

1.一种检测或辅助检测待测动物H5亚型禽流感病毒抗血清的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有独立包装的由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质为在序列表序列2所示氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有独立包装的包被液和/或独立包装的PBST缓冲液和/或独立包装的封闭液和/或独立包装的样品稀释液和/或独立包装的TMB储存液和/或独立包装的TMB底物稀释液和/或独立包装的终止液；

所述包被液的溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3，溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被液中的浓度分别为1.59g/L和2.93g/L；

所述PBST缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和Tween-20，溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在所述PBST缓冲液中的浓度分别为8.0g/L、0.2g/L、0.2g/L和

1.15g/L，所述Tween-20在所述PBST缓冲液中的体积百分含量为0.05%；

所述封闭液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为脱脂牛奶，溶质脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度为50g/L；

所述样品稀释液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为牛血清白蛋白，溶质牛血清白蛋白在所述样品稀释液中的浓度为10g/L；

所述TMB储存液的溶剂为无水乙醇，溶质为四甲基联苯胺，溶质四甲基联苯胺在所述TMB储存液中的浓度为2mg/mL；

所述TMB底物稀释液的溶剂为水，溶质为Na2HPO4和柠檬酸，溶质Na2HPO4和柠檬酸在所述TMB底物稀释液中的浓度分别为18.27g/L和4.665g/L；

所述终止液为2mol/L的硫酸水溶液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述包被液pH值为9.6；所述PBST缓冲液的pH值为7.4；所述TMB底物稀释液的pH值为5.5。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有独立包装的酶标记的抗待测动物IgG的抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记的抗待测动物IgG的抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述待测动物为鸡或鸭。

说明书

H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒。

背景技术

[0002] 禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是一种能引起禽类发生严重急性传染病的A型流感病毒，其引起的禽流感被国际兽疫局(OIE)列为类A动物传染病。该病毒很容易发生变异，至今已发现了16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。其中，H5是一种高致病性亚型AIV，能引起禽类大规模死亡并给养禽业造成巨大的经济损失。有证据表明，H5亚型AIV还能通过多种途径传播给人类及其它多种哺乳动物，如：猫、狗、猪和虎等，导致其发病甚至死亡。因此，快速准确检测H5亚型禽流感病毒感染对该病的排查和防控具有重要意义。

[0003] AIV基因组由8个独立的RNA组成，共编码10种蛋白。其中，HA蛋白是AIV的一个重要的表面抗原性蛋白，在病毒的吸附和穿膜、决定病毒致病力等方面起重要作用，也是病毒刺激机体产生中和抗体的重要抗原，在AIV的免疫学诊断中有重要意义。

[0004] 至今为止，有关该病的血清学诊断技术包括血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散试验(AGP)、免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。

[0005] 血凝抑制试验(HI)是禽流感及其亚型鉴定的常用方法，但操作复杂费时，需要与血凝试验(HA)同时进行，而且对于具有相同神经氨酸酶亚型(NA)的病毒感染容易发生交叉反应，导致误诊。

[0006] 琼脂扩散试验(AGP)是利用可溶性抗原抗体在琼脂糖凝胶内扩散，当抗原抗体发生免疫反应时，在琼脂糖凝胶内形成肉眼可见的免疫复合物沉淀线，并依此判定结果。该方法特异性差、敏感性低，容易造成误诊。

[0007] 免疫荧光技术(IFA)是一种将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。该方法最早在1961年用于人类流感的快速诊断，在禽流感的诊断上也有应用。该方法具有敏感、快速、简便、成本低等特点，但也存在非特异性荧光干扰而出现的假阳性结果问题。

[0008] 酶联免疫吸附试验(ELISA)是一类以酶标抗原或酶标抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被检物进行定性或定量的标记免疫技术。该技术具有灵敏度高、特异性强、准确性好、操作简单方便等特点，是目前对病毒抗原及其抗体检测的常用技术。该技术最早于1974年被欧洲国家应用于禽流感的检测，目前我国研发的禽流感ELISA诊断方法包括禽流感病毒检测ELISA和禽流感抗体检测ELISA两种。这两种技术所使用的抗原是全病毒浓缩抗原，需要通过浓缩、纯化和灭活等工艺来制备。禽流感病毒是一种很容易变异的病毒，具有潜在性生物安全危害。尤其是H5亚型禽流感病毒，是一种高致病性病毒，制备抗原时要求在至少P3级的生物安全设施中生产。生产成本大、仪器设备要求高，不能满足实际生产需要，不利于这些技术的推广应用。针对这些问题，有学者以血凝素(HA)基因表达蛋白为抗原建立禽流感ELISA检测技术，并已证明可用于对禽流感病毒的HA亚型进行分型。但由于HA基因中含有较多的大肠杆菌稀有密码子，HA全长基因在原核细胞中进行表达时，序列中密集分布的稀有密码子会对重组蛋白的表达产量有很大影响，无法满足生产需要；而且这些稀有密码子分布广泛，对其进行改造需要耗费很大的人力和物力，大幅度增加研发成本。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的是提供一种H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒。该试剂盒可用于检测或辅助检测待测动物H5亚型禽流感病毒的抗血清，所述试剂盒中含有独立包装的如下a)或b)的蛋白作为检测抗原：

[0010] a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

[0011] b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。

[0012] 序列表序列2所示的氨基酸序列由244个氨基酸残基组成，含有H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位。

[0013] 为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0014] 表1标签的序列

[0015]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0016] 所述蛋白具体可为在序列表序列2所示氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。

[0017] 所述试剂盒中还含有独立包装的包被液和/或独立包装的PBST缓冲液和/或独立包装的封闭液和/或独立包装的样品稀释液和/或独立包装的TMB储存液和/或独立包装的TMB底物稀释液和/或独立包装的终止液；

[0018] 所述包被液的溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3，溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被液中的浓度分别为1.59g/L和2.93g/L，所述包被液PH值具体可为9.6；

[0019] 所述PBST缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和吐温-20，溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在所述PBST缓冲液中的浓度分别为8.0g/L、0.2g/L、0.2g/L和1.15g/L，所述吐温-20在所述PBST缓冲液中的体积百分含量为0.05％，所述PBST缓冲液的PH值具体可为7.4；

[0020] 所述封闭液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为脱脂牛奶，溶质脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度为50g/L；

[0021] 所述样品稀释液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为牛血清白蛋白，溶质牛血清白蛋白在所述样品稀释液中的浓度为10g/L；

[0022] 所述TMB储存液的溶剂为无水乙醇，溶质为四甲基联苯胺，溶质四甲基联苯胺在所述TMB储存液中的浓度为2mg/mL；

[0023] 所述TMB底物稀释液的溶剂为水，溶质为Na2HPO4和柠檬酸，溶质Na2HPO4和柠檬酸在所述TMB底物稀释液中的浓度分别为18.27g/L和4.665g/L，所述TMB底物稀释液的PH值具体可为5.5；

[0024] 所述终止液为2mol/L的硫酸水溶液。

[0025] 所述试剂盒中还含有独立包装的酶标记的抗待测动物IgG的抗体。

[0026] 所述酶标记的抗待测动物IgG的抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。

[0027] 所述待测动物具体可为鸡或鸭，也可为鹅、猪、牛、人和野鸟。

[0028] 本发明所提供的酶联免疫试剂盒中的检测抗原是H5N1亚型禽流感病毒的HA抗原表位原核重组表达蛋白，该重组表达蛋白是在不改变原有基因信息的前提下，通过选择HA基因中抗原表位集中、稀有密码子之间距离相对较远的区域作为目的基因进行表达，解决了HA全长基因在表达过程中由于部分区域存在密集分布的稀有密码子而导致目的蛋白表达产量低的难题，开拓了一条方便、低廉、高效获取检测抗原的途径。

[0029] 实验证明，本发明的试剂盒可特异地检测含有H5亚型禽流感病毒的待测动物抗血清，灵敏度达1∶800，准确率达92％以上，该试剂盒适用于检测鸡、鸭、鹅、野鸟、猪、牛和人等来源的H5亚型禽流感病毒抗血清，既可用于H5亚型禽流感的早期诊断，又可用于抗体监测，在生产实际中的流行病学调查和抗体监测方面非常实用。

附图说明

[0030] 图1为H5N1亚型禽流感病毒HA基因编码的氨基酸序列在大肠杆菌中的密码子使用情况表(临界值为1％)。其中，图中所示的全长序列为H5N1亚型禽流感病毒HA基因开放阅读框编码的氨基酸序列，阴影部分为本发明的HA抗原表位基因编码的氨基酸序列；序列中使用频率≤1％的大肠杆菌稀有密码子用大写字母显示；使用频率≤0.28％的大肠杆菌稀有密码子用带框的大写字母显示。

[0031] 图2为H5亚型禽流感病毒HA抗原表位基因片段和HA基因的开放阅读框(ORF)基因的PCR扩增产物电泳图。其中，泳道1为两端含有EcoR I酶切识别序列的HA抗原表位基因片段，泳道2为分子量标准，从上至下依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，泳道3为两端含有EcoR I酶切识别序列的HA基因开放阅读框片段。

[0032] 图3为H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为预染蛋白质MarkerIII，从上至下依次为94KD、60KD、45KD、27KD和18KD；泳道2为重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA未诱导对照，泳道3为重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA的包涵体，箭头所指处即为目的蛋白。

[0033] 图4为H5亚型禽流感病毒HA基因开放阅读框重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为预染蛋白质MarkerIII，从上至下依次为94KD、60KD、45KD和27KD；泳道2为重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HAORF未诱导对照，泳道3为重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HAORF的包涵体，箭头所指处即为目的蛋白。

[0034] 图5为H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组表达蛋白的Western-Blot分析结果。其中，泳道1为预染蛋白质MarkerIII，从上至下依次为94KD、60KD、45KD、27KD和18KD；泳道2为HA抗原表位重组表达蛋白与H5亚型禽流感病毒阳性血清的反应结果；泳道3为HA抗原表位重组表达蛋白与SPF阴性鸡血清反应结果。

具体实施方式

[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0037] 下述实施例所用血清的来源如下：H5亚型禽流感鸡阳性血清：购自哈尔滨维科生物技术开发公司，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。

[0038] H7亚型禽流感鸡阳性血清：购自哈尔滨维科生物技术开发公司，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。

[0039] H9亚型禽流感鸡阳性血清：购自哈尔滨维科生物技术开发公司，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。

[0040] 传染性鼻炎阳性鸡血清：购自中国兽医药品监察所，经琼脂扩散试验方法鉴定呈阳性。

[0041] 新城疫阳性鸡血清：购自北京康农兴牧科技发展中心，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。

[0042] 产蛋下降综合症阳性鸡血清：购自北京康农兴牧科技发展中心，经琼脂扩散试验方法鉴定呈阳性。

[0043] 传染性支气管炎阳性鸡血清：购自顺勃生物工程技术(北京)有限公司，经琼脂扩散试验方法鉴定呈阳性。

[0044] 实施例1、H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒[0045] 本发明的用于检测H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒由H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位重组蛋白(简称包被抗原)、包被液、PBST缓冲液、封闭液、样品稀释液、TMB储存液、TMB底物稀释液和终止液组成，其制备方法或组成如下：

[0046] 一、包被抗原-H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位重组蛋白的制备与鉴定[0047] 1、H5亚型禽流感病毒HA基因的克隆

[0048] 以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定为H5N1禽流感病毒A/Duck/GX/1/00(H5N1)感染的鸭肝组织为样品提取总RNA，反转录获得cDNA，再以5’-atggagaaaatagtgcttc-3’和5’-ttaaatgcaaattctgcactgt-3’为引物进行PCR扩增，得到序列表序列1所示的大小为1704bp的DNA片段，该序列为H5N1亚型禽流感病毒HA基因的开放阅读框(ORF)。

[0049] 2、H5亚型禽流感病毒HA基因的稀有密码子分析

[0050] 分析H5N1亚型禽流感病毒HA基因的开放阅读框(其序列如序列表序列1所示)及HA抗原表位基因(其序列如序列表序列1的第289位至第1020位所示)的稀有密码子出现次数及在基因序列中的分布情况。结果如图1和表2所示。

[0051] 表2.HA基因在大肠杆菌中表达的稀有密码子分析

[0052]

[0053] 注：大肠杆菌密码子使用频率越低，外源基因越难以表达。

[0054] 结果表明，H5N1亚型禽流感病毒HA基因的开放阅读框编码的氨基酸序列全长的567个氨基酸密码子中，使用频率≤1％的有156个，使用频率≤0.28％的有23个，部分稀有密码子相距很近，甚至相邻并列出现。尤其是在第341位-第343位置(图1)并列出现的3个使用频率仅为0.28％的稀有密码子RRR；HA抗原表位基因编码的244个氨基酸密码子中，使用频率≤1％的一共有70个，使用频率≤0.28％的有9个，这些稀有密码子分布与HA ORF基因密码子相比，相对有利于目的蛋白在大肠杆菌中的表达。尤其是避开了第341位-第343位置上(图1)的3个使用频率仅为0.28％的稀有密码子RRR，有效降低了蛋白翻译提前终止的几率。

[0055] 3、H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组蛋白的获得

[0056] 1)重组表达质粒构建

[0057] 在序列表序列1的第289位至第1020位所示DNA片段两端分别加17bp的序列“ctgatatcggatccgtc”(该序列为质粒pET-32a(+)的EcoR I酶切位点一侧的序列)和17bp的序列“tgtcgacggagctcg”(该序列为质粒pET-32a(+)的EcoR I酶切位点另一侧的序列)，得到766bp的DNA片段，电泳结果如图2的泳道1所示；用EcoR I限制性内切酶将质粒pET-32a(+)(Novagen公司)线性化后，再将该766bp的DNA片段与线性化的质粒pET-32a(+)(Novagen公司)利用 重组克隆试剂盒(L00339，南京金斯瑞生物科技有限公司)连接，再转化Rosetta-gami B(DE3)(Novagen公司)，提取阳性克隆质粒，经测序验证，得到了将质粒pET-32a(+)多克隆位点处的EcoR I位点处连接序列表序列1的第289位至第1020位所示DNA片段的重组表达质粒，将该重组表达质粒命名为pET-32a(+)-HA。
序列表序列1的第289位至第1020位所示DNA片段编码序列表序列2所示的244个氨基酸组成的蛋白(即图1中的阴影部分即第97-340位氨基酸组成的蛋白)。

[0058] 在 序 列 表 序 列1所 示1704bp的DNA 片 段 两 端 分 别 加17bp的 序 列“ctgatatcggatccgtc”和17bp的序列“tgtcgacggagctcg”，得到1738bp的DNA片段电泳结果如图2的泳道3所示；用EcoR I限制性内切酶将质粒pET-32a(+)(Novagen公司)线性化后，再将该1738bp的DNA片段与线性化的质粒pET-32a(+)(Novagen公司)利用重组克隆试剂盒(L00339，南京金斯瑞生物科技有限公司)连接，再转化Rosetta-gami B(DE3)(Novagen公司)，提取阳性克隆质粒，经测序验证，得到了将质粒pET-32a(+)多克隆位点处的EcoR I位点处连接序列表序列1的所示DNA片段的重组表达质粒，将该重组表达质粒命名为pET-32a(+)-HAORF。序列表序列1所示的DNA片段编码图1所示的由567个氨基酸组成的蛋白。

[0059] 2)重组蛋白的诱导表达

[0060] 将pET-32a(+)-HA转入菌株Rosetta-gami B(DE3)(Novagen公司)中，得到含有重组表达质粒pET-32a(+)-HA的重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA。

[0061] 将pET-32a(+)-HAORF转入菌株Rosetta-gami B(DE3)(Novagen公司)中，得到含有重组表达质粒pET-32a(+)-HAORF的重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HAORF。

[0062] 将该重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA和Rosetta-gami B(DE3)分别进行如下培养，收集菌体沉淀：

[0063] 接种到5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，再按10％的接种量接种到500mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、150转/分钟振摇培养至对数生长期，用紫外分光光度计测定菌液的OD600吸光值，当吸光值达到0.5～0.8之间的任何一个值时，加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，继续在37℃、150转/分钟振摇培养过夜，获得菌悬液，2500×g离心10min，收集菌体沉淀。

[0064] 3)重组蛋白的纯化

[0065] 将步骤2)得到的重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA和Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HAORF的菌体沉淀分别进行如下处理：用10mL的PBS溶液(溶剂为水，溶质为8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、1.44g/L的Na2HPO4和0.24g/L的KH2PO4，用HCl调pH为7.4)重悬，同时加入终浓度为100μg/mL的溶菌酶(上海碧云天生物技术有限公司)，在冰上进行超声波裂解，10000×g离心收集包涵体沉淀。

[0066] 取重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA的包涵体沉淀进行SDS-PAGE鉴定，以未进行IPTG诱导表达的重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA为对照，结果如图3所示；取重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HAORF的包涵体沉淀进行SDS-PAGE鉴定，以未进行IPTG诱导表达的重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HAORF为对照，结果如图4所示。

[0067] 图3中重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA所表达的目的蛋白与pET-32a(+)载体的6个组氨酸标签蛋白形成分子量为48.1KD的融合蛋白(命名为HA抗原表位重组蛋白)，进一步的凝胶扫描分析表明，该48.1KD的目的蛋白占菌体总蛋白的35％；图4中重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HAORF所表达的目的蛋白与pET-32a(+)载体的6个组氨酸标签蛋白形成分子量为84.7KD(命名为HA重组蛋白)，进一步的凝胶扫描分析表明，该84.7KD的目的蛋白占菌体总蛋白的8％，说明对HA抗原表位基因进行重组表达获得的HA抗原表位重组蛋白的原核表达量明显高于对HA基因全长进行重组表达获得的HA重组蛋白。

[0068] 利用QIAexpress Ni-NTA Fast Sart(德国QIAGEN公司，Cat.306000)对重组菌Rosetta-gami B(DE3)/pET-32a(+)-HA包涵体沉淀中6个组氨酸标记的48.1KD蛋白进行纯化，获得HA抗原表位重组蛋白。

[0069] 4)重组蛋白的活性检测

[0070] 按常规方法，制备12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，取10μL步骤3)纯化的HA抗原表位重组蛋白在SDS-PAGE上进行电泳，然后进行Western-Blot分析，结果如图5所示。结果表明，HA抗原表位重组蛋白能与H5亚型禽流感病毒阳性血清发生杂交显色，出现48.1kD的杂交反应带，而与SPF阴性鸡血清无任何特异性杂交反应带。

[0071] 二、试剂盒其它试剂的制备

[0072] 包被液：溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3，溶质Na2CO3和NaHCO3在包被液中的浓度分别为1.59g/L和2.93g/L，PH值为9.6。

[0073] PBST缓冲液：溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和吐温-20，溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在PBST缓冲液中的浓度分别为8.0g/L、0.2g/L、0.2g/L和1.15g/L，吐温-20在PBST缓冲液中的体积百分含量为0.05％，PH值为7.4。

[0074] 封闭液：溶剂为PBST缓冲液，溶质为脱脂牛奶，溶质脱脂牛奶在封闭液中的浓度为50g/L。

[0075] 样品稀释液：溶剂为PBST缓冲液，溶质为牛血清白蛋白(BSA)，溶质BSA在样品稀释液中的浓度为10g/L。

[0076] TMB储存液：溶剂为无水乙醇，溶质为四甲基联苯胺(TMB)，溶质TMB在TMB储存液中的浓度为2mg/mL，4℃避光保存。

[0077] TMB底物稀释液：溶剂为水，溶质为Na2HPO4和柠檬酸，溶质Na2HPO4和柠檬酸在TMB底物稀释液中的浓度分别为18.27g/L和4.665g/L，PH值为5.5。

[0078] 底物显色液：含TMB储存液0.5mL，TMB底物稀释液10mL，H2O2 32μL。

[0079] 终止液：浓度为2M的硫酸水溶液。

[0080] 实施例2、H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒的特异性检测

[0081] 使用实施例1制备的试剂盒、采用间接酶联免疫吸附测定法(间接ELISA)对如下经过血凝抑制试验、琼脂扩散试验等常规实验方法鉴定的鸡血清(待检血清)进行H5亚型禽流感病毒检测：H5亚型禽流感鸡阳性血清(阳性对照)、SPF鸡血清(阴性对照)、H7亚型禽流感鸡阳性血清(待检血清1)、H9亚型禽流感鸡阳性血清(待检血清2)、传染性鼻炎阳性鸡血清(待检血清3)、新城疫阳性鸡血清(待检血清4)、产蛋下降综合症阳性鸡血清(待检血清5)、传染性支气管炎阳性鸡血清(待检血清6)，具体步骤如下：

[0082] 1、抗原的稀释

[0083] 用BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，P0012)测定实施例1步骤3中3)纯化的HA抗原表位重组蛋白的浓度，用包被液将纯化蛋白稀释至15μg/μL，作为包被抗原。

[0084] 2、抗原的包被

[0085] 将15μg/μL包被抗原按100μL/孔的量加入到ELISA板。37℃作用1h后，再4℃作用2h，PBST缓冲液洗板3次，最后一次甩干。加入100μL/孔的封闭液封闭40min，PBST缓冲液洗板3次，甩干备用。

[0086] 3、待检血清的加入

[0087] 用样品稀释液将待检血清稀释100倍，按100μL/孔的量加入ELISA板，每个样品3个重复，37℃作用40min，PBST缓冲液洗板3次。

[0088] 4、酶标二抗的加入

[0089] 用样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG二抗(KPL公司，14-24-06)稀释5000倍后按100μL/孔的量加入各反应孔，37℃作用40min，PBST缓冲液洗板3次，蒸馏水洗板1次。

[0090] 5、显色

[0091] 按100μL/孔的量向各反应孔加入底物显色液，37℃作用5min，加入50μl终止液。

[0092] 6、结果检测

[0093] 将酶标板置于酶标仪，测定450nm的OD值。根据公式X+3STD计算出阳性判定值，公式中的X为阴性对照样品OD450的平均值，STD为阴性对照样品方差。当待检血清的OD450平均值≥阳性判定值时，判定待检血清为H5亚型禽流感病毒阳性血清，结果如表3所示。

[0094] 表3.本发明试剂盒的间接ELISA检测结果(OD450)

[0095]

[0096] 根据上表计算得知X为0.0750，STD为0.006，阳性判定值X+3STD为0.093。

[0097] 表3的结果表明，本发明试剂盒HA抗原表位重组蛋白的特异性很好，可与H5亚型禽流感病毒感染的抗血清发生特异结合反应。

[0098] 实施例3、H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒的灵敏度检测

[0099] 一、本发明试剂盒中包被抗原的灵敏度

[0100] 将本发明试剂盒中的包被抗原按照实施例2步骤1的方法分别稀释至20μg/μL、15μg/μL、10μg/μL、5μg/μL、2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL，按实施例2中步骤2的抗原包被法包被ELISA板，每个稀释度重复3次。将经过血凝抑制试验方法鉴定的H5亚型禽流感鸡阳性血清(阳性对照)和SPF鸡血清(阴性对照)用样品稀释液分别稀释100倍，按实施例2步骤3-6操作测定包被抗原的灵敏度。结果如表4所示，表中数值为3次重复的平均值。

[0101] 表4.H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组蛋白的灵敏度检测结果(OD450)[0102]

[0103] 注：样品OD450值大于阳性判定值时为阳性，小于阳性判定值时为阴性。

[0104] 表4结果表明，0.25μg/μL的H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组蛋白即可对100倍稀释的阳性血清进行检测。

[0105] 二、本发明试剂盒检测H5亚型禽流感病毒抗血清的灵敏度

[0106] 将经过血凝抑制试验方法鉴定H5亚型禽流感阳性鸡血清(阳性对照)和鉴定为阴性的SPF鸡血清(阴性对照)分别用样品稀释液进行50、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000倍稀释，以浓度为15μg/μL的HA抗原表位重组蛋白为包被抗原，按照实施例2的方法对上述经稀释的阴性和阳性样品分别进行检测，每个浓度的样品重复3次，结果如表5所示。

[0107] 表5.本发明试剂盒检测H5亚型禽流感病毒抗血清的灵敏度结果(OD450)[0108]

[0109]

[0110] 表5的结果表明，本发明的试剂盒当以15μg/μL的H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组蛋白作为包被抗原对H5亚型禽流感病毒感染的鸡抗血清的间接ELISA检测灵敏度达1∶800。

[0111] 实施例4、H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒的准确率检测

[0112] 一、本发明试剂盒监测鸡群的准确率

[0113] 使用本发明的试剂盒按照如下步骤的方法对鸡群进行监测，以SPF鸡血清为阴性对照，以H5亚型禽流感鸡阳性血清为阳性对照，每个样品3次重复，结果以平均值表示：

[0114] 1、待检血清样品的采集

[0115] 按常规方法，用2mL规格的注射器随机从待检鸡群的鸡翅根静脉采血1mL，分离血清，于4℃保存备用。

[0116] 2、抗原的稀释

[0117] 方法同实施例2的步骤1。

[0118] 3、抗原的包被

[0119] 方法同实施例2的步骤2。

[0120] 4、待检血清的加入

[0121] 方法同实施例2的步骤3。

[0122] 5、酶标二抗的加入

[0123] 用样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG二抗(KPL公司，14-24-06)稀释5000倍后按100μL/孔的量加入各反应孔，37℃作用40min，PBST缓冲液洗板3次，蒸馏水洗板1次。

[0124] 6、显色

[0125] 方法同实施例2的步骤5。

[0126] 7、结果判断

[0127] 方法同实施例2的步骤6。

[0128] 结果：52份鸡血清样品中，呈H5亚型禽流感病毒阳性的样品有47份，呈H5亚型禽流感病毒阴性的样品有5份，检测结果如表6和表7所示；将上述52份鸡血清样品同时用以H5亚型禽流感病毒为抗原的禽流感H5抗体检测试剂盒(Avian Influenza H5 Antibody Test Kit，06-40979-02，IDEX公司)进行检测，结果呈H5亚型禽流感病毒阳性的样品有49份，呈H5亚型禽流感病毒阴性的样品有3份。

[0129] 结果表明：本发明的试剂盒与以H5亚型禽流感病毒为抗原的禽流感H5抗体检测试剂盒相比，检测鸡血清中的H5亚型禽流感病毒抗体的符合率为96.15％。

[0130] 表6.本发明试剂盒对鸡群的ELISA检测结果(OD450)

[0131]编号 1 2 3 4 5 6 7
A 0.095 0.120 0.179 0.142 0.217 0.127 0.165
B 0.098 0.122 0.342 0.213 0.188 0.171 0.274
C 0.221 0.177 0.257 0.282 0.301 0.097 0.189
D 0.246 0.277 0.126 0.159 0.199 0.143 0.150
E 0.149 0.197 0.124 0.257 0.176 0.122 0.239
F 0.164 0.112 0.200 0.219 0.083 0.274 0.304
G 0.219 0.122 0.092 0.300 0.252 0.079 0.111
H 0.237 0.119 0.108 0.158 0.130 0.112 0.097

[0132] 注：A1和B1为阴性对照结果，C1和D1为阳性对照结果，其余为待测鸡血清样品结果；根据表中阴性对照结果计算得知X为0.0965，STD为0.002121，阳性判定值X+3STD为0.1014，样品OD450值大于阳性判定值0.1014时为阳性，小于阳性判定值0.1014时为阴性。

[0133] 表7.本发明试剂盒对鸡群的ELISA检测结果(阴/阳)

[0134]编号 1 2 3 4 5 6 7
A 阴性对照 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
B 阴性对照 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
C 阳性对照 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性

[0135]D 阳性对照 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
E 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
F 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性
G 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性
H 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性

[0136] 二、本发明试剂盒监测鸭群的准确率

[0137] 使用本发明试剂盒按照如下步骤的方法对鸭群进行监测，阴性对照为非免疫健康鸭血清，经血凝抑制试验证明为H5亚型禽流感阴性，阳性对照为H5N1亚型重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1Re_5株)(青岛易邦生物工程有限公司)免疫鸭血清，经血凝抑制试验鉴定呈阳性，每个样品3次重复，结果以平均值表示：

[0138] 1、待检血清样品的采集

[0139] 按常规方法，用2mL规格的注射器从待测鸭群的鸭翅根静脉采血1mL，分离血清，于4℃保存备用。

[0140] 2、抗原的稀释

[0141] 方法同实施例2的步骤1。

[0142] 3、抗原的包被

[0143] 方法同实施例2的步骤2。

[0144] 4、待检血清的加入

[0145] 方法同实施例2的步骤3。

[0146] 5、酶标二抗的加入

[0147] 用样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸭IgG二抗(KPL公司，04-25-06)稀释1000倍后按100μL/孔的量加入各反应孔，37℃作用40min，PBST缓冲液洗板3次，蒸馏水洗板1次。

[0148] 6、显色

[0149] 方法同实施例2的步骤5。

[0150] 7、结果判断

[0151] 方法同实施例2的步骤6。

[0152] 结果：52份鸭血清样品中，呈H5亚型禽流感病毒阳性的37份；呈H5亚型禽流感病毒阴性的15份，结果如表8和表9所示；将上述鸭血清样品同时用禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(哈尔滨维科生物技术开发公司)进行血凝抑制试验，结果呈H5亚型禽流感病毒阳性的41份，呈H5亚型禽流感病毒阴性的11份。

[0153] 上述结果表明，与血凝抑制试验相比，使用本发明试剂盒检测鸭血清中的H5亚型禽流感病毒抗体的符合率为92.30％。

[0154] 表8.本发明试剂盒对鸭群的检测结果(OD450)

[0155]1 2 3 4 5 6 7
A 0.614 0.097 0.095 0.095 0.094 0.088 0.315
B 0.673 0.435 0.376 0.394 0.278 0.263 0.298
C 0.081 0.106 0.073 0.089 0.571 0.182 0.071
D 0.075 0.132 0.144 0.160 0.114 0.207 0.175
E 0.123 0.064 0.059 0.125 0.047 0.254 0.085
F 0.081 0.071 0.173 0.086 0.093 0.071 0.106
G 0.154 0.300 0.297 0.341 0.281 0.214 0.059
H 0.193 0.070 0.259 0.055 0.166 0.154 0.258

[0156] 注：A1和B1为阳性对照结果，C1和D1为阴性对照结果，根据该表计算得知阴性对照的X为0.078，STD为0.0042426，阳性判定值X+3STD为0.0907279；样品OD450值大于阳性判定值0.0907279时为阳性，小于阳性判定值0.0907279时为阴性。

[0157] 表9.本发明试剂盒对鸭群的检测结果(阴/阳)

[0158]1 2 3 4 5 6 7
A 阳性对照 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性
B 阳性对照 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
C 阴性对照 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性
D 阴性对照 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
E 阳性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性
F 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性
G 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性
H 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性