来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22及其编码基因与应用。本发明所提供的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22，是如下a）或b）或c）的蛋白质：a）由序列表中序列2第21-434位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第21-434位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的由a）衍生的蛋白质。多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22具有较高的多聚半乳糖醛酸酶和果胶酶活性，其多聚半乳糖醛酸酶的比活力达65±0.2U/mg蛋白，其果胶酶的比活力达45±0.2U/mg蛋白，可用于食品加工。

权利要求

1.一种蛋白，是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列2第21-434位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1）或2）所示的基因：

1）其编码序列是序列表中序列1的第61-1305位核苷酸的DNA分子；

2）其编码序列是序列表中序列1的第1-1305位核苷酸的DNA分子。

4.下述1）-4）中的任一种生物材料：

1）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；

2）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组表达载体；

3）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；

4）含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。

5.制备权利要求1所述蛋白质的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求1所述蛋白质的步骤；所述生物细胞为微生物细胞。

6.制备表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的步骤。

7.权利要求1所述的蛋白质在作为多聚半乳糖醛酸酶或果胶酶中的应用。

8.权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在制备多聚半乳糖醛酸酶或果胶酶中的应用。

9.权利要求1所述的蛋白质在降解植物细胞壁中的应用。

10.权利要求1所述的蛋白质在降解果胶或多聚半乳糖醛酸中的应用。

说明书

来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22及其编码基因

与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种多聚半乳糖醛酸酶及其编码基因与应用，特别涉及来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛酸酶及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌多种重要的细胞壁降解酶或致病酶，其中多聚半乳糖醛酸酶(PG：EC 3.2.1.15)是多种植物病原卵菌分泌的一种重要致病酶，该类酶通过降解寄主植物细胞壁的果胶、中胶层而破坏寄主防御体系，近而增强病菌对寄主的亲合力，因此该类酶是一种重要的致病因子。研究表明多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁结合蛋白酶，可催化果胶分子中α-（1,4）-聚半乳糖醛酸裂解，降解细胞壁的果胶，导致细胞壁软化，利于病原菌的各种侵染结构、及其分泌的各种致病酶或致病毒素顺利侵染寄主组织细胞而导致寄主的病程发展。PG分为内切型（endo-）和外切型(exo-)两种，均由多基因编码，植物病原卵菌PG基因簇成员间所编码的多聚半乳糖醛酸酶的性能存在差异，该类酶降解寄主细胞壁的性能常由单个或几个关键Pg基因协同作用。因此，探索植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌的PG对寄主植物的致病作用，立足于致病靶标Pg基因及其编码的蛋白质功能特性研究，具重要的理论和实验意义。

[0003] 在世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物的病害，给农业生产造成了严重的损失。资料表明PG是多种植物病原卵菌的重要致病因子，辣椒疫霉病是一种重要的卵菌病害，能导致多种植物发生严重病害，深入开展辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici)多聚半乳糖醛酸酶基因分离及靶标基因编码的蛋白制作和功能分析具重要的实践意义，可以实现对于植物病原卵菌所导致的多种植物病害的防治与研究。

[0004] 而且，多聚半乳糖醛酸酶可用于食品加工，如在果汁和酒的生产中，多聚半乳糖醛酸酶可用于增加果汁的产量，便于加压和过滤，而且可以提高果汁和酒的透明度。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种多聚半乳糖醛酸酶。

[0006] 本发明所提供的多聚半乳糖醛酸酶，名称为PCIPG22，来源于辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici)的一个强致病菌株SD33，是如下a）或b）或c）的蛋白质：

[0007] a）由序列表中序列2第21-434位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0008] b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0009] c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第21-434位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的由a）衍生的蛋白质。

[0010] 其中，序列表中序列2由434个氨基酸残基组成，第1-20位氨基酸组成信号肽。a）所述的蛋白质是多聚半乳糖醛酸酶的成熟蛋白，b）所述的蛋白质是多聚半乳糖醛酸酶的前体蛋白。

[0011] 为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0012] 表1标签的序列

[0013]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0014] 上述（c）中的PCIPG22可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（c）中的PCIPG22的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至1305位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0015] 编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子也属于本发明的保护范围。

[0016] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0017] 所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：

[0018] 1）其编码序列是序列表中序列1的第61-1305位核苷酸的DNA分子；

[0019] 2）其编码序列是序列表中序列1的第1-1305位核苷酸的DNA分子；

[0020] 3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码上述多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的DNA分子；

[0021] 4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码上述多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的DNA分子。

[0022] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

[0023] 其中，序列表中的序列1由1305个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。

[0024] 下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

[0025] 1）含有编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子的表达盒；

[0026] 2）含有编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子的重组表达载体；

[0027] 3）含有编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子的重组微生物；

[0028] 4）含有编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子的转基因细胞系。

[0029] 上述生物材料中，1）所述的含有编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的DNA，该DNA不但可包括启动多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22基因转录的启动子，还可包括终止多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22转录的终止子。进一步，所述含有多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22表达盒还可包括增强子序列。2）所述的含有编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pPIC9K的多克隆位点插入多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22编码基因得到的重组表达载体。3）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。其中，酵母可来巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

[0030] 本发明的又一个目的是提供一种制备多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的方法。

[0031] 本发明所提供的制备多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的方法，包括将多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22编码基因在生物细胞中进行表达得到多聚半乳糖醛酸酶的步骤；所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

[0032] 本发明的再一个目的是提供一种制备表达多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的重组微生物的方法。

[0033] 本发明所提供的制备表达多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的重组微生物的方法，包括将多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的重组微生物的步骤。

[0034] 其中，所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。其中，酵母可来巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。

[0035] 多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22、编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子或含有编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子的生物材料在降解果胶中的应用，也属于本发明的保护范围。

[0036] 扩增编码多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的核酸分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。如扩增序列1的第58-1173位核苷酸的引物对。

[0037] 实验证明，多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22可降解辣椒细胞壁。多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22在降解植物细胞壁，如降解辣椒细胞壁中的应用也属于本发明的保护范围。

[0038] 多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22具有较高的多聚半乳糖醛酸酶和果胶酶活性，其多聚半乳糖醛酸酶的比活力达65±0.2U/mg蛋白，其果胶酶的比活力达45±0.2U/mg蛋白可用于食品加工，如在果汁和酒的生产中。

附图说明

[0039] 图1为pPIC9K-PCIPG22/GS115表达产物及其纯化蛋白SDS-PAGE电泳。

[0040] 左图中M为标准蛋白分子量，1为空载体pPIC9K/GS115表达产物，2-8为pPIC9K-PCIPG22/GS115于1-7天表达产物；右图中M为标准蛋白分子量，1和2为PCIPG22表达纯化蛋白。

[0041] 图2为多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22接种辣椒叶片168小时的电镜照片。

[0042] 图中A为PCIPG22对辣椒叶片细胞壁的降解效果，剑头所示；B为钝化的PCIPG22对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，剑头所示（阳性对照），C为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破坏作用，剑头所示（阴性对照）。

[0043] 图3为多聚半乳糖醛酸酶PCIPG2接种辣椒叶片168小时的电镜照片。

[0044] 图中A为PCIPG2对辣椒叶片细胞壁的降解效果，剑头所示；B为钝化的PCIPG2对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，剑头所示（阳性对照）；C为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破坏作用，剑头所示（阴性对照）。

[0045] 图4为多聚半乳糖醛酸酶PCIPG5接种辣椒叶片168小时的电镜照片。

[0046] 图中A为PCIPG5对辣椒叶片细胞壁的降解效果，箭头所示；B为钝化的PCIPG5对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，箭头所示（阳性对照）；C为无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破坏作用，箭头所示（阴性对照）。

具体实施方式

[0047] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0049] 实施例1、多聚半乳糖醛酸酶的制备

[0050] 1．多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5表达

[0051] 1.1制备多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5的编码基因[0052] 本 申 请 的 发 明 人 从 辣 椒 疫 霉 (P.capsici）SD33（J.Phytopathol157:585-591,2009)（山东农业大学）中发现了多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22基因、PCIPG2基因和PCIPG5基因。其中，多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码序列是序列1的第1-1305位，编码序列2的蛋白质。序列1的第1-60位编码由20个氨基酸残基组成的信号肽。PCIPG2基因核苷酸序列如序列表中序列3所示，其编码序列是序列3的第106-1191位。序列3的第106-162位编码由19个氨基酸残基组成的信号肽。PCIPG5基因核苷酸序列如序列表中序列4所示，其编码序列是序列4的第43-1128位。序列4的第43-102位编码由20个氨基酸残基组成的信号肽。

[0053] 根据序列表中序列1所示的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22基因设计扩增序列表中序列2第21-434位的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22成熟蛋白的一对引物PCIPG22mF、PCIPG22mR，并在上下游引物两端分别引入SnaB Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。PCIPG22mF和PCIPG22mR扩增的序列是序列1的第61-1305位，PCIPG22mF的序列为：GCAGGTACGTACACCACCACCACCACCACGATGCGGGTGCTACCACAC，PCIPG22mR 的序列为：ATTTGCGGCCGCTTAGCATTGAATGTTGCTAGGTT。

[0054] 根据序列表中序列3所示的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG2基因设计扩增序列表中序列3第20-361位氨基酸残基所示的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG2成熟蛋白的一对引物Pcipg2mF、Pcipg2mR，并在上下游引物两端分别引入EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。Pcipg2mF和Pcipg2mR扩增的序列是序列3的第163-1191位核苷酸，Pcipg2mF的序列为：5’-ACTCGAATTCCACCACCACCACCACCACTCGCCTATGCTGCGCG-3’，Pcipg2mR的序列为：5’-ACTTGCGGCCGCTTAGCACTTGACTGT-3’。

[0055] 根据序列表中序列4所示的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG5基因设计扩增序列表中序列4第21-361位氨基酸残基所示的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG5成熟蛋白的一对引物Pcipg5mF、Pcipg5mR，并在上下游引物两端分别引入EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。Pcipg5mF和Pcipg5mR扩增的序列是序列4的第103-1128位核苷酸，Pcipg5mF的序列为：

[0056] 5’-TATAGAATTCCACCACCACCACCACCACGACGACGACGACAAGACACCCATGATCCGTCAGGC-3’，Pcipg5mR的序列为：

[0057] 5’-TATAGCGGCCGCTTAGCACTTGACAGTGCTGG-3’。

[0058] 以 辣 椒 疫 霉 (P.capsici）SD33（山 东 农 业 大 学）（J.Phytopathol157:585-591,2009)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用上述引物分别进行PCR扩增，将扩增产物回收后分别与pGEM-T Easy Vector（Promega）连接，并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，将含有序列1的第61-1305位的重组质粒命名为pGEM-PCIPG22m，将含有序列3的第163-1191位核苷酸的重组质粒命名为pGEM-pcipg2m；将含有序列4的第103-1128位核苷酸的重组质粒命名为pGEM-pcipg5m。

[0059] 2.在巴斯德毕赤酵母中表达多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5[0060] 2.1制备表达载体及工程菌

[0061] 将pGEM-PCIPG22m用SnaB Ⅰ和Not Ⅰ双酶切；pGEM-pcipg2m和pGEM-pcipg5m分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，分别回收插入片断，并与同样双酶切的酵母表达质粒pPIC9K（Invitrogen）进行连接，转化大肠杆菌JM109，转化的JM109经Amp抗性筛选，菌落经37℃摇培过夜后抽提质粒，重组质粒用酶切及鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，将在pPIC9K载体的SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点之间定向插入序列1的第61-1305位的重组质粒命名为pPIC9K-PCIPG22m，将在pPIC9K载体的EcoR Ⅰ和Not Ⅰ位点之间定向插入序列3的第163-1191位核苷酸的重组质粒命名为pPIC9K-pcipg2m；将在pPIC9K载体的EcoR Ⅰ和Not Ⅰ位点之间定向插入序列4的第103-1128位核苷酸的重组质粒命名为pPIC9K-pcipg5m。

[0062] 将pPIC9K、pPIC9K-PCIPG22m、pPIC9K-pcipg2m和pPIC9K-pcipg5m用Sal Ⅰ限+ +制性内切酶（位于HIS4区域内）进行线性化酶切，以获得GS115HisMut 表型转化子。将回收纯化目的片段采用电击法转化巴斯德毕赤酵母GS115（Invitrogen）感受态细胞，筛+ +
选HisMut（即组氨酸快速利用型）的酵母重组子。以酵母转化子基因组DNA为模板，使用AOX1特征引物（5’AOX1 Primer:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′和3’AOX1 primer:
5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’）和上述基因特异性引物进行PCR扩增，将用PCIPG22mF和PCIPG22mR扩增得到约1300bp和用AOX1特征引物扩增得到约1800bp的pPIC9K-PCIPG22m转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的转化子命名为pPIC9K-PCIPG22m/GS115（PCIPG22基因已整合到Pichia pastaris GS115的基因组中）。将用Pcipg2mF和Pcipg2mR扩增得到约1000bp和用AOX1特征引物扩增得到约1500bp的pPIC9K-pcipg2m转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的转化子命名为pPIC9K-pcipg2m/GS115（PCIPG2基因已整合到Pichia pastaris GS115的基因组中）。将用Pcipg5mF和Pcipg5mR扩增得到约1000bp和用AOX1特征引物扩增得到约1500bp的pPIC9K-pcipg5m转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的转化子命名为pPIC9K-pcipg5m/GS115（PCIPG5基因已整合到Pichia pastaris GS115的基因组中）。将用AOX1特征引物扩增得到约500bp的转化pPIC9K的重组巴斯德毕赤酵母命名为pPIC9K/GS115（空载体对照）。

[0063] 2.2酵母工程菌的培养和多聚半乳糖醛酸酶的诱导分泌表达

[0064] 1）分别挑取pPIC9K-PCIPG22m/GS115、pPIC9K-pcipg2m/GS115、pPIC9K-pcipg5m/GS115和pPIC9K/GS115菌落，接种于含25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，28-30℃振荡培养（250－300rpm）至对数生长期（OD600达2-6，约16-18小时）。

[0065] 2）室温下以3000g离心5min回收酵母细胞。弃去上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD600值为1.0（约100-200mL）。

[0066] 3）将培养液置于1L摇瓶中，覆盖两层无菌纱布，置摇床中，28-30℃继续培养并开始诱导表达。

[0067] 4）诱导表达起始后，每隔24小时补加100%甲醇至终浓度为0.5%以维持诱导。

[0068] 5）间隔24小时取样一次，至168小时，每次取诱导培养液1mL于1.5mL离心管中，室温下以最大转速离心2-3min，取上清液进行SDS-PAGE电泳（以不加甲醇诱导剂的质粒诱导的蛋白为对照）。

[0069] 电泳结果表明pPIC9K-PCIPG22m/GS115经甲醇诱导后，在65kDa处有一条特异蛋白带，而空载体对照则无此带，说明PCIPG22基因已经在毕赤酵母中进行了有效的表达（图1）；pPIC9K-pcipg2m/GS115经甲醇诱导后，在37kDa处有一条特异蛋白带，而空载体对照则无此带，说明PCIPG2基因已经在毕赤酵母中进行了有效的表达；表明pPIC9K-pcipg5m/GS115经甲醇诱导后，在40kDa处有一条特异蛋白带，而空载体对照则无此带，说明PCIPG5基因已经在毕赤酵母中进行了有效的表达。

[0070] 2.3多聚半乳糖醛酸酶纯化及其活性测定

[0071] 其中，多聚半乳糖醛酸酶的纯化方法如下：

[0072] 2.3.1蛋白样品的制备

[0073] 按照步骤2.2中1）-4）的方法进行诱导表达，诱导168小时后取诱导培养液按照如下方法进行蛋白样品的制备。

[0074] (1)收集诱导培养液，6000rpm离心30min，弃沉淀，取上清液。

[0075] (2)将上清液按照60%的饱和度加入(NH4)2SO4沉淀多聚半乳糖醛酸酶，8000rpm离心30min，收集沉淀。

[0076] (3)沉淀用8ml Native Binding Buffer（Invitrogen R901-15）重新悬浮后，透析过夜弃除盐离子，透析产物即待纯化的蛋白样品。

[0077] 2.3.2多聚半乳糖醛酸酶的纯化

[0078] 2.3.2.1Ni-NTA凝胶纯化柱准备

[0079] (1)吸取1.5ml凝胶树脂加入至10ml凝胶纯化Ni-NTA柱中，轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。

[0080] (2)加入6ml双蒸水，重新悬浮树脂。

[0081] (3)轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。

[0082] (4)加入6ml Native Binding Buffer（Invitrogen R901-15），重新悬浮树脂。

[0083] (5)连续重复步骤3三次。

[0084] (6)连续重复步骤4-5三次。

[0085] 2.3.2.2多聚半乳糖醛酸酶纯化

[0086] (1)取可溶性蛋白8ml注入Ni-NTA柱中。

[0087] (2)轻柔搅拌使树脂在蛋白液中悬浮，吸附30-60min，去掉上清。

[0088] (3)用8ml Native Wash Buffer（Invitrogen R901-15）冲洗，使树脂沉淀至柱子底部，去掉上清。

[0089] (4)重复步骤3三次。

[0090] (5)用8-12ml Native Elution Buffer（Invitrogen R901-15）洗脱蛋白。

[0091] (6)重复步骤5一次，收集洗脱样品，取1ml洗脱液进行SDS-PAGE分析。

[0092] (7)将洗脱液用双蒸水透析，去盐离子，获得纯的多聚半乳糖醛酸酶的酶液。

[0093] 2.3.3多聚半乳糖醛酸酶活测定

[0094] 其中，多聚半乳糖醛酸活性测定方法如下：

[0095] 用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定多聚半乳糖醛酸酶活性：3,5-二硝基水杨酸1g溶于20mL氢氧化钠溶液（1mol/L）中，加入蒸馏水50mL、酒石酸钾钠30g，溶解后用蒸馏水稀释至100mL，密封防止二氧化碳进入。取0.1%多聚半乳糖醛酸（SigmaP3850）溶液（用
50mmol/L NaAc，pH5.0缓冲液配制）1.8mL，加酶液100μL、150mmol/L NaAc（pH5.0）缓冲液
100μL，30℃水浴1h。酶作用后的溶液0.2mL与DNS试剂0.2mL混合，沸水浴加热10min。
混合物用水稀释至3mL，在540nm下用UV-1601型紫外分光光度计比色，以不加酶液的多聚半乳糖醛酸作对照，记录OD值。一个酶活力单位(U)定义为：1分钟内水解1μmol多聚半乳糖醛酸所需的多聚半乳糖醛酸酶的量。

[0096] 实验设三次重复。结果表明由pPIC9K-PCIPG22/GS115表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的酶活力为65±0.2U/mg蛋白，pPIC9K-pcipg2/GS115表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶PCIPG2的酶活力为23±0.2U/mg蛋白，pPIC9K-pcipg5/GS115表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶PCIPG5的酶活力为28±0.2U/mg蛋白。pPIC9K/GS115表达产物无多聚半乳糖醛酸酶活性。

[0097] 2.3.4果胶酶活测定

[0098] 用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定果胶酶活性：3,5-二硝基水杨酸1g溶于20mL氢氧化钠溶液（1mol/L）中，加入蒸馏水50mL、酒石酸钾钠30g，溶解后用蒸馏水稀释至100mL，密封防止二氧化碳进入。取0.5%果胶（Solarbio P9135-25）溶液（用50mmol/L NaAc，pH5.0缓冲液配制）1.8mL，加酶液100μL、l 50mmol/L NaAc（pH5.0）缓冲液100μL，
30℃水浴1h。酶作用后的溶液0.2mL与DNS试剂0.2mL混合，沸水浴加热10min。混合物用水稀释至3mL，在540nm下用UV-1601型紫外分光光度计比色，以不加酶液的果胶作对照，记录OD值。一个酶活力单位(U)定义为：每分钟每毫克酶蛋白催化底物释放1μmol D-半乳糖醛酸为一个酶活单位。

[0099] 实验设三次重复。结果表明由pPIC9K-PCIPG22/GS115表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22的果胶酶酶活力为45±0.2U/mg蛋白，pPIC9K-pcipg2/GS115表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶PCIPG2的果胶酶酶活力为12±0.2U/mg蛋白，pPIC9K-pcipg5/GS115表达纯化产物多聚半乳糖醛酸酶PCIPG5的果胶酶酶活力为14±0.2U/mg蛋白。pPIC9K/GS115表达产物无果胶酶活性。

[0100] 实施例2、多聚半乳糖醛酸酶对辣椒叶片细胞壁的降解

[0101] 将实施例1中纯化的多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5采用针刺法接种辣椒叶片。具体方法如下：取4-6叶期中椒6号辣椒苗，采用针刺法接种辣椒叶片，PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5的接种浓度均为700ug/mL。同时以无菌水接种和钝化的PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5作为对照。蛋白接种辣椒叶片1-7天期间，间隔24小时取样一次，进行透射电镜观察细胞壁降解情况。其中，钝化的PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5按照如下方法获得：将实施例1中纯化多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22、PCIPG2和PCIPG5经热水煮沸5min后用于活性检测。

[0102] 多聚半乳糖醛酸酶PCIPG22在接种168小时时将辣椒叶片细胞壁完全降解至破裂的程度，钝化的PCIPG22和无菌水对辣椒叶片细胞壁无破坏作用（图2），多聚半乳糖醛酸酶PCIPG2在接种后一直到168小时只对辣椒叶片细胞壁轻微降解，钝化的PCIPG2和无菌水对辣椒叶片细胞壁无破坏作用（图3）；多聚半乳糖醛酸酶PCIPG5在接种168小时时将辣椒叶片细胞壁降解至轻微破裂的程度，钝化的PCIPG5和无菌水对辣椒叶片细胞壁无破坏作用（图4）。