检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的PCR引物及其方法转让专利
申请号 : CN201210146752.X
文献号 : CN102653800B
文献日 : 2013-03-20
发明人 : 高必达 , 赵慧茹
申请人 : 湖南农业大学
摘要 :
本发明公开了一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物及其方法，本发明的引物是黄瓜绿斑驳花叶病毒特异的，除了特异性好之外，还具有对不同的CGMMV分离物覆盖率最高的特点，能有效检测到不同的CGMMV分离物，检测结果更加准确，且检测时不需加辅助引物，更加方便。本发明的检测方法可适用于大批量葫芦科作物种子中CGMMV的直接检测，在降低了检测成本，减少了工作量的同时，保留了快速、准确、灵敏度高等优势。
权利要求 :
1.一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物，其特征在于：其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，其特征在于：提取待测样品总RNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行RT-PCR，然后取扩增产物进行检测，若扩增产物大小约为
323bp，则待测样品中存在黄瓜绿斑驳花叶病毒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述待测样品是葫芦科植物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述待测样品是植物种子。
说明书 :
检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的PCR引物及其方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测植物中黄瓜绿斑驳花叶病毒的PCR引物及其方法，具体而言，涉及一种特异性检测葫芦科植物种子中黄瓜绿斑驳花叶病毒的PCR引物及其检测方法。
背景技术
[0002] 黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是烟草花叶病毒属的重要成员之一，主要侵染黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科植物，自1935年英国首次报道以来，已广泛分布于亚洲、欧洲、南美洲的多个国家和地区，对葫芦科作物的生产2
造成了严重的经济损失。2005年辽宁省盖州市首次发现CGMMV，西瓜发病面积达333 hm ,
2
其中13 hm 绝收。2006年和2007年此病毒分别被列为全国农业植物检疫性有害生物和进境植物检疫性有害生物。目前，我国已有辽宁、北京、河北、山东、甘肃、湖北、云南、广西、四川、广东、浙江、湖南等省市的多个地区发现该病毒。
造成了严重的经济损失。2005年辽宁省盖州市首次发现CGMMV，西瓜发病面积达333 hm ,
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其中13 hm 绝收。2006年和2007年此病毒分别被列为全国农业植物检疫性有害生物和进境植物检疫性有害生物。目前，我国已有辽宁、北京、河北、山东、甘肃、湖北、云南、广西、四川、广东、浙江、湖南等省市的多个地区发现该病毒。
[0003] 目前， CGMMV的检测技术主要有酶联免疫吸附法和实时荧光RT-PCR等分子生物学检测方法。但是本发明人在实际的检测中发现现有检测方法存在的一些弊端：一是在PCR扩增时存在引物特异性不好，引物对不同CGMMV分离物覆盖率低等问题；二是在检测种子时，现有的检测方法一般要求先播种，待种子长到3、4叶期时，分类并采集叶片后提取总RNA进行检测，或者直接提取单粒或几粒种子的总RNA进行检测，这种提取总RNA 的方法存在耗时长，成本高，工作量大等缺点，不适用于大批量种子的检测。虽然现有技术也有研究人员探索PCR检测方法，但也存在不够灵敏和覆盖面不全面的缺点，例如中国检验检疫科学研究院2011年01月18日申请的的发明名称为“快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物对及其应用”的专利申请(申请号为201110020249.5 )，其中发明的特异性引物，并没有与CGMV全基因组核苷酸序列达到100的覆盖率，即正向引物：5’ –GAAGAGTCCAGTTCTGTTTC-3’ 在NCBI中经BLAST检索发现有四条CGMMV全基因组核苷酸序列与其只有85%的覆盖率；2009年07月07日中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布的《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》 中 《黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法》里所描述的用于RT-PCR检测的特异性引物，都存在CGMMV全基因组核苷酸序列与正向引物还是反向引物没有达到100%覆盖率的情况。上述现有技术的PCR引物显然不能检测出某些CGMMV分离物，存在检测错误的可能。因此有必要建立一种更加快速、更加准确检测种子中CGMMV的方法，对于PCR检测方法而言，需要找到更加合适的引物。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的PCR引物及其方法，利用本发明所述引物及方法能够更加快速、更加准确、直接检测出种子中黄瓜绿斑驳花叶病毒。
[0005] 本发明提供的技术方案是：一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0006] 同时，本发明还提供一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，该方法以提取待测样品总RNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行RT-PCR，然后取扩增产物进行检测，若扩增产物大小约为323bp，则待测样品中存在黄瓜绿斑驳花叶病毒。
[0007] 上述方法中，所述待测样品是葫芦科植物。
[0008] 上述方法中，所述待测样品是植物种子。
[0009] 本发明具有以下有益效果：
[0010] 本发明中设计的特异性引是物根据CGMMV核苷酸序列的高保守区所设计，与其它引物相比较，除了特异性好之外，还具有对不同的CGMMV分离物覆盖率最高的特点，能有效检测到不同的CGMMV分离物，检测结果更加准确，且检测时不需加辅助引物，更加方便。本发明的检测方法可适用于大批量葫芦科作物种子中CGMMV的直接检测，在降低了检测成本，减少了工作量的同时，保留了快速、准确、灵敏度高等优势。
附图说明
[0011] 图1为本发明反向引物与CP000227.1序列对比图。
[0012] 图2为本发明反向引物与CP003244.1序列对比图。
[0013] 图3为本发明引物扩增的琼脂糖凝胶电泳图，图中各泳道从左至右依次为DL2000 DNA marker、携带CGMMV的砧木种子、健康砧木种子。
[0014] 图4为电泳结果图：其用本发明特异性引物分别对感染了CGMMV的西瓜病株,携带CGMMV的砧木种子，感染了烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）的烟草病株，未知病毒感染的南瓜病株进行RT-PCR检测，图中各泳道从左至右依次为DL2000 DNA marker、携带CGMMV的砧木种子、西瓜病株、烟草花叶病毒感染的烟草病株和未知病毒感染的南瓜病株。
具体实施方式
[0015] 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0016] 一、设计引物：
[0017] 本发明人利用病毒衣壳蛋白（CP）基因核苷酸序列进化的保守性，从NCBI搜索并下载黄瓜绿斑驳花叶病毒及其相近病毒的CP基因核苷酸序列，运用MEGA4.0软件对这些序列进行比对，从扩展名为mas的文件中找出不同研究者报告的黄瓜绿斑驳花叶病毒衣壳蛋白基因核苷酸序列所共有其它病毒序列均与之不同的引物候选区，然后设计出的一对特异性引物，引物序列如下：
[0018] 正向引物：5’- CGAGTCCCTGTCTGCGTT -3’ （SEQ ID No.1）
[0019] 反向引物：5’- ACCAGACTACCGAAAACG -3’（ SEQ ID No.2）。
[0020] 上述引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，预期的PCR产物为323bp。
[0021] 将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见下表1和下表2。
[0022] 表2中出现了本发明反向引物序列的2个覆盖率和相同率均为100%非CGGMV序列（登录号CP000227.1和CP003244.1，分别为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和水生拉恩菌Rahnella aquatilis的序列），但从图1和图2可以看出，这两个序列都是分两段覆盖才有100％覆盖率。所以，真正与本发明所述正向引物和反向引物的序列均能100％覆盖且100％相同的全部是CGMMV核苷酸序列。
[0023] 因此，本发明的引物的特异性是非常好的，采用RT-PCR反应系统，能成功扩增出CGMMV特异性序列。
[0024] 表1 CGMMV正向引物的BLAST结果
[0025]
[0026] 表2 CGMMV反向引物的BLAST结果
[0027]
[0028] 二、病毒的RT-PCR过程：
[0029] 提取种子总RNA：用粉碎机将感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的砧木种子打碎、混匀，取适量于研钵中，加液氮研磨后，用Trizol提取总RNA，具体操作依试剂说明书进行。所用Trizol试剂购自上海英骏生物技术有限公司，氯仿、异戊醇等其它试剂均为国产分析纯试剂。
[0030] 用上述设计的引物对提取的总RNA进行RT-PCR扩增，预计扩增片段约为323bp。
[0031] 反转录反应体系20μL如下：2.0μL总RNA，4.0μL 5×第一链缓冲液，2.0μL -1 -1dNTPs（2.5 mmol·L ），2.0μL反向 引物（10 μmol·L ），1.0μL M-MLV反 转录 酶-1
（200U·μL ），9μL RNase free H2O，室温静置10min，42℃1h 后，4℃保存。
（200U·μL ），9μL RNase free H2O，室温静置10min，42℃1h 后，4℃保存。
[0032] PCR反应体系25μL如下：2.0μL 反转录产物，3.0μL 10×反应缓冲液，4.0μL -1 -1dNTPs（2.5 mmol·L ），0.5μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL ），0.5μL正向引物（10 -1 -1
μmol·L ），0.5μL反向引物（10 μmol·L ），14.5μL RNase free H2O。
μmol·L ），0.5μL反向引物（10 μmol·L ），14.5μL RNase free H2O。
[0033] 扩增条件： 94℃预变性3 min；94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 30sec，30个循环； 72℃延伸10 min。
[0034] 三、PCR扩增产物的鉴定：
[0035] PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像系统检查，出现与预期大小相符的目的条带，具体请参见图3。对PCR产物进行测序，测序结果经BLAST， 确实为黄瓜绿斑驳花叶病毒。
[0036] 本发明的PCR引物可以用于PCR衍生技术，如实时荧光PCR。
[0037] 用本发明特异性引物分别对感染了CGMMV的西瓜病株，携带CGMMV的砧木种子，感染了烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）的烟草病株，未知病毒感染的南瓜病株做RT-PCR检测，电泳结果请参见图4。结果表明只有感染了CGMMV的西瓜植株和携带CGMMV的砧木种子呈阳性，扩增出预期的323个碱基的条带，而其它均为阴性。
[0038] 由以上实例可知，本发明的该对特异性引物对黄瓜绿斑驳花叶病毒是特异的，采用该引物直接对种子中黄瓜绿斑驳花叶病毒做RT-PCR检测，可得到准确的结果。