一种治疗非小细胞肺癌的组合药物转让专利
申请号 : CN201210158747.0
文献号 : CN102648921B
文献日 : 2014-01-08
发明人 : 陈赛娟 , 陈竺 , 毛建华 , 马列 , 张汝
申请人 : 上海交通大学医学院附属瑞金医院
摘要 :
本发明涉及一种治疗非小细胞肺癌的组合药物，所述的组合药物由三氧化二砷和吉非替尼组成。本发明还涉及一种组合药物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。本发明优点在于：本发明研究非小细胞肺癌的联合靶向治疗方法，首次提出了三氧化二砷和吉非替尼的组合药物，及其在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，砷剂和吉非替尼联合应用于治疗非小细胞肺癌将是一个很有前景的策略，将使更多的非小细胞肺癌患者获益。
权利要求 :
1.一种组合药物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，其特征在于，所述的组合药物由三氧化二砷和吉非替尼组成，所述的非小细胞肺癌是吉非替尼耐药的非小细胞肺癌，所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例为1-2μM：0.01-10μM。
说明书 :
一种治疗非小细胞肺癌的组合药物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种组合药物，具体地说，是一种治疗非小细胞肺癌的组合药物。
背景技术
[0002] 非小细胞肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，在由肿瘤引起的死亡原因中排L858R
第一位。目前，非小细胞肺癌的主要治疗方法仍然是化疗。对于存在EGFR 突变或者EGFR
19号外显子存在不同缺失突变的患者（常见于亚洲、女性、非吸烟、非小细胞肺癌患者）应用吉非替尼（又名易瑞沙）靶向治疗效果较好。
第一位。目前，非小细胞肺癌的主要治疗方法仍然是化疗。对于存在EGFR 突变或者EGFR
19号外显子存在不同缺失突变的患者（常见于亚洲、女性、非吸烟、非小细胞肺癌患者）应用吉非替尼（又名易瑞沙）靶向治疗效果较好。
[0003] 众所周知，化疗的副作用非常大，因为其在杀死肿瘤细胞的同时也对正常细胞具有较强的杀伤作用，很多肿瘤患者无法耐受较大剂量的化疗而导致治疗无法继续而死亡。
[0004] 虽然，吉非替尼对部分EGFR存在突变的患者具有一定的治疗作用，但是，病人一般在1-2年内会发生复发或者转移，或者产生新的突变而对吉非替尼产生耐药，所以，即使使用吉非替尼（酪氨酸激酶抑制剂）治疗仍然不能提高非小细胞肺癌患者的五年总生存期。关于一种由三氧化二砷和吉非替尼组成的治疗非小细胞肺癌的组合药物目前还未见报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，研究非小细胞肺癌的联合靶向治疗方法，使更多的非小细胞肺癌患者获益，提供一种治疗非小细胞肺癌的组合药物。
[0006] 本发明再一的目的是，提供一种组合药物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗非小细胞肺癌的组合药物，所述的组合药物由三氧化二砷和吉非替尼组成。
[0008] 所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例为1-2μM：0.01-10μM。
[0009] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种组合药物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，所述的组合药物由三氧化二砷和吉非替尼组成。
[0010] 所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例为1-2μM：0.01-10μM。
[0011] 本发明优点在于：
[0012] 本发明研究非小细胞肺癌的联合靶向治疗方法，首次提出了三氧化二砷和吉非替尼的组合药物，及其在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，砷剂和吉非替尼联合应用于治疗非小细胞肺癌将是一个很有前景的策略，将使更多的非小细胞肺癌患者获益。
附图说明
[0013] 图1A：砷剂与Gefitinib作用24h以及48h后引起三种细胞增殖抑制的情况。
[0014] 图1B：流式细胞结果显示砷剂与Gefitinib作用48h后引起三种细胞凋亡的情况（subG1峰的出现）。
[0015] 图2：砷剂与Gefitinib对NCI-H1975、HCC827以及A549细胞EGFR的降解以及上调自噬相关蛋白LC3以及自噬相关的信号通路的蛋白，图2A. As2O3与Gefitinib对NCI-H1975细胞的作用，图2B. As2O3与Gefitinib对HCC827细胞的作用，图2C. As2O3与Gefitinib对A549细胞的作用。
[0016] 图3：免疫荧光结果显示砷剂与Gefitinib对NCI-H1975细胞自噬的影响（LC3表达）。
[0017] 图4：电镜结果显示砷剂与Gefitinib诱导NCI-H1975细胞自噬体形成。
[0018] 图5：砷剂与Gefitinib对NCI-H1975细胞在裸鼠皮下成瘤模型的实际肿瘤体积与相对肿瘤体积随时间变化曲线。
[0019] 图6：砷剂与Gefitinib对NCI-H1975细胞在裸鼠皮下成瘤模型小鼠的实际肿瘤体积与相对肿瘤体积随时间变化情况。
[0020] 图7：NCI-H1975荷瘤小鼠肿瘤大小以及分离肿瘤大小大体图片。
[0021] 图8：砷剂与Gefitinib对HCC827细胞在裸鼠皮下成瘤模型的实际肿瘤体积与相对肿瘤体积随时间变化曲线。
[0022] 图9：砷剂与Gefitinib对HCC827细胞在裸鼠皮下成瘤模型小鼠的实际肿瘤体积与相对肿瘤体积随时间变化情况。
[0023] 图10：HCC827荷瘤小鼠肿瘤大小以及分离肿瘤大小大体图片。
[0024] 图11：小动物PET-CT显示原位模型制备成功。
[0025] 图12：小动物活体成像显示原位模型制备成功。
[0026] 图13：非小细胞肺癌原位肿瘤小鼠模型各组小鼠肺部大体照片，绿色细胞为肿瘤细胞。
[0027] 图14A：砷剂与Gefitinib对肺癌患者胸水中肿瘤细胞的抑制作用，砷剂组以及砷L858R剂与Gefitinib联合组可以显著减少成团的肿瘤细胞的数量，这两例均为EGFR 的病人。
[0028] 图14B：此患者为非小细胞肺癌晚期在胸腔穿刺放胸水时在胸腔内注入As2O3，给药后连续4天收集胸水标本，进行细胞涂片以及胸水标本拍照，发现胸水中的成团的肿瘤细胞数量减少，胸水颜色由红色变为淡黄色。
[0029] 图15：非小细胞肺癌胸水标本DNA测序结果，其中3例存在EGFRL858R突变。
[0030] 图16：砷剂与Gefitinib对肺癌病人胸水细胞(EGFRL858R或者EGFRWT) 的作用。
[0031] 图17：病人胸水细胞体外药物作用后免疫荧光检测LC3和P62的表达。
具体实施方式
[0032] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0033] 本发明涉及一种治疗非小细胞肺癌的组合药物，所述的组合药物由三氧化二砷和吉非替尼组成。所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例为1-2μM：0.01-10μM。实施例
[0034] 材料和方法
[0035] 1.1细胞系及药物
[0036] 三种不同类型的非小细胞肺癌细胞株NCI-H1975 (EGFRL858R/T790M)，HCC827 E746-A750del WT(EGFR )以及A549 (EGFR )购自ATCC，NCI-H1975和HCC827应用1640培养基添加
10%胎牛血清，A549应用F12-K培养基添加10%胎牛血清，于37℃、5%CO2细胞培养箱常规培养。NCI-H1975-GFP细胞株是由慢病毒感染的方法（Clonetech）将Lenti-X-GFP质粒载体转入NCI-H1975细胞，通过流式细胞仪分选GFP阳性的细胞获得稳定表达GFP的NCI-H1975细胞。三氧化二砷(A)由北京双鹿制药有限公司赞助，应用磷酸盐缓冲液（PBS）配成2mM储液于-20℃分装保存。高纯度的吉非替尼 (G)(购自Sigma)溶于DMSO，配成10mM的储液于 -20℃分装保存，NH4Cl购自Sigma-Aldrich公司，蛋白酶抑制剂从罗氏公司购得。
10%胎牛血清，A549应用F12-K培养基添加10%胎牛血清，于37℃、5%CO2细胞培养箱常规培养。NCI-H1975-GFP细胞株是由慢病毒感染的方法（Clonetech）将Lenti-X-GFP质粒载体转入NCI-H1975细胞，通过流式细胞仪分选GFP阳性的细胞获得稳定表达GFP的NCI-H1975细胞。三氧化二砷(A)由北京双鹿制药有限公司赞助，应用磷酸盐缓冲液（PBS）配成2mM储液于-20℃分装保存。高纯度的吉非替尼 (G)(购自Sigma)溶于DMSO，配成10mM的储液于 -20℃分装保存，NH4Cl购自Sigma-Aldrich公司，蛋白酶抑制剂从罗氏公司购得。
[0037] 细胞增殖抑制实验
[0038] NCI-H1975，HCC827和A549三种细胞株1×104~2.5×104/ml的密度，铺于96孔细胞培养板，200μl/孔，三氧化二砷0μM至2μM，吉非替尼0μM至10μM，单独或联合处理24小时和48小时，细胞增殖抑制率应用CCK-8检测（购自Dojindo），按照产品说明书进行，实验重复三次。
[0039] 细胞凋亡sub-G1峰检测
[0040] 收集细胞，PBS洗涤1-2次，应用70％冷乙醇于-20℃固定过夜，用PBS洗细胞1-2次，10mg/L的RNA酶于37℃处理30分钟，加入50mg/L的碘化丙啶（PI）的染色。流式细胞仪分析细胞DNA含量分布，每个样品分析1万个细胞，实验重复三次。
[0041] 抗体以及Western blot检测
[0042] 免疫沉淀以及Western blot 抗体，包括Anti-pmTOR，Anti-mTOR，Anti-pULK1，Anti-ULK1，Anti-PI3KCA，Anti-pp70S6K，Anti-pPDK1，Anti-Beclin1，Anti-PTEN，Anti-p4E-BP1购自Cell Signaling Technology公司，anti-EGFR（ab52894）（Abcam），anti-c-CBL（BD Transduction Laboratories），anti-LC3B（Santa Cruz Biotechnology），anti-β-actin（Sigma-Aldrich公司），anti-P62（MBL）。
[0043] 三种细胞分别应用三氧化二砷和/或吉非替尼处理12，24及48小时后，收集6
5×10 细胞应用200μl的RIPA（50 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% sodium deoxycholate，1% NP-40）添加蛋白酶抑制剂冰上裂解30分钟后，12000rpm离心10分钟，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，加入2×SDS loading buffer于100℃煮10分钟。总蛋白（100μg）上样，根据蛋白的分子量大小应用8-15％SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上（GE healthcare），分别应用相应的抗体孵育，化学发光酶底物 HRP Substrate（Millipore公司），应用LAS-4000成像系统成像（富士）。
5×10 细胞应用200μl的RIPA（50 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% sodium deoxycholate，1% NP-40）添加蛋白酶抑制剂冰上裂解30分钟后，12000rpm离心10分钟，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，加入2×SDS loading buffer于100℃煮10分钟。总蛋白（100μg）上样，根据蛋白的分子量大小应用8-15％SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上（GE healthcare），分别应用相应的抗体孵育，化学发光酶底物 HRP Substrate（Millipore公司），应用LAS-4000成像系统成像（富士）。
[0044] 激光共聚焦显微镜以及电子显微镜检测
[0045] NCI-H1975细胞在24孔板中铺于盖玻片上，应用三氧化二砷和/或吉非替尼，以及溶酶体酶抑制剂氯化铵处理24和48小时，然后应用4%多聚甲醛固定，0.2%TritonX-100的透膜，1%BSA封闭，应用LC3的抗体以及actin染液孵育过夜，二抗孵育1小时，应用含DAPI的封片剂封片。使用激光共聚焦显微镜LSM710 Pascal软件（蔡司，德国）系统成像。
[0046] NCI - H1975细胞应用三氧化二砷和/或吉非替尼处理24或48小时后，收集7
1×10 细胞，应用2％戊二醛（用0.1M磷酸缓冲液（pH7.2）配制）固定，然后应用1.0％OsO4后固定，再进行梯度乙醇脱水以及丙酮溶液处理，环氧树脂618包埋，LKB V型超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，然后应用CM-120透射电镜（飞利浦，荷兰）观察并拍照。
1×10 细胞，应用2％戊二醛（用0.1M磷酸缓冲液（pH7.2）配制）固定，然后应用1.0％OsO4后固定，再进行梯度乙醇脱水以及丙酮溶液处理，环氧树脂618包埋，LKB V型超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，然后应用CM-120透射电镜（飞利浦，荷兰）观察并拍照。
[0047] 非小细胞肺癌小鼠模型以及砷剂/吉非替尼治疗
[0048] 所有涉及小鼠的实验和程序都按照上海交通大学附属瑞金医院动物伦理委员会的批准进行。所有小鼠饲养在无特定病原体(SPF级)的环境，常规饮食饮水。所有涉及小鼠的手术是按照动物保护和使用委员会的指导。吉非替尼耐药裸鼠模型采用NCI-H1975-GFP6
细胞（7×10）于裸鼠的右肩部皮下注射一个皮丘，每天观察皮下肿瘤生长情况，应用游标
2
卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积（立方毫米）应用下面的公式：[（短径 ×长径）
3
/2]，当肿瘤体积达到100 mm 时，将小鼠随机分为四组，分别为对照组(Con)（灌水）、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d；腹腔注射）（双鹿，溶解于生理盐水）、吉非替尼(G)（125mg/kg/d灌胃）（阿斯利康，英国，溶解于无菌蒸馏水）以及三氧化二砷与吉非替尼联合用药组(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每天测量小鼠的皮下肿瘤的体积，每天给药，连续处理18天后将小鼠安乐处死，分别取出皮下肿瘤、肺、肝、脾、肾固定在福尔马林中进行病理学检测。相对肿瘤体积根据公式计算：相对肿瘤体积= TVn/TV0，其中TVn是n天的肿瘤体积，TV0是第0天（给药前测量）的肿瘤体积。吉非替尼敏感裸鼠模型采用HCC827-GFP细胞
6 3
（7×10）按照与耐药裸鼠相同的方法建立模型，待肿瘤体积达到100 mm 时，将小鼠随机分为六组，分别为对照组(Con)、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d；腹腔注射）、低剂量吉非替尼组(GL)（3.125mg/kg/d；灌胃）、高剂量吉非替尼组(GH)（6.25 mg/kg/d；灌胃）、低剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGL)以及高剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGH)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。测量肿瘤、给药以及安乐处死小鼠取肿瘤以及各脏器的方式与耐药裸鼠模型相同。
细胞（7×10）于裸鼠的右肩部皮下注射一个皮丘，每天观察皮下肿瘤生长情况，应用游标
2
卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积（立方毫米）应用下面的公式：[（短径 ×长径）
3
/2]，当肿瘤体积达到100 mm 时，将小鼠随机分为四组，分别为对照组(Con)（灌水）、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d；腹腔注射）（双鹿，溶解于生理盐水）、吉非替尼(G)（125mg/kg/d灌胃）（阿斯利康，英国，溶解于无菌蒸馏水）以及三氧化二砷与吉非替尼联合用药组(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每天测量小鼠的皮下肿瘤的体积，每天给药，连续处理18天后将小鼠安乐处死，分别取出皮下肿瘤、肺、肝、脾、肾固定在福尔马林中进行病理学检测。相对肿瘤体积根据公式计算：相对肿瘤体积= TVn/TV0，其中TVn是n天的肿瘤体积，TV0是第0天（给药前测量）的肿瘤体积。吉非替尼敏感裸鼠模型采用HCC827-GFP细胞
6 3
（7×10）按照与耐药裸鼠相同的方法建立模型，待肿瘤体积达到100 mm 时，将小鼠随机分为六组，分别为对照组(Con)、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d；腹腔注射）、低剂量吉非替尼组(GL)（3.125mg/kg/d；灌胃）、高剂量吉非替尼组(GH)（6.25 mg/kg/d；灌胃）、低剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGL)以及高剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGH)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。测量肿瘤、给药以及安乐处死小鼠取肿瘤以及各脏器的方式与耐药裸鼠模型相同。
[0049] 吉非替尼耐药原位小鼠模型采用NOD-SCID小鼠，将小鼠麻醉后，在右胸壁的部位6
皮下作一切口，将NCI-H1975-GFP细胞（3×10）浓缩于50μl体积内经肋间隙注射入小鼠的右上肺，缝合皮下切口。于手术4天后随机将小鼠分为四组，分别为对照组(Con)、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d;腹腔注射）、吉非替尼(G)（64mg/kg/d灌胃）以及三氧化二砷与吉非替尼联合用药组(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每周给药5天，停药两天，给药3星期后安乐处死小鼠，取出肺、肝、脾、肾固定在福尔马林中进行病理学检测。肺部大体形态拍照片备用。
皮下作一切口，将NCI-H1975-GFP细胞（3×10）浓缩于50μl体积内经肋间隙注射入小鼠的右上肺，缝合皮下切口。于手术4天后随机将小鼠分为四组，分别为对照组(Con)、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d;腹腔注射）、吉非替尼(G)（64mg/kg/d灌胃）以及三氧化二砷与吉非替尼联合用药组(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每周给药5天，停药两天，给药3星期后安乐处死小鼠，取出肺、肝、脾、肾固定在福尔马林中进行病理学检测。肺部大体形态拍照片备用。
[0050] 非小细胞肺癌患者的胸腔积液样本 经患者知情同意，收集8例非小细胞肺癌患者胸腔积液标本，患者的诊断根据支气管镜活检，PET-CT检查，肿瘤标志物，胸腔积液脱落细胞，经皮肺活检病理综合作出判断。2000rpm离心收集胸腔积液标本中的包含肿瘤细胞的组分，应用Ficoll密度梯度离心法分离包括肿瘤细胞在内的单个核细胞并用红细胞裂解液去除其中的红细胞。细胞计数后分别接种于10cm的细胞培养皿中，应用三氧化二砷、吉非替尼或两药联合处理。收集处理前后的细胞应用离心涂片仪（朗科恩，英国）将细胞涂于载玻片上，进行瑞氏染色或免疫荧光实验。应用TIANamp血液DNA抽提试剂盒（天根生化）抽提细胞的基因组DNA，设计针对表皮生长因子受体（EGFR）的不同片段的引物，进行PCR扩增和测序确定EGFR的突变情况。应用RIPA裂解液提取细胞的总蛋白进行免疫印迹（Western Blot）检测表皮生长因子受体（EGFR）、LC3等蛋白的表达。
[0051] 统计分析
[0052] 所有的实验至少重复3次，采用SPSS 13.0 for Windows软件包进行统计学分析以及显着性差异分析。显著性差异为p小于0.05。
[0053] 结果
[0054] 2.1三氧化二砷和吉非替尼能抑制非小细胞肺癌细胞系增殖，诱导其凋亡[0055] 三种非小细胞肺癌细胞系用三氧化二砷和吉非替尼处理24小时和48小时后，应用CCK-8测量OD值，计算其增殖抑制率。在NCI-H1975细胞中（吉非替尼耐药），虽然三氧化二砷与吉非替尼单独应用都可以增加细胞的增殖抑制率，但是作用并不十分明显，而当三氧化二砷和吉非替尼联合处理时可以显著增加细胞的增殖抑制率，说明在吉非替尼耐药的细胞中砷剂可以增强吉非替尼的治疗作用。然而，在HCC827细胞中(吉非替尼敏感)，虽然单独应用吉非替尼就可以较好的增加细胞增殖抑制率，然而当三氧化二砷和吉非替尼联合应用时，细胞的增殖抑制率显著提高（p<0.001），说明在吉非替尼敏感的细胞中砷剂仍然可以显著提高吉非替尼的疗效（图1A）。
[0056] 此外，细胞经三氧化二砷和吉非替尼处理48小时后，通过PI染色，检测细胞凋亡sub-G1峰，结果显示：单用三氧化二砷处理可以诱导NCI-H1975细胞发生凋亡；然而，与单用吉非替尼相比，联合应用三氧化二砷和吉非替尼处理的细胞处于sub-G1期的百分比显著提高。HCC827的结果和NCI-H1975的结果相似。但是，在A549细胞中，三氧化二砷和吉非替尼都不能诱导其凋亡（图1B）。
[0057] 砷剂可以下调EGFR、pmTOR的表达，上调LC3的表达
[0058] 随后，我们在蛋白水平检测了EGFR以及自噬相关通路蛋白的表达水平。对三种不同的非小细胞肺癌细胞，三氧化二砷都可以诱导EGFR降解，下调磷酸化mTOR的表达和上调LC3的表达。这表明砷剂在治疗三种不同类型的非小细胞肺癌的作用中具有共同的通路，即自噬通路。此外，在砷剂作用下，除了上述三种蛋白，翻译起始蛋白磷酸化的4E-BP1也表达下调，这表明砷剂还可以抑制蛋白的翻译起始。细胞经吉非替尼处理48小时后， 可以使EGFR的表达下调和LC3的微弱上调。这表明吉非替尼也在自噬调节蛋白降解中发挥一定的作用，但是弱于三氧化二砷的作用（图2）。
[0059] 三氧化二砷和吉非替尼可以增强NCI-H1975细胞的自噬和凋亡
[0060] 应用免疫荧光实验检测了NCI-H1975细胞自噬标记物LC3的表达。结果显示，经三氧化二砷和吉非替尼处理24小时和48小时的细胞，分布在细胞浆和细胞核中的绿色点（LC3在胞浆与胞核内呈点状分布）增多，并且，48小时绿色点的量和强度都比24小时的高。为了进一步显示实验结果，我们用溶酶体抑制剂NH4Cl(20mM)预处理细胞半个小时后再用砷剂、吉非替尼，或者两者联合处理细胞，结果显示，与对照组相比，单用NH4Cl的绿色点有轻微的增加。然而，当细胞经砷剂、吉非替尼或者两者联合处理后，绿色点的量和强度有明显增加，并且，联合组的增加特别显著（图3）。这表明，砷剂和吉非替尼可以诱导NCI-H1975自噬，并且，砷剂可以增强吉非替尼的作用。
[0061] 此外，我们应用电子显微镜观察经砷剂、吉非替尼、或者两者联合处理细胞内的自噬小体和凋亡小体。结果显示，当细胞经砷剂处理48小时(图4)，双层膜自噬小体包裹的细胞质成分可以被观察到。除自噬小体外，一些出现细胞核碎裂，染色质边集和线粒体肿胀的凋亡小体也可以观察到(图4)。在吉非替尼处理的细胞中，我们还可以观察到呈现板层状结构由多层膜包裹的自噬小体增加，这表明包裹的胞浆成分已经被降解。并且，在砷剂和吉非替尼处理的细胞，可以观察到相当多的自噬小体，其中一些包裹着线粒体。所有的证据证明砷剂和吉非替尼确实可以诱导NCI-H1975细胞自噬。
[0062] 三氧化二砷和吉非替尼可以抑制非小细胞肺癌荷瘤小鼠的肿瘤增长
[0063] 为了检测砷剂和吉非替尼对活体非小细胞肺癌的疗效，我们使用NCI-H1975-GFP细胞在裸鼠和NOD-SCID小鼠中建立了非小细胞肺癌小鼠肿瘤模型。在由NCI-H1975-GFP3
细胞建立的裸鼠模型中，当皮下肿瘤体积大于100mm 时将小鼠随机分成四组，包括对照组(Con)（灌水，腹腔注射生理盐水）；A（三氧化二砷，5mg/kg/d，腹腔注射）；G（吉非替尼，125mg/kg/d，灌胃）和AG，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径并计算其体积，实际肿瘤体积的变化曲线(TV)或者肿瘤相对体积(RTV)如图5A和5B。砷剂组和联合组的肿瘤起始体积大于对照组和吉非替尼组，治疗后六天，每组的肿瘤体积相接近。六天后，对照组的肿瘤增长率明显比其它三组快，到治疗后第十八天，吉非替尼组、砷剂组和联合组的肿瘤体积比对照组小，并且联合组和砷剂组的下降特别显著（图5，图6，图7）。
细胞建立的裸鼠模型中，当皮下肿瘤体积大于100mm 时将小鼠随机分成四组，包括对照组(Con)（灌水，腹腔注射生理盐水）；A（三氧化二砷，5mg/kg/d，腹腔注射）；G（吉非替尼，125mg/kg/d，灌胃）和AG，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径并计算其体积，实际肿瘤体积的变化曲线(TV)或者肿瘤相对体积(RTV)如图5A和5B。砷剂组和联合组的肿瘤起始体积大于对照组和吉非替尼组，治疗后六天，每组的肿瘤体积相接近。六天后，对照组的肿瘤增长率明显比其它三组快，到治疗后第十八天，吉非替尼组、砷剂组和联合组的肿瘤体积比对照组小，并且联合组和砷剂组的下降特别显著（图5，图6，图7）。
[0064] 我们还分析了相对肿瘤体积，斜率表示肿瘤相对生长率，越倾斜，生长率越快，反之亦然。结果显示，对照组的相对生长率的总趋势是最快的，吉非替尼组次之，砷剂组和联合组是最慢的(图5B)。这意味着，砷剂可以抑制肿瘤在活体内生长。我们进一步通过直方图分析肿瘤相对体积随治疗时间的变异性。结果显示，从治疗后第六天，砷剂组相对肿瘤体积比对照组小(p<0.05)；在第十二天，砷剂组和联合组RTV都比对照组小(p<0.01)；最后，在第十八天，砷剂组和联合组相对肿瘤体积明显小于对照组(p<0.01，p<0.001)，这表明砷剂在活体内有抑制肿瘤增殖的潜能。在治疗后第十八天，把小鼠安乐处死，分离肿瘤、肺、脾、肝和肾进行病理、免疫组化、免疫荧光和电子显微镜实验。
[0065] 除了吉非替尼耐药的细胞NCI-H1975细胞外，我们还应用HCC827-GFP细胞在裸鼠3
建立了对吉非替尼敏感的非小细胞肺癌小鼠模型。当皮下肿瘤体积大于100mm 将小鼠随机分为六组，分别为对照组(Con)、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d;腹腔注射）、低剂量吉非替尼组(GL)（3.125mg/kg/d；灌胃）、高剂量吉非替尼组(GH)（6.25 mg/kg/d；灌胃）、低剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGL)以及高剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGH)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径并计算其体积，肿瘤体积的变化曲线或者肿瘤相对体积如图8A和8B。治疗后第二天，每组的肿瘤体积相似。此后，对照组的肿瘤增长率明显比其它五组快，砷剂单用组肿瘤也呈增长的趋势，但是比对照组长的慢，吉非替尼组（低剂量组与高剂量组）与联合组的肿瘤体积明显呈下降的趋势，与对照组相比下降特别显著（图8，图9，图10）。
建立了对吉非替尼敏感的非小细胞肺癌小鼠模型。当皮下肿瘤体积大于100mm 将小鼠随机分为六组，分别为对照组(Con)、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d;腹腔注射）、低剂量吉非替尼组(GL)（3.125mg/kg/d；灌胃）、高剂量吉非替尼组(GH)（6.25 mg/kg/d；灌胃）、低剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGL)以及高剂量吉非替尼与三氧化二砷联合组(AGH)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径并计算其体积，肿瘤体积的变化曲线或者肿瘤相对体积如图8A和8B。治疗后第二天，每组的肿瘤体积相似。此后，对照组的肿瘤增长率明显比其它五组快，砷剂单用组肿瘤也呈增长的趋势，但是比对照组长的慢，吉非替尼组（低剂量组与高剂量组）与联合组的肿瘤体积明显呈下降的趋势，与对照组相比下降特别显著（图8，图9，图10）。
[0066] 由于裸鼠皮下肿瘤模型，不能完全等同于人的非小细胞肺癌，我们又建立了非小细胞肺癌原位肿瘤模型，先全身麻醉NOD-SCID小鼠，应用外科手术的方法经肋间隙注射NCI-H1975-GFP细胞到肺组织，于手术4天后随机将小鼠分为四组，分别为对照组(Con)、三氧化二砷组(A)（5mg/kg/d；腹腔注射）、吉非替尼(G)（64mg/kg/d灌胃）以及三氧化二砷与吉非替尼联合用药组(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作为正常对照组。每周给药5天，休息两天，给药3星期后安乐处死小鼠，取出肺、肝、脾、肾固定在福尔马林中进行病理学检测。小动物PET-CT以及活体成像观察原位成瘤情况，肺部大体形态拍照片显示单独应用砷剂处理肺部的病变显著轻于对照组，而单用吉非替尼组与对照组相比也有一定的治疗效果，但是治疗效果不如砷剂单用组，而当两药联用后，肺部的病变几乎完全被抑制住，肺部大体照片与正常对照组（Nor）相似，说明在吉非替尼耐药的肿瘤中，砷剂的确发挥了较好的治疗作用（图11，12，13）。
[0067] 三氧化二砷和吉非替尼对非小细胞肺癌患者胸腔积液标本的作用
[0068] 众所周知，肺癌晚期患者常常会出现胸腔积液，我们与第二军医大学附属长征医院呼吸科合作，尝试用三氧化二砷治疗胸腔积液。在研究中，我们对一例有胸腔积液的患者用砷剂治疗（胸腔内注射三氧化二砷）后，结果显示不仅血性胸腔积液转化成浅黄色，并且胸腔积液中的肿瘤细胞数量明显减少（图14B）。随后，我们探索砷剂和吉非替尼对非小细胞肺癌患者胸水中肿瘤细胞的作用。结果显示，三氧化二砷和吉非替尼可以降低胸腔积液中成团肿瘤细胞的数量（图14A）。我们对胸腔积液中肿瘤细胞DNA进行测序发现一些病人的
EGFR发生L858R突变，其它的是野生型EGFR（图15）。我们发现砷剂和吉非替尼不仅对EGFRL858R WT
病人胸腔积液中肿瘤细胞有疗效，对EGFR 病人也有疗效。我们通过Western Blot检测经砷剂和吉非替尼治疗后胸腔积液中肿瘤细胞的EGFR和其它相关蛋白的表达，结果显
WT
示，在EGFR 病人的，砷剂而非吉非替尼可以下调EGFR，磷酸化mTOR和磷酸化4E-BP1的L858R
表达，同时上调自噬标记物LC3的表达。然而，对一些EGFR 病人的肿瘤细胞，砷剂下调L858R
EGFR的表达的作用较强(2011123001)；而另一些EGFR 病人的肿瘤细胞，吉非替尼下调L858R
EGFR的表达较强(2012010501)，这表明EGFR 病人对EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼具有反应性（图16）。胸腔积液中的细胞经体外应用三氧化二砷以及吉非替尼处理后免疫荧结果显示砷剂可以上调自噬标志物LC3以及P62的表达（图17）。所有的证据表明砷剂不仅WT L858R
对EGFR 病人也对EGFR 病人发挥潜在疗效。砷剂和吉非替尼联合应用于治疗非小细胞肺癌将是一个很有前景的策略。
EGFR发生L858R突变，其它的是野生型EGFR（图15）。我们发现砷剂和吉非替尼不仅对EGFRL858R WT
病人胸腔积液中肿瘤细胞有疗效，对EGFR 病人也有疗效。我们通过Western Blot检测经砷剂和吉非替尼治疗后胸腔积液中肿瘤细胞的EGFR和其它相关蛋白的表达，结果显
WT
示，在EGFR 病人的，砷剂而非吉非替尼可以下调EGFR，磷酸化mTOR和磷酸化4E-BP1的L858R
表达，同时上调自噬标记物LC3的表达。然而，对一些EGFR 病人的肿瘤细胞，砷剂下调L858R
EGFR的表达的作用较强(2011123001)；而另一些EGFR 病人的肿瘤细胞，吉非替尼下调L858R
EGFR的表达较强(2012010501)，这表明EGFR 病人对EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼具有反应性（图16）。胸腔积液中的细胞经体外应用三氧化二砷以及吉非替尼处理后免疫荧结果显示砷剂可以上调自噬标志物LC3以及P62的表达（图17）。所有的证据表明砷剂不仅WT L858R
对EGFR 病人也对EGFR 病人发挥潜在疗效。砷剂和吉非替尼联合应用于治疗非小细胞肺癌将是一个很有前景的策略。
[0069] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。