针对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抗体以及使用方法转让专利
申请号 : CN201080046058.X
文献号 : CN102656189B
文献日 : 2014-10-08
发明人 : R·A·威廉森 , J·瓦迪亚 , G·帕斯夸尔 , E·基奥
申请人 : 克鲁塞尔荷兰公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种抗体或其抗原结合片段,其包含:
VH CDR1,其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1627所示的氨基酸残基序列组成;
VH CDR2,其由SEQ ID NO:3所示的氨基酸残基序列组成;
VH CDR3,其由SEQ ID NO:4所示的氨基酸残基序列组成;
VL CDR1,其由SEQ ID NO:6所示的氨基酸残基序列组成;
VL CDR2,其由SEQ ID NO:7所示的氨基酸残基序列组成;和VL CDR3,其由SEQ ID NO:8所示的氨基酸残基序列组成,其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白和/或中和RSV。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段,其包含SEQ ID NO:1所示的重链和SEQ ID NO:5所示的轻链。
3.权利要求1的抗体或抗原结合片段,其包含VH结构域,其中所述VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的氨基酸1-125所示,其还包含VL结构域,其中所述VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5的氨基酸1-107所示。
4.权利要求1的抗体或抗原结合片段,其直接或通过接头连接至多聚化结构域,或者连接至多肽接头。
5.权利要求1的抗体或抗原结合片段,其进一步包含蛋白转导结构域。
6.权利要求5的抗体或抗原结合片段,其中所述蛋白转导结构域由SEQ ID NO:1529-1600之一所示的氨基酸序列组成。
7.权利要求1-6中任一项的抗体或抗原结合片段在制备通过以下方法检测RSV感染的试剂盒中的用途,所述方法包括:(a)利用权利要求1-6中任一项的抗体或抗原结合片段测定流体、细胞或组织样品中的RSV抗原水平;
(b)将所测定的RSV抗原水平与对照水平比较,由此与RSV抗原的对照水平相比,所测定的RSV抗原水平的提高代表RSV感染。
8.一种核酸分子,其编码权利要求1-6中任一项的抗体或抗原结合片段。
9.一种分离的细胞,其包含权利要求1-6中任一项的抗体或抗原结合片段、或者权利要求12的核酸分子。
10.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法,其包括在表达所编码的抗体或抗原结合片段的条件下培养权利要求9的细胞。
11.权利要求1-6中任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或预防病毒感染的药物组合物中的用途。
说明书 :
针对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抗体以及使用方法
技术领域
片段的诊断和治疗方法。所述治疗方法包括施用所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用
于预防或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状,例如婴儿中的感染以及与
器官移植相关的感染。本文所提供的多种不同抗RSV抗体及其抗原结合片段的组合和/或
与其他抗RSV抗体及其抗原结合片段的组合可以用于联合治疗。还提供了含有抗RSV抗体
及其抗原结合片段的混合物的组合物。
背景技术
毛细支气管炎的主要原因(Welliver(2003)J Pediatr 143:S112)。估计全世界6.4×10 例
呼吸道疾病和160,000例死亡可归因于RSV诱导的疾病。仅在美国,数万婴儿住院是由于
副粘病毒感染,例如RSV和副流感病毒(PIV)(Shay et al.(1999)JAMA 282:1440-1446)。严重RSV感染最常发生在儿童和婴儿中,特别是早产儿。诸如慢性肺疾病或先天性心脏病的
潜在的健康问题可以显著增加严重疾病的风险。RSV感染还可以在老人、患有慢性肺疾病的个体和免疫低下的成人(例如骨髓移植接受者)中引起严重疾病。
离自供体的静脉注射免疫球蛋白(RSV-IGI V; )和单克隆抗体帕利珠单抗
TM
(SYNAGIS )已被批准用于高风险儿童中的RSV预防。然而,尚没有RSV的疫苗或可商购的
治疗。仅利巴韦林被批准用于治疗RSV感染。由于其低特异性,,需要高剂量、频繁施用和/或大量抗体产品(例如RSV-IG和帕利珠单抗)来有效治疗RSV感染。而且,诸如静脉注
射免疫球蛋白的产品的使用取决于供体可用性。因此,需要用于预防或治疗RSV感染的其
他物质。
分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。本文提供免疫特异性地结合并中和RSV的分离的多
肽、抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,当本文所提供的多肽包含在抗体或抗原结合片段中时,本文所提供的多肽免疫特异性地结合并中和RSV。本文还提供含有本文所提供的
多肽的抗体和抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段免疫特异性地结合并中和RSV。
本文所提供的多肽、抗体和抗原结合片段可以特异性结合F蛋白以及中和RSV。本文提供可
以中和RSV A和B亚型的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。本文提供免疫特异性地结合
RSV的F蛋白的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,本文所提供的分离的
多肽、抗体或其抗原结合片段含有SEQ ID NO:1-16和1627-1628中任一个所示的氨基酸序
列,其中所述分离的多肽免疫特异性地结合RSV融合(F)蛋白。在一些实例中,所述分离的
多肽含有与SEQ ID NO:1-16中任一个所示的氨基酸序列具有60%、65%、70%、80%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相同性的多肽,其中所述分离的多肽免疫特异性地结合RSV融合(F)蛋白。
8所示的氨基酸序列。在其他实例中,所述分离的抗体或其抗原结合片段含有与SEQ ID NO:
2-4、6-8和1627中任一个所示的氨基酸序列具有60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相同性的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。本文提供免疫特异性地与以下抗体或其抗原结合片段结合RSV F蛋白上或RSV病毒上的相同表位的抗RSV抗体或抗原结合片段:抗体或其抗原结合片段,其
含有:VH CDR1,其具有SEQID NO:2或1627所示的氨基酸序列;VH CDR2,其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;VH CDR3,其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;VLCDR1,其具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;VL CDR2,其具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列;以及VL CDR3,其具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;或者分离的抗体或其抗原结合片段,其包含与SEQ ID NO:2-4、6-8和1627所示的氨基酸序列具有60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相同性的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
一些实例中,本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链,所述轻链具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在一些实例中,本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结构域,所述VL结构域具有SEQ ID NO:5的氨基酸1-107所示的氨基酸序列。在一特定实
例中,所述分离的抗体或其抗原结合片段为58c5。
同表位。
些实例中,本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VH CDR2,所述VH CDR2具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一些实例中,本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含
VHCDR3,所述VH CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一些实例中,本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段包含:VH CDR1,其具有SEQ ID NO:2或1627所示的氨基酸序列;
VH CDR2,其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;以及VH CDR3,其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
VL CDR1,其具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;VL CDR2,其具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;以及VL CDR3,其具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
一些实例中,本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含轻链,所述轻链具有SEQ ID NO:
13所示的氨基酸序列。在一些实例中,本文所提供的分离的抗体或抗原结合片段包含VL结
构域,所述VL结构域具有SEQ ID NO:13的氨基酸1-107所示的氨基酸序列。在一特定实例
中,所述分离的抗体或抗原结合片段为sc5。
同表位。
白的分离的多肽、抗体或其抗原结合片段,其具有SEQ ID NO:1629所示的氨基酸序列。
1-约50个氨基酸。
原结合部分形成多价抗体。在一些实例中,本文所提供的多价抗体包含1、2、3、4或5个额外的抗原结合部分。示例性多价抗体包括二价、三价、四价、五价、六价或七价抗体。本文所提供的多价抗体包括异二价(heterobivalent)或同二价(homobivalent)抗体。本文所提
供的多价抗体包括多特异性抗体。在一些实例中,所述多特异性抗体为双特异性、三特异性或四特异性抗体。在一些实例中,本文所提供的多价抗体包含抗原结合片段,所述抗原结合片段为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。本文所提供的多价抗体的第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分可以通过共价或非共价键缀合
至多聚化结构域。在一些实例中,所述抗原结合部分通过接头(例如化学接头或多肽接头)
缀合至所述多聚化结构域。在一些实例中,本文所提供的多价抗体的多聚化结构域选自免
疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补疏水区、互补亲水区或相容的蛋白-蛋白相互作用结构域。在一些实例中,所述Fc结构域为IgG、IgM或IgE Fc结构域。
片段。
缀合至第二多聚化结构域的抗病毒抗体,所述抗病毒抗体免疫特异性地结合副流感病毒
(PIV)抗原或人偏肺病毒(hMPV)抗原。
更多种不同的选自本文所提供的抗体或抗原结合片段的抗RSV抗体或抗原结合片段。在
一些实例中,所述组合包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段以及选自帕利珠单抗、莫
他珠单抗、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2或它们的抗原结合片段的抗体。在一些实例中,所述组合包含本文所提供的抗体或其抗原
结合片段以及选自免疫特异性地结合副流感病毒(PIV)抗原或人偏肺病毒(hMPV)抗原的
抗体或其抗原结合片段的抗体。在一些实例中,所述PIV抗原为人PIV 1型、人PIV 2型、人PIV 3型和/或人PIV 4型的抗原。在一些实例中,所述PIV抗原选自PIV核衣壳磷蛋白、
PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋白、PIV血凝素-神经氨酸
酶(HN)糖蛋白、PIV RNA依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIVD蛋白、PIV C蛋白以及它们
的等位变体。在一些实例中,所述hMPV抗原为hMPV A型或hMPV B型的抗原。在一些实例
中,所述hMPV抗原为hMPV A1亚型、hMPV A2亚型、hMPV B1亚型或hMPV B2亚型的抗原。在
一些实例中,所述hMPV抗原选自hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水蛋
白、hMPV RNA依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPV G蛋白以及它们的等位变体。
病毒抗体为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。
赋形剂。在一些实例中,本文所提供的药物组合物配制为凝胶剂、软膏剂、液体制剂、混悬剂、气雾剂、片剂、丸剂、散剂或鼻腔喷雾剂。在一些实例中,配制本文所提供的药物组合物用于肺部、鼻内或肠胃外施用。在一些实例中,配制本文所提供的药物组合物用于单剂量施用。在一些实例中,配制本文所提供的药物组合物用于缓释。
组合物包含两种或更多种不同的选自本文所提供的抗体或抗原结合片段的抗RSV抗体或
抗原结合片段。在一些实例中,所述药物组合物包含本文所提供的抗体或抗原结合片段以
及选自帕利珠单抗、莫他珠单抗、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4R4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2或它们的抗原结合片段的抗体。在一些实例中,所述药物组合物包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段以及选自免疫特异性地结合副流感病毒(PIV)抗原或
人偏肺病毒(hMPV)抗原的抗体或其抗原结合片段的抗体。在一些实例中,所述PIV抗原为
人PIV 1型、人PIV 2型、人PIV 3型和/或人PIV 4型的抗原。在一些实例中,所述PIV抗
原选自PIV核衣壳磷蛋白、PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋
白、PIV血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白、PIV RNA依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D
蛋白、PIV C蛋白以及它们的等位变体。在一些实例中,所述hMPV抗原为hMPV A型或hMPV
B型的抗原。在一些实例中,所述hMPV抗原为hMPV A1亚型、hMPV A2亚型、hMPV B1亚型或
hMPV B2亚型的抗原。在一些实例中,所述hMPV抗原选自hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV
基质蛋白、hMPV小疏水蛋白、hMPV RNA依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPV G蛋白以及它们的等位变体。
外的抗病毒抗体为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。
法,其包括给所述对象施用治疗有效量的本文所提供的药物组合物。本文还提供预防对象
中的病毒感染的方法,其包括给所述对象施用治疗有效量的本文所提供的药物组合物。在
一特定实例中,所述病毒感染为RSV感染。在一特定实例中,所述RSV感染为上呼吸道感染。
施用本文所提供的药物组合物1次、2次、3次、4次或5次。
毒剂可以顺序、同时或间歇施用。
其抗原结合片段一起施用。所述药物组合物与所述一种或多种额外的抗病毒抗体配制为
单一组合物或分离的组合物。所述药物组合物与所述一种或多种额外的抗RSV抗体可以
顺序、同时或间歇施用。在一些实例中,所述抗原结合片段为单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体、Fd或Fd’片段。
抗、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2或它们的抗原结合片段。
(hMPV)抗原的抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,所述PIV抗原为人PIV 1型、人PIV
2型、人PIV 3型和/或人PIV 4型的抗原。在一些实例中,所述PIV抗原选自PIV核衣壳磷
蛋白、PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋白、PIV血凝素-神
经氨酸酶(HN)糖蛋白、PIV RNA依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIVD蛋白、PIV C蛋白以
及它们的等位变体。在一些实例中,所述hMPV抗原为hMPV A型或hMPV B型的抗原。在一
些实例中,所述hMPV抗原为hMPV A1亚型、hMPV A2亚型、hMPV B1亚型或hMPV B2亚型的抗
原。在一些实例中,所述hMPV抗原选自hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小
疏水蛋白、hMPV RNA依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPV G蛋白以及它们的等位变体。
比较,其中与RSV抗原的对照水平相比,所测定的RSV抗原水平的提高代表RSV感染。在一
些实例中,所述细胞或组织样品获得自人类对象。在一些实例中,所述细胞或组织样品为血液、尿、唾液、肺痰、灌洗或淋巴样品。
提供转基因动物,其包含本文所提供的核酸或本文所提供的载体。本文还提供表达分离的
抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括在表达所编码的抗体的条件下培养本文所提
供的分离的细胞或者通过从本文所提供的转基因动物分离所述抗体或抗原结合片段。在一
些实例中,所述抗体或抗原结合片段分离自所述转基因动物的血清或乳汁。
的病毒感染的一种或多种症状的用途。
制个体中的病毒感染的一种或多种症状的药物中的用途。
址时,应当理解这类标识符可以改变,并且在网络上特定的信息可以交流,但是通过搜索网络可以找到等同的信息。对其引用证明这类信息的可得性和公开传播。
域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段,例
如抗RSV抗体片段。如本文所用,因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段,例如但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如,IgG、
IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如,IgG2a和IgG2b)的成员。
性结合能力;抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物,以及合成产生的
衍生物,例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段,包括修饰的片段(参见,例如,Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols(2003);Chapter 1;p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链,例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含
至少或约50个氨基酸,并且典型至少或约200个氨基酸。
入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少
7 8 -1
约10-10M 的Ka)抗原的抗体。抗原结合片段包括抗体片段,例如Fab片段、Fab′片段、
F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab),并且还包括其他片段,例如包含CDR的片段,以及免疫特异性地结合抗原的多肽或在插入抗体框架时获得免疫特异性地结合抗原的抗体的多肽。
体。在分离自任何来源或制备时,治疗性抗体可以是长度异质的或者翻译后修饰不同,例如糖基化(即糖含量)不同。治疗性抗体的异质性也可以不同,取决于所述治疗性抗体的来
源。因此,提及治疗性抗体时指制备或分离的异质群体。当预期同质制品时,其会被这样陈述。适当地,本文中提及治疗性抗体是关于它们的单体、二聚体、或其他多聚体形式。
述病毒的类别,所述表面蛋白可以是衣壳蛋白(例如无包膜病毒的衣壳蛋白)或病毒包膜
蛋白(例如,包膜病毒的病毒包膜蛋白)。在一些实例中,所述蛋白为糖蛋白。例如所述病
毒抑制病毒感染性的能力可以通过体外中和测定来测量,例如利用非洲绿猴肾细胞(Vero)
宿主细胞的空斑减少测定。
合。包膜病毒可以是球形或丝状(杆状)的。示例性包膜病毒包括但不限于疱疹病毒科
(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、披膜病毒
科(Togaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科
(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)以
及波纳病毒科(Bornaviridae)的成员。呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科、肺病毒亚科
(Pneumovirinae)的负义单链RNA有包膜病毒。
不限于腺病毒科(Adenoviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomavirinae)、细小病毒科
(Parvoviridae)、多瘤病毒科(Polyomavirinae)、圆环病毒科(Circoviridae)、呼肠孤病
毒科(Reoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)以及
星状病毒科(Astroviridae)。
越脂双层的蛋白)或非跨膜细胞表面相关蛋白(例如,锚定或共价连接至膜表面,如附着至
所述病原体表面上的另一蛋白)。其他示例性表面蛋白包括至少部分暴露于外部环境的无
包膜包膜病毒的病毒衣壳蛋白。
所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的
方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917;和Nelson et al.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如,单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备,例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还
可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主
细胞的克隆群体制备抗体。
白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和
VH-CH1-CH2-CH3链),并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于
VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
上包含两个Fab片段,其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸,包括形成连接两个片段
的二硫键的半胱氨酸。
接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
衍生物可以利用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来修饰,包括但不限于特异性化
学切割、乙酰化、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成。而且,抗RSV抗体或其抗原结合片段的衍生物可以包含一个或多个非经典氨基酸。通常,多肽衍生物具有与本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段相似或相同的功能(例如中和RSV)。
基序列以及来自另一不同多肽的全部或部分的氨基酸序列。这两部分可以直接或间接连
接,并且可以通过肽键、其他共价键或者在平衡条件和生理条件下(例如在等渗pH 7缓冲
盐水中)有足够强度以维持该嵌合多肽的主要部分的完整性的其他非共价相互作用来连
接。为了本文的目的,嵌合多肽包括含有连接至另一多肽(例如,多聚化结构域、异源免疫球蛋白恒定结构域或框架区、或者诊断性或治疗性多肽)的全部或部分抗RSV抗体的嵌合
多肽
载体长度互相靠近(例如相邻)的编码这两种多肽的两种核酸。通常,本文所提供的融合蛋
白指这样的多肽,其包含具有抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的多肽以及具有异源多
肽或肽(例如,诊断性或治疗性多肽)的氨基酸序列的多肽或肽。相应地,融合蛋白指包含
通过肽键直接或间接连接的来自两种或更多种蛋白或肽的两个或更多个部分的嵌合蛋白。
这两个分子可以在构建体中相邻或者通过接头或间隔多肽来分开。间隔区可以编码改变所
述多肽的特性(例如溶解性或胞内运输)的多肽。
接头的实例是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n氨基酸序列。其他
示例性接头如本文所述;任何这些和其他已知的接头可以用于所提供的组合物和方法。
抗体结合位点排列至与细胞表面上的表位或其他抗原相互作用。铰链区内的两个链间二硫
键稳定两条重链之间的相互作用。在本文所提供的一些实施方案中,合成产生的抗体片段
包含一个或多个铰链区,例如,以通过两条抗体链之间的相互作用提高稳定性。铰链区是二聚化结构域的实例。
例如,可以通过重组DNA技术改变编码单克隆抗体的DNA以编码其中非可变区的氨基酸组
成是基于人抗体的抗体。鉴定这类区域的方法是已知的,包括设计用于鉴别免疫球蛋白的
可变区和非可变区的计算机程序。
环连接的氨基酸的反向平行的β链。Ig折叠中的两个β折叠通过疏水相互作用和保守的
链内二硫键夹在一起。抗体链内的单个免疫球蛋白结构域可以基于功能来进一步区别。例
如,轻链包含一个可变区结构域(VL)和一个恒定区结构域(CL),而重链包含一个可变区结
构域(VH)以及3个或4个恒定区结构域(CH)。每个VL、CL、VH和CH结构域均为免疫球蛋白
结构域的实例。
VH。可变结构域提供抗原特异性,并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区
(FR),CDR是抗原结合位点结构域的部分。
抗原结合位点,每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接
可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。
每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称
为互补性决定区(CDR)。
是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所
述,本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如,Kabat,
E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J。Mol.Biol.196:901-917)。
CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2CH3和铰链区,而IgE和IgM包含
CH1、CH2CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂,因此有助于与抗原相互作用以
及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能,例如但不限于清除该抗体特异性结合
的抗原、病原体和毒素,例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合的VH结构域的功能区结合抗原。示例
性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗
原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
原或存在于病毒中。通常,免疫特异性地结合(或特异性结合)病毒抗原或病毒的抗体是
7 -1 8 -1 -7 -8
以约或1x10M 或1x10M 或更大的亲和常数Ka(或者1x10 M或1x10 M或更低的解离常
数(Kd))结合所述病毒抗原(或者至所述病毒中的抗原或者至所述病毒)。亲和常数可以
通过抗体反应的标准动力学方法来测定,例如,免疫测定、表面等离子共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54;Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见,例如,Paul,ed.,
Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages 332-336(1989);还参见描述用于计算抗RSV抗体的结合亲和性的示例性SPR和ITC方法的美国专利第7,229,619
号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的,并且可商购(参见,BiaCore
2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare Life Sciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。免疫特异性地结合病毒抗原(或病毒)的抗体可以相等或
较低的结合亲和性结合其他肽、多肽或蛋白或者病毒。通常,本文所提供的免疫特异性地结合RSV F蛋白(或RSV病毒)的抗体或其抗原结合片段不与其他抗原交叉反应,或者以对这
类抗原大幅(至少10-100倍)降低的亲和性交叉反应。例如,可以通过免疫测定(如放射
免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA))、表面等离子共振或本领域技术人员已知的
其他技术来鉴定免疫特异性地结合特定病毒抗原(例如RSV F蛋白)的抗体或抗原结合片
段。免疫特异性地结合RSV F蛋白上的表位的抗体或其抗原结合片段通常是如利用实验技
术(例如但不限于免疫测定、表面等离子共振或本领域技术人员已知的其他技术)所测定
的,以比结合任何交叉反应表位更高的结合亲和性结合所述表位(存在于所述蛋白或病毒
中)的抗体或其抗原结合片段。免疫特异性地结合分离的RSV蛋白(例如,重组产生的蛋
白),如RSV F蛋白,并不必须表示该抗体会表现出对该病毒相同的免疫特异性结合和/或
中和。这类测量和特性是不同的。可以测定抗体或抗原结合片段对病毒或存在于该病毒中
的抗原的亲和性。为了本文的目的,当描述亲和性或相关术语时,会鉴定靶,例如分离的蛋白或病毒。
作用的光学现象。
等。
域的两个抗原结合片段的任何聚合物。
成稳定的聚合物,所述互补多聚化结构域可以是相同或不同的多聚化结构域。通常,多肽直接或间接连接至多聚化结构域。示例性多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨
酸拉链、疏水区、亲水区以及相容的蛋白-蛋白相互作用结构域。例如,多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域,例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、
IgE、IgD和IgM以及它们的修饰形式的Fc结构域或其部分。
的二硫键的半胱氨酸残基的氨基酸序列,例如全部或部分全长抗体铰链区;或者一个或多
个二聚化序列,其为已知促进多肽之间相互作用的氨基酸序列(例如,亮氨酸拉链、GCN4拉链)。
以包括全部或部分的这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM,Fc可以包括J链。对
于IgG的示例性Fc结构域,Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3,以及任选存在的Cγ1
与Cγ2之间的铰链的全部或部分。Fc区的边界可以变化,但是通常包括至少部分铰链区。
此外,Fc还包括任何等位或物种变体或者任何变异或修饰形式,例如改变结合FcR或改变
Fc介导的效应子功能的任何变异或修饰形式。
或纯化,但是其足够短从而不干扰其连接的嵌合多肽的活性。标签多肽通常足够独特,因此特异性结合标签多肽的抗体基本上不与该标签多肽所连接的多肽中的表位交叉反应。合适
的标签多肽一般具有至少5或6个氨基酸残基,并且通常约8-50个氨基酸残基,典型9-30
个残基。标签可以连接至聚合物中的一个或多个嵌合多肽,并且允许检测该聚合物或者从
样品或混合物回收该聚合物。这类标签是公知的,并且可以很容易合成和设计。示例性标
签多肽包括用于亲和纯化的标签多肽,并且包括His标签、流感血凝素(HA)标签多肽及其
抗体12CA5(Field et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8:2159-2165);c-myc标签及其8F9、3C7、
6E10、G4、B7和9E10抗体(参见,例如,Evan et al.(1985)Molecular and Cellular Biology
5:3610-3616);以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.(1990)
Protein Engineering 3:547-553(1990)。用来检测表位标记抗体的抗体在本文中通常指二抗。
用,存在于本文出现的多肽的各种氨基酸序列中的氨基酸根据它们公知的3-字母或1-字
母缩写来显示(参见表1)。存在于各种核酸分子和片段中的核酸分子用本领域常规使用的
标准单字母命名来命名。
存在于多肽的羧基端的游离羧基。与J.Biol.Chem.,243:3557-59(1968)中所述的标准多
肽命名一致,并且采用37C.F.R.§§1.821-1.822,氨基酸残基的缩写如表1所示:
个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见,例如,Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
Ala(A) Gly;Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln;His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala;Pro
His(H) Asn;Gln
Ile(I) Leu;Val
Lys(K) Arg;Gln;Glu
Met(M) Leu;Tyr;Ile
Phe(F) Met;Leu;Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe
Val(V) Ile;Leu
的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸为本领域技术人员已知,并且包括但不限于2-氨
基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(Baad)、β-丙氨酸/β-氨基-丙酸(Bala)、2-氨基丁酸
(Abu)、4-氨基丁酸/piperidinic acid(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(Baib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2,4-二氨基丁酸(Dbu)、锁
链素(Des)、2,2′-二氨基庚二酸(Dpm)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟赖氨酸(Hyl)、别-羟赖氨酸(Ahyl)、3-羟脯氨酸(3Hyp)、4-羟脯氨酸(4Hyp)、异锁链素(Ide)、别-异亮氨酸(Aile)、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(MeGly)、
N-甲基异亮氨酸(MeIle)、6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、N-甲基缬氨酸(MeVal)、正缬氨酸
(Nva)、正亮氨酸(Nle)以及鸟氨酸(Orn)。
分子与天然多肽和核酸分子相比可以具有修饰。
其他修饰。术语野生型还包括具有种内和种间发生的等位变异的形式。如本文所用,多肽
或核酸分子的优势形式指该分子的形式,其为从基因产生的主要形式。“优势形式”随来源变化。例如,不同细胞或组织类型可以产生不同形式的多肽,例如通过可变剪接和/或通过可变蛋白加工。在各个细胞或组织类型中,不同多肽可以是“优势形式”。
序列的多肽。在本文中术语“等位变体”还用来表示基因的等位变体所编码的蛋白。通常基因的参考形式编码来自物种的群体或单个参照成员的多肽的野生型形式和/或优势形式。
通常,包括种间和种内变体的等位变体通常与来自相同物种的野生型和/或优势形式具有
至少或约80%、85%、90%、95%或更高的氨基酸相同性;相同程度取决于基因以及比较是种间或种内的。通常,种内等位变体与野生型和/或优势形式具有至少或约80%、85%、
90%或95%相同性或更高,包括与多肽的野生型和/或优势形式96%、97%、98%、99%或更高的相同性。在本文中关于等位变体一般指相同物种的成员之间的变异和蛋白。
同等位基因时,所述个体对于该基因是杂合的。特定基因的等位基因可以在单个核苷酸或
几个核苷酸互相不同,并且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因还可以是包含突变的基因形式。
的独立折叠结构的多肽的部分,和/或通过特定功能活性(例如酶促活性、二聚化或抗原结
合)识别的多肽的部分。多肽可以具有一个或多个不同结构域,通常超过一个。例如,所述多肽可以具有一个或多个结构结构域以及一个或多个功能结构域。单个多肽结构域可以基
于结构和功能来区分。结构域可以包含氨基酸的连续线性序列。或者,结构域可以包含多
个不连续的氨基酸部分,其沿着所述多肽的氨基酸的线性序列是不连续的。通常,多肽包含多个结构域。例如抗体分子的每条重链和每条轻链均包含多个免疫球蛋白(Ig)结构域,每
个免疫球蛋白(Ig)结构域长度为约110个氨基酸。
(例如VH、VL、CH、CL及其部分,如CDR,包括CDR1、CDR2和CDR3)或抗原结合部分(例如抗体结合位点)。
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个核苷酸,但是不必需组成该多核苷酸的所有核苷酸。
抗原结合的亲和性(例如高或低亲和性)、抗原结合的亲合力(例如高或低亲合力)、结合
速率、解离速率、效应子功能(例如促进抗原中和或清除的能力)、病毒中和以及体内活性
(例如预防病原体感染或侵染的能力、或者促进清除的能力、或者渗入体内的特定组织或流体或细胞的能力)。可以利用公认的测定在体外或体内评价活性,例如ELISA、流式细胞术、测量结合或解离速率的表面等离子共振或者等效测定、免疫组织化学以及免疫荧光组织学
和显微术、基于细胞的测定、流式细胞术以及结合测定(例如,淘选测定)。例如,对于抗体多肽,可以通过体外测量结合亲和性、亲合力和/或结合系数(例如,结合/解离速率)以
及其他活性,或者通过体内测量各种效应,例如免疫效应,如抗原清除,抗体对组织的渗入或定位,防护疾病(例如感染),血清或其他流体抗体滴定,或者本领域公知的其他测定来
评价活性。显示多肽表现出活性的这类测定的结果可以与体内多肽活性关联,其中体内活
性可以称为治疗活性或生物学活性。修饰的多肽的活性可以是未修饰的多肽的活性的任何
百分比水平,包括但不限于与未修饰的多肽相比1%的活性,2%、3%、4%、5%、10%、20%、
30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高的活性。确定修饰(例如变异)的抗体的功能性或活性的测定是本领域公知的。
30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高的治疗活性。
保留靶多肽的活性的修饰或变体多肽可以表现出提高的活性或者保持未修饰的多肽的活
性。在某些情况下,修饰或变体多肽可以保留与靶或未修饰的多肽相比提高的活性。在某
些情况下,修饰或变体多肽可以保留与未修饰的或靶多肽相比降低的活性。修饰或变体多
肽的活性可以是未修饰的或靶多肽的活性的任何百分比水平,包括但不限于与未修饰的或
靶多肽相比1%的活性,2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、
500%或更高活性。在其他实施方案中,活性变化为比未修饰的或靶多肽高至少约2倍、3
倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。
保留活性的测定取决于待保留的活性。这类测定可以在体外或体内进行。例如,利用本领
域已知以及下文实施例所述的活性的测定,例如但不限于ELISA和淘选测定,可以测量活
性。与未修饰的或靶多肽相比的修饰或变体多肽的活性还可以根据体内治疗活性或生物活
性或者施用该多肽之后的结果来评价。
的组合。核酸还包括DNA和RNA衍生物,其包含例如核苷酸类似物或除磷酸二酯键之外的
“骨架(backbone)”键,例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。该术语还包括由核苷酸类似物组成的RNA或DNA的等同物、衍生物、变体和类似物,单链(正义或反义)和双链核酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱
氧胸苷。对于RNA,尿嘧啶碱基为尿苷。
物。核酸还可以包含一个或多个可选择性切割的骨架键,例如,可化学、酶促或光解切割。
例如,核酸可以包括一个或多个脱氧核糖核苷酸,之后是一个或多个核糖核苷酸,其后可以是一个或多个脱氧核糖核苷酸,这样的序列可以通过碱水解在核糖核苷酸序列处切割。核
酸还可以包含一个或多个对切割相对耐受的键,例如嵌合寡核苷酸引物,其可以包括通过
肽核酸键连接的核苷酸以及在3′端通过磷酸二酯键或其他合适的键连接的至少一个核苷
酸,并且能够通过聚合酶延伸。肽核酸序列可以利用公知的方法来制备(参见,例如,Weiler et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:2792-2799)。
酸二酯键之外的“骨架”键,例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。多核苷酸(核酸分子)包括单链和/或双链多核苷酸,例如脱氧核糖核酸(DNA)
和核糖核酸(RNA)以及RNA或DNA的类似物或衍生物。该术语还包括由核苷酸类似物组成
的RNA或DNA的等同物、衍生物、变体和类似物,单链(正义或反义)和双链多核苷酸。脱氧
核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA,尿嘧啶碱基为尿苷。
多核苷酸可以包含核苷酸类似物,包括例如质量修饰核苷酸,其允许质量区分多核苷酸;包含可检测标记的核苷酸,例如荧光、放射性、发光或化学发光标记,其允许检测多核苷酸;或者包含反应基团的核苷酸,例如生物素或硫醇基,其促进多核苷酸固定至固体支持物。多核苷酸还可以包含一个或多个可选择性切割的骨架键,例如,可化学、酶促或光解切割。例如,多核苷酸可以包括一个或多个脱氧核糖核苷酸,之后是一个或多个核糖核苷酸,其后可以
是一个或多个脱氧核糖核苷酸,这样的序列可以通过碱水解在核糖核苷酸序列处切割。多
核苷酸还可以包含一个或多个对切割相对耐受的键,例如嵌合寡核苷酸引物,其可以包括
通过肽核酸键连接的核苷酸以及在3′端通过磷酸二酯键或其他合适的键连接的至少一个
核苷酸,并且能够通过聚合酶延伸。肽核酸序列可以利用公知的方法来制备(参见,例如,Weiler et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:2792-2799)。本文所提供的核酸分子(多核苷酸)的实例为寡核苷酸,包括合成寡核苷酸、寡核苷酸双链体、引物(包括补平引物)以及
寡核苷酸双链体盒。
达的核苷酸序列。当诱导物存在或浓度增加时,可以增加基因表达。调控区还包括赋予基
因表达的抑制(即,物质或刺激减少转录)的序列。当阻遏物存在或浓度增加时,可以减少
基因表达。已知调控区影响、调节或控制许多体内生物活性,包括细胞增殖、细胞生长和死亡、细胞分化以及免疫调谐。调控区通常结合一个或多个反式作用蛋白,这导致增加或减少的基因转录。
达。增强子还可以在距离基因显著的距离发挥功能,例如,在约3Kb、5Kb、7Kb、10Kb、15Kb或更远的距离。
基因的转录物的适当多腺苷酸化的多腺苷酸化信号,以及终止密码子;并且可以任选地包
括在表达载体中。
况下,编码第一多肽(例如,前导肽)的核酸可操作地连接至编码第二多肽的核酸,并且这
些核酸作为单一mRNA转录物转录,但是所述mRNA转录物的翻译可以导致表达一种或两种
多肽。例如,琥珀终止密码子可以位于编码第一多肽的核酸与编码第二多肽的核酸之间,从而,当引入部分琥珀抑制细胞时,所得的单一mRNA转录物可以翻译以产生包含第一和第二
多肽的融合蛋白,或者可以翻译以仅产生第一多肽。在另一实例中,启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸,从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
马斯蓝染色,Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞,用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所
编码的多肽。载体通常保持游离,但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。
还考虑人工染色体的载体,例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择
和用途是本领域技术人员公知的。
细胞基因组的表达载体。
核苷酸为合成寡核苷酸。合成寡核苷酸在长度上包含少于或约250或200个核苷酸,例如,
在长度上少于约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个核苷酸。通常,寡核苷酸为单链寡核苷酸。结尾“聚体(mer)”可以用来表示寡核
苷酸的长度。例如,“100-聚体”可以用来指在长度上包含100个核苷酸的寡核苷酸。本文所提供的合成寡核苷酸的实例为正链和负链寡核苷酸、随机化寡核苷酸、参考序列寡核苷
酸、模板寡核苷酸以及补平引物。
酸。例如,合成寡核苷酸通常通过化学连接包含保护基团的单核苷酸单体或核苷酸三聚体
来制备。通常,包含保护基团的亚磷酰胺、单核苷酸一次添加一个。合成通常由寡核苷酸
的3’端开始。将最3’的亚磷酰胺附着于固体支持物,并且通过将每个亚磷酰胺添加至最
后的5’端来进行合成。每次添加之后,从最近添加的碱基上的5’磷酸酯基团去除保护基
团,允许添加另一亚磷酰胺。自动合成仪一般可以合成长度多达约150-约200个核苷酸
的合成寡核苷酸。通常,所提供的方法中设计和使用的寡核苷酸是利用标准氰乙基化学从
亚磷酰胺单体合成的。通过这种标准方法制备的合成寡核苷酸可以购自Integrated DNA
Technologies(IDT)(Coralville,IA)或TriLink Biotechnologies(San Diego,CA)。
的这类分子的池)。应当理解某些核酸分子可以作为“探针”和“引物”。然而,引物具有用于延伸的3’羟基。引物可以用于多种方法,包括例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶
(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄PCR、捕获PCR、表达PCR、3′和5′RACE、原位PCR、连接介导的PCR以及其他扩增方案。
引物对通常是一对两个引物池。
作为3′(下游)引物(与待扩增的序列的3′端互补物特异性杂交)。因此,在没有其他
引物的情况下,单引物可以用来在聚合酶扩增反应中引发互补链的合成并扩增核酸。
例为多核苷酸双链体中的正链和负链。如本文所用,当核酸分子或其区域与另一核酸分子
或其区域互补时,这两个分子或区域互相特异性杂交。两个互补的核酸分子可以用互补性
百分比来描述。例如,每个长度为100个核苷酸,互相特异性杂交但是彼此包含5个错配
的两个核酸分子称为95%互补。对于以100%互补性杂交的两个核酸分子,互补性不必存
在于这两个分子的整个长度。例如,在长度上包含20个连续核苷酸的核酸分子可以特异
性杂交至在长度上包含500个连续核苷酸的核酸分子的连续20个核苷酸部分。如果沿这
20个核苷酸部分不存在错配,那么该20个核苷酸的分子以100%互补性杂交。通常,互补
核酸分子以互补核苷酸之间少于25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%错配比对(换句话说,至少或约75%、80%、85%、90%、95、96%、97%、98%或99%互补性)。在另一实例中,互补核酸分子包含或约或至少或约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、
90%、95、96%、97%、98%或99%互补性。在一实例中,互补核酸分子包含少于5、4、3、2或
1个错配核苷酸。在一实例中,互补核苷酸是100%互补的。如果需要,会说明互补性的百
分比。通常选择两个分子,使得它们在高严格性条件下会特异性杂交。
方法的一实例中,聚合酶反应用来合成多核苷酸的互补链以形成双链体,通常通过将寡核
苷酸引物杂交至多核苷酸来起始。
如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别有关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲
液组成以及盐浓度。两个核酸分子不必表现出100%互补性以便互相特异性杂交。例如,享有序列互补性,例如或约或至少或约99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、
70%、65%、60%、55%或50%互补性的两个互补核酸分子可以互相特异性杂交。用于本文所提供的体外杂交方法的参数(例如,缓冲液组分、时间和温度)可以调整严格性以改变两
个核酸分子特异性杂交所需的互补性百分比。技术人员可以很容易调整这些参数以实现适
合特定应用的核酸分子与靶核酸分子特异性杂交。
价序列相似性的一种方法中,以获得序列之间相同性的最大水平的方式比对两个氨基酸或
核苷酸序列。“相同性”指氨基酸或核苷酸序列不变的程度。氨基酸序列以及某种程度上核苷酸序列的比对还可以考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守性差异和/或常见取代。保守性
差异是保留所涉及的残基的理化特性的差异。比对可以是整体的(在序列的整个长度并包
括所有残基的所比较序列的比对)或局部的(仅包括最相似区域或多个区域的部分序列的
比对)。
85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相同性;如果需要,可以说明相同性的精确百分比。与第二核酸分子或区域相同或同源的核酸分子或其区域可以特异性杂交至
与所述第二核酸分子或区域100%互补的核酸分子或区域。或者,可以在两个理论核苷酸或氨基酸序列之间或者在核酸或多肽分子与理论序列之间比较相同性。
1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法,但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.& Lipman,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
基酸,其与多肽A的氨基酸1-95相同,然后当沿着多肽A的全长与多肽B的全长比较序列
相同性时,多肽B具有95%相同性。或者,可以沿着每个多肽的区域(例如20个氨基酸的
类似区域)比较多肽A与多肽B之间的序列相同性。在这种情况下,如果多肽A和B沿着
该区域具有20个相同氨基酸,那么该区域的序列相同性为100%。或者,可以沿着分子的长度与另一分子的区域比较序列相同性。或者,可以沿着相同长度但是具有氨基酸置换(保
守氨基酸置换或非氨基酸置换)的多肽比较多肽A与多肽B之间的序列相同性。如下文所
讨论以及本领域技术人员已知,用于评价相同性的各种程序和方法是本领域技术人员已知
的。高水平的相同性,例如90%或95%相同性,可以不用软件很容易确定。
387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul,S.F.et al.(1990)J.Molec.Biol.215:403;Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,和Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如,国家生物技术信息中心数据库的BLAST功能可以用来确定相同性。其他可商购或公开的程序包括DNAStar″MegAlign″程序
(Madison,WI)和威斯康辛大学遗传学计算机集团(UWG)“Gap”程序(Madison WI))。例如,蛋白和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以通过利用GAP计算机程序比较序列信息来
确定(例如,Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443,由Smith and Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482修订)。简单地说,GAP程序将相似性定义为用比对的相似的符号
(即,核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列的总符号数目。GAP程序的默认参
数可以包括:(1)一元比较矩阵(1表示相同,0表示不同)和Gribskov et al.(1986)Nucl.
Acids Res.14:6745的加权比较矩阵,如Schwartz and Dayhoff,eds.,ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述;(2)每个空位罚分3.0并且每个空位中的每个符号另外罚分0.1;以及(3)末端空位
不罚分。
本上同源的核酸分子通常在中等严格性或高度严格性下与所关注的核酸在整个长度上杂
交。还考虑包含代替杂交核酸分子中的密码子的简并密码子的核酸分子。
和第二多核苷酸之间进行。第一和第二序列之间的这类差异可以表示为随机分布在多肽的
整个长度的点突变,或者它们可以集中在一个或多个位置,其具有不同长度至高达最大允
许例如10/100氨基酸差异(约90%相同性)。差异定义为核酸或氨基酸残基取代、插入、
添加或缺失。在约85-90%以上的同源性或相同性水平,结果独立于程序和空位参数设置;
从而高水平的相同性经常可以很容易地通过手动比对而不依赖于软件来评价。
对的2个或更多个序列,并且可以包括比对与基因组DNA序列比对的来源于诸如EST和其
他cDNA的RNA的序列。
如,BLASTP)的方法以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽或核酸的序列,本领域技术人员可以利用保守和相同的氨基酸残基作为指导鉴定类似的部分或位置。而且,
本领域技术人员还可以采用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导以找到人和非人序列之间
和人和非人序列中的对应的氨基酸或核苷酸残基。相应位置还可以基于结构比对,例如通
过利用计算机模拟的蛋白结构比对。在其他情况下,可以鉴定相应区域。本领域技术人员
还可以采用保守氨基酸残基作为指导以找到人和非人序列之间和人和非人序列中的对应
的氨基酸残基。
说,在两个或更多个多肽或核酸序列最适比对时,两个类似位置(或部分或区域)对齐。当
比对两个或更多个序列时,基于沿线性核酸或氨基酸序列的位置鉴定类似部分/位置/区
域。类似部分不必互相享有任何序列相似性。例如,每个长度为100个核苷酸的两个同源核酸分子序列的比对(从而最大化匹配)可以显示100个核苷酸中的70个相同。包含其他
不同的30个氨基酸中的一些或全部的这些核酸分子的部分是不享有序列相同性的类似部
分。或者,类似部分可以互相包含一些序列相同性百分比,例如或约50%、55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%,或者其分数。在一实例中,相似部分是100%相同的。
酸和氨基酸序列的“添加”描述与另一序列相比,添加核苷酸或氨基酸至任一末端。
的取代突变可以用沿所述多肽序列长度的氨基酸残基的编号来表示。例如,在氨基酸序列
的第19位处具有半胱氨酸(Cys;C)取代异亮氨酸(Ile;I)的修饰的修饰多肽可以表示为
I19C、Ile19C,或者简写C19以显示在修饰的第19位处的氨基酸为半胱氨酸。在这个实例
中,具有取代的分子在未修饰的多肽的Ile 19处具有修饰。
(例如高亲和性),其结合结合配对物的亲合力,与结合配对物的键的强度以及与结合配对
物结合的特异性。
位的亲和性是单个抗体结合位点与所述表位之间全部非共价相互作用的强度的度量。低亲
和性抗体-抗原相互作用很弱,并且分子趋于快速解离,而高亲和性抗体-抗原结合很强,
并且分子保持结合较长时间。计算亲和性的方法是公知的,例如测定结合/解离常数的方
法。可以凭经验估计亲和性,或者可以比较测定亲和性,例如通过比较一个抗体和另一抗体对特定抗原的亲和性。
抗体相比,高亲合力抗体具有较高强度的这类相互作用。
用。当抗体“结合”特定抗原时,结合指抗体通过在抗体结合位点的同源抗体-抗原相互作用特异性识别抗原。结合还可以包括多肽的多条链的关联,例如通过二硫键相互作用的抗
体链。
可以如通过抗体反应的标准动力学方法(例如,免疫测定、表面等离子共振或本领域已知
的其他动力学相互作用测定)所测量的从结合-解离反应的速率常数计算。
位的全部或部分。因此,具有与名为58c5的抗体相同的结合特异性的抗RSV抗体或其抗原
结合片段与名为58c5的抗RSV抗体或其抗原结合片段特异性结合相同的表位的全部或部
分。所述表位可以在分离的蛋白中,或者在病毒中的蛋白中。两个抗体结合相同表位的能
力可以通过本领域已知的测定来确定,例如,表面等离子共振测定和抗体竞争测定。通常,免疫特异性地结合相同表位的抗体可以竞争结合所述表位,这可以利用本领域已知的技术
例如通过体外结合竞争测定(例如竞争ELISA)来测量。通常,免疫特异性地与第二抗体
结合相同的表位的第一抗体可以约或30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、
75%、80%、85%、90%、95%、100%竞争结合所述表位,其中竞争百分比是测量的第二抗体代替第一抗体结合所述表位的能力。在示例性竞争测定中,将抗原在预定的限制稀释的标
记抗体(例如,50-70%饱和浓度)以及连续稀释的未标记的竞争抗体存在的情况下温育。
通过测量在竞争抗体存在的情况下标记抗体结合抗原的结合的任何减少来测定竞争。这类
测定的变化是本领域已知的,包括各种标记技术和检测方法,包括例如辐射、荧光、酶促和比色检测。第一抗体与第二抗体结合相同的表位的能力还可以例如利用抗单克隆抗体突变
体(MARM)通过病毒中和测定来确定。例如,当第一抗RSV抗体中和野生型RSV但不中和特
定突变RSV时,中和所述野生型RSV但不中和所述特定突变RSV的第二抗体一般与所述第
一抗体结合相同的RSV上的表位。当第一抗RSV抗体中和野生型RSV但不中和特定突变
RSV时,中和所述野生型RSV和所述特定突变RSV的第二抗体一般不与所述第一抗体结合相
同的RSV上的表位。
的情况下经过连续数轮的病毒复制,从而在连续的每轮病毒复制之后,需要增加抗体浓度
以产生病毒中和效应。在增加浓度的抗体存在的情况下直至突变病毒不再被所述抗体有效
中和,这才观察到致细胞病变效应(CPE)。如果与第二抗体相比,在第一抗体存在的情况下MARM的出现需要更多轮的复制,可以得出结论所述第一抗体结合与所述第二抗体结合的表
位不同的表位。如果第一抗体可以中和针对第二抗体产生的MARM,可以得出结论所述抗体
特异性结合不同表位或与不同表位相互作用。与竞争结合测定相比,MARM可以更精细作图
抗体的抗原结合表位,从而一个抗体可以对另一抗体竞争结合抗原,但是仍然可以中和其
竞争者的MARM。
细胞用于感染的空斑减少测定)或本领域已知的其他病毒中和测定。通常,中和病毒是在
诸如病毒空斑减少测定的体外中和测定中的病毒抑制具有2nM或更少的EC50的病毒。
分子偶联至固体支持物来选择。通常,体外方法包括洗涤步骤以去除未结合的多肽,然后洗脱所选的变体多肽。所述过程可以在迭代过程中重复一次或多次以从所选的多肽中选择变
体多肽。
之间的相互作用。
翻译后产生融合蛋白。缀合可以采用各种连接剂中的任一种以实现缀合,包括但不限于肽
或化合物接头或者化学交联剂。
包括但不限于XL1-blue细胞。
于遗传包装的外表面或外室(例如,膜、细胞壁、外壳或其他外表面或室)之上或之内,遗传包装例如病毒遗传包装,如噬菌体,从而当融合至所关注的多肽时,该多肽展示于遗传包装上。
壳蛋白的任何部分。
更多,例如数十、数百或数千个拷贝存在于病毒外壳中),如基因VIII蛋白(gVIIIp,cp8);
与其他噬菌体外壳蛋白(如基因VI蛋白、基因VII蛋白或基因IX蛋白(参见,例如,WO
00/71694))的融合物;以及这些蛋白的部分(例如,结构域或片段),例如但不限于稳定并
入噬菌体颗粒的结构域,例如gIIIp或gVIIIp的锚结构域。此外,可以使用为表达较大肽
而优化的gVIIIp突变体,例如具有改进的表面展示特性的突变体,如突变gVIIp(参见,例
如,Sidhu et al.(2000)J.Mol.Biol.296:487-495)。
上呼吸道RSV感染(URI)、下呼吸道RSV感染(LRI)或它们的组合。在一些实例中,RSV的
侵染和复制所导致的病理状态为急性RSV疾病。
如RSV感染)的对象。
的,持续或短暂的。
其足以使得能够检测具有所述抗体或其抗原结合片段特异性的RSV抗原的位点。在本文所
提供的抗体用于抗原的体内检测中,以诊断有效的剂量给予可检测标记的抗体或其抗原结
合片段。
外检测的可检测的标记物(marker)(例如,荧光分子、化学发光分子、生物发光分子、造影剂(例如,金属)、放射性核素、发色团、可检测的肽、或者催化可检测的产物的形成的酶)。
检测方法可以是本领域已知的任何方法,包括已知的体内和/或体外检测方法(例如,通过
目视检查成像、磁共振(MR)波谱学、超声信号、X-射线、γ射线光谱学(例如,正电子成像术(PET)扫描、单光子发射计算机断层显像(SPECT))、荧光光谱学或吸收)。间接检测指测
量直接或间接结合所述可检测部分的原子、分子或组合物的物理现象,例如能量或粒子发
射或吸收(例如,检测结合第一抗体(例如,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段)
的标记的第二抗体或其抗原结合片段)。
胞或组织的其他污染蛋白,或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。如果
通过标准分析方法测定制品看起来不含容易检出的杂质,则可以确定其基本上不含杂质,
所述分析方法例如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC),本领域技术人员将
这些方法用于评价这样的纯度或者足够纯从而进一步纯化不会可检测地改变物质的物理
和化学性质,如酶促和生物活性。纯化化合物以制备基本上化学纯的化合物的方法是本领
域技术人员已知的。然而,基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这样的
情况下,进一步纯化可以增加化合物的特定活性。如本文所用,“细胞提取物”或“裂解物”指从裂解或破裂的细胞制备的制品或级分。
不含其他细胞物质或培养基,或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本
文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸
分子。
施用,或者可以以单一组合物提供。
1726-1732)一致。
结合RSV融合(F)蛋白。本文所提供的抗体可以用于预防疗法。本文所提供的抗体还可以
用作治疗剂。
可以用于预防、治疗和/或缓解RSV感染的一种或多种症状,或者用于减少RSV感染的持续
时间。相应地,用本文所提供的抗体治疗患者可以降低与RSV感染相关的死亡率和/或发
病率。
组和病毒株。本文所提供的抗体还表现出与现有技术中存在的抗体相比提高的病毒中和活
性。所提供的抗体在连续数轮复制中有效中和病毒,其中RSV通常会产生逃逸突变体以抗
中和。限制MARM的产生的能力表示本文所提供的抗体结合对所产生的逃逸突变体形式中
的变化较不敏感的表位。因此,这种表位不同于其他已知的抗RSV抗体的表位。因此,除了预防疗法,所提供的抗RSV抗体还用于治疗RSV感染。目前,没有已知并批准的针对RSV感
染的抗体治疗剂。因此,本文所提供的抗体对于治疗老年患者中的RSV感染特别重要,例如团体或养老院中的老年患者,其接近性增加病毒在患者中传播的风险。用本文所提供的抗
体治疗在剂量方案的不依从性增加病毒逃逸的风险的情况下也很重要,如用帕利珠单抗预
防治疗RSV中的不依从性日益导致病毒抗性(参见,例如,Adams et al.,(2010)Clin Infect Dis.51(2):185-188)。
施用,用于预防和/或治疗RSV感染,用于预防、治疗和/或缓解RSV感染的一种或多种症
状,或者用于减少RSV感染的持续时间。因此,本文所提供的抗RSV抗体用作治疗性抗体,
即,用于治疗RSV感染。较低频率的施用允许施用方案的较容易的依从性,并且因此减少漏服的可能性,漏服导致增加的对抗RSV抗体的病毒抗性。较低剂量的免疫特异性地结合RSV
的抗体还可以减少免疫球蛋白疗法的副作用的可能性。
力,包括抑制病毒复制或者感染的细胞与另一细胞的细胞至细胞融合(即合胞体形成)。所
提供的抗RSV抗体还可以用来增加针对RSV感染的免疫应答。
膜的非分段的负义RNA病毒,具有由编码11种病毒蛋白的约15,000个核苷酸组成的基因
组。
白侵入细胞质(Lopez et al.(1998)J.Virology72:6922-6928)。糖蛋白F还促进所感染的
细胞的膜与相邻细胞的膜融合,导致合胞体的形成。F蛋白包含两个二硫键连接的亚基F1
和F2,这是通过无活性的N-糖基化前体的蛋白酶切割产生的。G蛋白是80-90kDa的II型
跨膜糖蛋白,包含连接至32kDa前体蛋白的N-联和O-联寡糖。
对RSV F蛋白的抗体还有效抑制RSV感染的细胞与邻近未感染的细胞融合。
每个抗原位点包含不同表位。在一组18种单克隆抗体的一个研究中,基于单克隆抗体逃
逸突变体(MARM)鉴定了抗原位点A的5个表位、抗原位点B的4个表位以及抗原位点C
的4个表位(参见,例如,Beeler et al.(1989)J.Virol.63:2941-2950)。影响这些抗RSV
抗体的逃逸的RSVA2病毒株F蛋白突变包括氨基酸残基N262、K272、S275、N276、P389或
R429处的单氨基酸突变,或者F32和K272或A241和K421处的双氨基酸突变(参见,例
如,Crowe et al.(1998)Virology 252:373-375;Zhao et al.,(2004)J.Infectious Disease
190:1941-1946和Liu et al.,(2007)Virology Journal 4:71)。结合抗原位点A表位4的单克隆抗体1129(Beeler et al.(1989)J.Virology 63(7):2841-2950)是产生人源化帕利
珠单抗 的亲本抗体(参见Johnson et al.(1997)J.Infect.Diseases 176:
1215-1224和美国专利第5,824,307号)。先前已证实RSV F蛋白的残基N262、N268或
K272处的单氨基酸突变影响从帕利珠单抗 逃逸(参见,Zhao et al.,(2004)
J.Infectious Disease 190:1941-1946)。还已鉴定额外的RSV F蛋白表位。例如,人抗RSV Fab片段Fab 19(参见Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10164-10168和
Crowe et al.,(1994)Proc.Natl.Acad Sci USA91:1386-1390)结合与Beeler等人所鉴定
的表位不同的抗原位点A中的表位(参见Crowe et al.(1998)Virology 252:373-375)和
Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10164-10168)。
1-15)。因为A和B病毒亚型在大多数RSV流行中共传播,所以期望中和RSV的A和B亚型
的抗体,例如本文所提供的抗RSV抗体或抗原结合片段。
包括例如哮喘、喘息、反应性气道疾病(RAD)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。相应地,如本文所述,本文所提供的抗RSV抗体可以用于预防RSV,用于治疗RSV感染和/或用于缓解这类
RSV介导的疾病的一种或多种症状。
于治疗患有病毒感染的对象。在一实例中,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用
于预防,即防止RSV感染。在另一实例中,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段用作
治疗性抗体,即用于治疗RSV病毒感染。在另一实例中,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原
结合片段用于对象针对RSV的被动免疫。所提供的抗-RSV抗体或其抗原结合片段还可以
在体外和体内用于检测RSV感染或用于监测RSV感染。
10
产生具有大量不同抗体的天然抗体谱。人抗体谱包含超过10 种不同抗原特异性,并且因
此理论上可以特异性识别任何外源抗原。抗体包括这样自然产生的抗体,以及合成,即重组产生的抗体,例如抗体片段,包括本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
胞、多肽和生物分子相互作用的事件来服务于效应子功能。这些效应子功能引起抗体识别
的感染物质的中和和/或清除。抗体多肽的结构域可以根据本文的方法变化以改变特定特
性。
互作用和保守的链内二硫键夹在一起。抗体链中的Ig结构域为可变(V)和恒定(C)区结
构域。每条重链通过二硫键连接至轻链,并且两条重链通过二硫键互相连接。重链的连接
是通过称为铰链区的重链的柔性区介导的。
些情况下铰链区。由于上文所讨论的重组事件,编码可变区结构域的核酸序列在抗体之间
不同,并且赋予特定抗体抗原特异性。另一方面,恒定区由在抗体之间更保守的序列编码。
这些结构域赋予抗体功能特性,例如,与免疫系统的细胞和血清蛋白相互作用以便引起传
染性物质的清除的能力。不同类别的抗体(例如IgM、IgD、IgG、IgE和IgA)具有不同的恒
定区,允许它们服务于不同的效应子功能。
CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和三个轻链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)一起组成抗体的常规抗原结
合位点(antigen-binding site)(抗体结合位点(antibody combining site)),其与同种抗原物理相互作用并提供抗体的特异性。全抗体包含两个相同的抗体结合位点,每个由来自
一条重链和一条轻链的CDR组成。因为它们包含在连接β链的环内,三个CDR沿可变区的
线性氨基酸序列是不连续的。当抗体多肽折叠时,CDR环非常接近,组成抗原结合位点。可变区结构域的β折叠形成框架区(FR),其包含对于抗体的其他特性(例如,稳定性)很重
要的更保守的序列。
部分,其可以插入抗体框架(例如,嵌合抗体)以保留亲本抗体的结合亲和性。抗体片段
的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段,包括修饰的片段(参见,例如,Methods in Molecular Biology,Vol 207:
Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols(2003);Chapter 1;p
3-25,Kipriyanov)。抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链,并且可以重组产生。抗体片段还可以包含合成的接头(例如肽接头)以连接两个或更多个结构域。用
于产生抗原结合片段的方法是本领域公知的,并且可以用来修饰本文所提供的任何抗体。
抗体分子的片段可以例如通过酶促切割产生。例如,当通过木瓜蛋白酶来蛋白酶切割时,重链恒定区的二聚体Fc结构域从两个Fab区(即包含可变区的部分)切下。
反应(PCR)和其他重组核酸技术。例如,制备sFv的方法如Whitlow and Filpula(1991)
Methods,2:97-105;Bird et a1.(1988)Science 242:423-426;Pack et a1.(1993)Bio/Technology 11:1271-77;以及美国专利号4,946,778、5,840,300、5,667,988、5,658,727、
5,258,498)所述。单链抗体还可以通过筛选单链抗体文库中结合靶抗原的单链抗体来鉴
定。构建和筛选这类文库的方法是本领域公知的。
抗体、或者上述任一种的抗原结合片段。特别地,抗体包括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性片段,即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例
如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体、或者上述任一种的抗原结合片段。特别地,所述抗体包
括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性片段,即包含抗原结合位点的分子。免
疫球蛋白分子可以是任何类型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
或其抗原结合片段还包括含有重链和/或轻链的抗RSV抗体或其抗原结合片段,所述重链
包含58c5或sc5的可变重(VH)结构域和恒定重结构域1(CH1),所述轻链包含58c5或sc5
的可变轻(VL)结构域和恒定轻结构域(CL)。例如,本文所提供的示例性抗RSV抗体或其抗
原结合片段包括含有重链和/或轻链的抗RSV抗体或其抗原结合片段,所述重链具有SEQ
ID NO:1或9所示的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:5或13所示的氨基酸序列。在
一特定实例中,所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段,所述重链具有SEQ ID NO:1
所示的氨基酸序列,所述轻链具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在一特定实例中,所述抗RSV抗体是包含重链和轻链的Fab片段,所述重链具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,
所述轻链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
或其抗原结合片段可以包含本领域已知的任何恒定区,例如本领域已知的任何人恒定区,
包括但不限于人轻链κ、人轻链λ、IgG1的恒定区、IgG2的恒定区、IgG3的恒定区或IgG4
的恒定区。本文所提供的抗体或抗原结合片段可以包含本领域已知的任何恒定区。在一些
实例中,所述抗体的一个或多个恒定区是人的恒定区。
或sc5的抗原结合片段的工程化抗体。这类抗体包括例如嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体、或者上述任一种的抗原结合片段。在特定实例中,所述抗体为Fab片段58c5或sc5
别具有58c5或sc5的VH结构域和/或VL结构域的氨基酸序列。例如,抗体或其抗原结合
片段可以包含VH结构域和/或VL结构域,所述VH结构域具有SEQ ID NO:1或9的氨基酸
1-125所示的氨基酸序列,所述VL结构域具有SEQ ID NO:5或13的氨基酸1-107所示的氨
基酸序列。在一实例中,抗体或其抗原结合片段包含VH结构域和VL结构域,所述VH结构域
具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-125所示的氨基酸序列,所述VL结构域具有SEQ ID NO:5的氨基酸1-107所示的氨基酸序列。在另一实例中,抗体或其抗原结合片段包含VH结构域和VL
结构域,所述VH结构域具有SEQ ID NO:9的氨基酸1-125所示的氨基酸序列,所述VL结构域具有SEQ ID NO:13的氨基酸1-107所示的氨基酸序列。
或sc5的VH结构域和/或VL结构域至少或约80%相同性的氨基酸序列。例如,本文所提
供的抗体或其抗原结合片段可以包含VH结构域和/或VL结构域,所述VH结构域具有与SEQ
ID NO:1或9的氨基酸1-125所示的氨基酸序列80%相同性的氨基酸序列,所述VL结构域
具有与SEQ ID NO:5或13的氨基酸1-107所示的氨基酸序列80%相同性的氨基酸序列。
列至少或约81%、至少或约82%、至少或约83%、至少或约84%、至少或约85%、至少或约
86%、至少或约87%、至少或约88%、至少或约89%、至少或约90%、至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%或者至少或约99%相同性的氨基酸序列,所述VL结构域具有与SEQ ID NO:5或
13的氨基酸1-107所示的氨基酸序列至少或约81%、至少或约82%、至少或约83%、至少
或约84%、至少或约85%、至少或约86%、至少或约87%、至少或约88%、至少或约89%、至少或约90%、至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约
95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%或者至少或约99%相同性的氨基酸序
列。
性,如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域,并且其包含具有与SEQ ID NO:5的氨基酸1-107所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性,例如90%-99%或至
少95%相同性,如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VH结构域,并且其包含具有与SEQ ID NO:13的氨基酸1-107所示的氨基酸序列至少或约80%-99%相同性,例如90%-99%或至
少95%相同性,如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列的VL结构域。
ID NO:2、1627、10或1628所示的氨基酸序列的VH CDR1。例如,所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列GASINSDNYYWT(SEQ ID NO:2)、SDNYYWT(SEQ ID NO:1627)、GDSISGSNWWN(SEQ ID NO:10)或GSNWWN(SEQ ID NO:1628)的VHCDR1。
酸序列HISYTGNTYYTPSLKS(SEQ IDNO:3)或EIYYRGTTNYKSSLKG(SEQ ID NO:11)的VH CDR2。
酸序列CGAYVLISNCGWFDS(SEQ IDNO:4)或GGRSTFGPDYYYYMDV(SEQ ID NO:12)的VH CDR3。
4所示的氨基酸序列的VH CDR3。
NO:6或14所示的氨基酸序列的VLCDR1。例如,所述抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包
含具有氨基酸序列QASQDISTYLN(SEQ ID NO:6)或RASQNIKNYLN(SEQ ID NO:14)的VLCDR1。
酸序列GASNLET(SEQ ID NO:7)或AASTLQS(SEQ ID NO:15)的VL CDR2。
酸序列QQYQYLPYT(SEQ ID NO:8)或QQSYNNQLT(SEQ ID NO:16)的VL CDR3。
8所示的氨基酸序列的VL CDR3。
结合片段可以包含本领域已知的抗体框架区。示例性框架区包括分离的天然存在的或共有
的框架区,包括人框架区(参见,例如,Chothia et al.(1998)J.Mol.Biol.278:457-479)。
在一些实例中,所述抗体框架区为人抗体框架区。在一些实例中,所述抗原结合片段包含
58c5或sc5的框架区。
RSV抗体或其抗原结合片段。在一实例中,本文提供和58c5结合相同表位的抗体,58c5是
包含SEQ ID NO:1所示的重链和SEQID NO:5所示的轻链的抗体。在另一实例中,本文提供和sc5结合相同表位的抗体,sc5是包含SEQ ID NO:9所示的重链和SEQ ID NO:13所示的轻链的抗体。通常,这类抗体包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链或其抗原结合片段。
约2.5×10M 、至少或约5×10M 、至少或约1×10M、至少或约5×10M 、至少或
10 -1 10 -1 11 -1 11 -1
约1×10 M 、至少或约5×10 M 、至少或约1×10 M 、至少或约5×10 M 、至少或
12 -1 12 -1 13 -1 13 -1
约1×10 M 、至少或约5×10 M 、至少或约1×10 M 、至少或约5×10 M 、至少或约
14 -1 14 -1 15 -1 15 -1
1×10 M 、至少或约5×10 M 、至少或约1×10 M 或者至少或约5×10 M 的对RSV F蛋
白表位的结合亲和常数(Ka)。本文所提供的抗体可以表现出对重组纯化的F蛋白的结合亲
和性,例如SEQ ID NO:25所示的RSV A2病毒株F蛋白的细胞外结构域。本文所提供的抗体
还可以表现出对天然RSV F蛋白的结合亲和性,例如通过细胞中RSV的感染和表达所产生的
RSV F蛋白。本文所提供的抗体可以具有相同或不同的对重组纯化的F蛋白对天然RSV F蛋
白的结合亲和性。例如,实施例4显示58c5对天然RSV F蛋白具有比对重组纯化的F蛋白
更高的结合亲和性。相比之下,无论RSV F蛋白是天然或重组表达的,sc5表现出相似的结
合亲和性。
-11 -11 -12 -12
少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约
-13 -13 -14 -14 -15
2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约2×10 M、
-15 -16
少于或约1×10 M或者少于或约2×10 M的对RSV F蛋白表位的解离常数(Kd)。
或约0.075nM、少于或约0.1nM、少于或约0.5nM、少于或约0.75nM、少于或约1nM、少于或
约少于或约1.25nM、少于或约1.5nM、少于或约1.75nM、少于或约2nM的EC50。在特定实例
中,本文所提供的分离的抗RSV抗体或抗原结合片段在体外空斑减少测定中具有少于或约
0.005nM至少于或约2nM;少于或约0.005nM至少于或1nM;少于或约0.005nM至少于或约
0.5nM;少于或0.01nM至少于或约1nM;少于或约0.05nM至少于或约1nM;少于或约0.05nM
至少于或约0.5nM;或者少于或约0.1nM至少于或约0.5nM的中和RSV的EC50。
中,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段中和MARM,该中和的EC50与中和产生MARM
的亲本RSV病毒株的EC50相同或大约相同。如果第一抗体可以中和针对第二抗体产生的
MARM,可以得出结论所述抗体特异性结合不同表位或与不同表位相互作用。
细胞受体的结合至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约
80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中,相对于所述抗RSV抗体
或其抗原结合片段不存在的情况下的RSV复制,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片
段抑制RSV复制至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约
80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
其抗原结合片段的半衰期的方法是本领域已知的。这类方法包括例如,如本文其他地方所
述的聚乙二醇化、糖基化和氨基酸取代。
异性。抗体片段可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如,利用诸如木瓜蛋
白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)的酶通过蛋白酶切割免
疫球蛋白分子可以产生Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含可变区、轻链恒定区和
重链的CH1结构域。此外,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以利用本领域
已知的各种噬菌体展示方法产生。在一些实例中,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结
合片段的抗原结合可变区可以重组融合至本领域已知的一个或多个恒定区以产生嵌合全
长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2或其他抗原结合片段。从抗体片段产生全长抗体的示例性方法是本领域已知的,并且如本文所提供。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的(参见例
如,Morrison(1985)Science 229:1202;Oi et al.(1986)BioTechniques 4:214;Gillies et al.(1989)J.Immunol.Methods125:191-202;以及美国专利号5,807,715、4,816,567和
4,816,397)。
植(EP 239,400;PCT公开第WO 91/09967号;以及美国专利号5,225,539、5,530,101和
5,585,089)、镶饰或重塑(EP 592,106;EP519,596;Padlan(1991)Molecular Immunology
28(4/5):489-498;Studnicka et al.(1994)Protein Engineering 7(6):805-814; 和
Roguska et al.(1994)PNAS91:969-973)以及链改组(美国专利第5,565,332号)。
CDR(例如,SEQ ID NO:10-12、1628和14-16所示的一个或多个CDR)以及异源框架区。框架区中的框架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变,例如提高抗原结合。通
过本领域公知的方法来鉴定这些框架取代,例如,通过模拟CDR与框架残基的相互作用以
鉴定对抗原结合很重要的框架残基以及序列比较以鉴定在特定位置的罕见框架残基(参
见,例如,美国专利第5,585,089号;以及Riechmann et al.(1988)Nature 332:323)。
约2.5×M 、至少或约5×M 、至少或约1×M 、至少或约5×M 、至少或约1× M 、至少
10 -1 11 -1 11 -1 12 -1 12 -1
或约5× M 、至少或约1× M 、至少或约5× M 、至少或约1× M 、至少或约5× M 、至
13 -1 13 -1 14 -1 14 -1 15 -1
少或约1× M 、至少或约5× M 、至少或约1× M 、至少或约5× M 、至少或约1× M 或
15 -1
者至少或约5× M 的对RSV F蛋白表位的结合亲和常数(Ka)。
约4×10 M、少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、
-11 -11 -12 -12
少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约
-13 -13 -14 -14 -15
2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约2×10 M、少于或约1×10 M、少于或约2×10 M、
-15 -16
少于或约1×10 M或者少于或约2×10 M的对RSV F蛋白表位的解离常数(Kd)。
中,衍生抗RSV抗体或其抗原结合片段在体外空斑减少测定中具有少于或约0.005nM至少
于或约2nM;少于或约0.005nM至少于或1nM;少于或约0.005nM至少于或约0.5nM;少于
或0.01nM至少于或约1nM;少于或约0.05nM至少于或约1nM;少于或约0.05nM至少于或约
0.5nM;或者少于或约0.1nM至少于或约0.5nM的中和RSV的EC50。
方法是本领域已知的,例如Marasco et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:7889-7893,
Whitlow and Filpula(1991)Methods,2:97-105;Bird et al.(1988)Science 242:423-426;
Pack et al.(1993)Bio/Technology 11:1271-77;以及美国专利号4,946,778、5,840,300、
5,667,988、5,658,727所述的方法。
体的VL结构域或其功能区包含本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的互补性决定
区1(CDR1)、互补性决定区2(CDR2)和/或互补性决定区3(CDR3)。在一些实例中,所述单
链抗体的VH结构域或其功能区包含本文所提供的任何抗RSV抗体或其抗原结合片段的互
补性决定区1(CDR1)、互补性决定区2(CDR2)和互补性决定区3(CDR3)。在一些实例中,所
述单链抗体进一步包含肽接头。在这类实例中,肽接头可以位于轻链可变结构域(VL)与重
链可变结构域(VH)之间。
肽接头是本领域公知的,并且可以用于所提供的方法。肽接头可以包括一系列甘氨酸残基
(Gly)或丝氨酸(Ser)残基。多肽接头的实例为具有氨基酸序列(Gly-Ser)n、(GlymSer)
n或(SermGly)n的肽,其中m为1-6,通常为1-4,并且典型为2-4,而n为1-30,或者1-10,
并且典型为1-4,具有分散的一些谷氨酸(Glu)或赖氨酸(Lys)残基以增加溶解性(参见,
例如,国际PCT申请第WO 96/06641号,其提供用于缀合物的示例性接头)。示例性肽接
头包括但不限于具有序列GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ IDNO:1512)、GSGRSGGGGSGGGGS(SEQ
ID NO:1513),EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:1514)、EGKSSGSGSESKSTQ(SEQ IDNO:
1515)、EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:1516)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:1517)、
KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:1518)和ESGSVSSEELAFRSLD(SEQ ID NO:1519)的肽。通
常,接头肽的长度为约1-50个氨基酸。本文所用的接头还可以增加细胞内可用性、血清
稳定性、特异性和溶解性,或者提供增加的柔性或解除空间位阻。连接部分例如Huston
et al.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883,Whitlow et al.(1993)Protein
Engineering 6:989-995,和Newton et al.,(1996)Biochemistry35:545-553所述。其他合适的肽接头包括美国专利第4,751,180号或第4,935,233号所述的任何肽接头,这些文献
援引加入本文。
体(参见,例如,Greenspan & Bona(1989)FASEB J.7(5):437-444;和Nissinoff(1991)
J.Immunol.147(8):2429-2438)。例如,如本领域公知的测定所确定的,本文所提供的结合并竞争性抑制RSV结合其宿主细胞受体的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用来产生“模
拟”RSV抗原并结合RSV受体的抗独特型,即与病毒竞争结合宿主细胞,因此降低宿主细胞
的病毒感染率。在一些实例中,抗抗独特型可以通过技术人员公知的技术产生。所述抗抗
独特型模拟所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的结合结构域,并且因此结合和中和RSV。
性的,包含两个或更多个免疫特异性地结合两个或更多个不同表位的抗原结合结构域。在
一些特定实例中,所述多价衍生抗体是二价的,包含两个抗原结合结构域。这类二价抗体可以是同二价或异二价抗体,它们分别免疫特异性地结合相同或不同表位。
或更多个抗RSV抗体或其抗原结合片段的二聚化形成。两个抗RSV抗体或其抗原结合片段
之间的多聚化可以是自发的,或者可以由于两个或更多个多肽的强迫连接而发生。在一实
例中,抗RSV抗体的聚合物可以通过不同抗RSV抗体上的半胱氨酸残基之间形成的二硫键
来连接。在另一实例中,多价衍生抗体可以包括通过与融合至抗体或其抗原结合片段的肽
部分的共价或非共价相互作用连接的抗RSV抗体或其抗原结合片段。这类肽可以是肽接头
(间隔物),或者是具有促进多聚化的特性的肽。在一些实例中,多价衍生抗体可以在两个
抗体之间通过化学连接形成,例如通过异双功能接头。
述衍生抗体至少对58c5或sc5识别的表位是免疫特异性的。
4或12所示的氨基酸序列的VH CDR3,具有SEQ ID NO:6或14所示的氨基酸序列的VL CDR1,具有SEQ ID NO:7或15所示的氨基酸序列的VL CDR2,具有SEQ ID NO:8或16所示的氨基酸序列的VL CDR3,或者它们的任何组合。
例如,所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的A、B或C抗原区中的两个或更
多个不同表位。在一些实例中,可以产生多特异性抗体,其免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和另一RSV表位。例如,所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和
另一RSV表面糖蛋白的表位。在一些实例中,所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和选自以下RSV蛋白的表位:RSV附着蛋白(例如,具有SEQ ID NO:1520所示
的氨基酸序列)、RSV RNA聚合酶β亚基大结构蛋白(L蛋白)(例如具有SEQ ID NO:1521
所示的氨基酸序列)、RSV核壳蛋白(例如,具有SEQ ID NO:1522所示的氨基酸序列)、RSV
核蛋白(N)(例如,具有SEQ ID NO:1523所示的氨基酸序列)、RSV磷蛋白P(例如具有SEQ
ID NO:1524所示的氨基酸序列)、RSV基质蛋白(例如具有SEQ ID NO:1525所示的氨基酸
序列)、RSV小疏水(SH)蛋白(例如具有SEQ ID NO:1526所示的氨基酸序列)、RSV RNA依
赖性聚合酶、RSV G蛋白(例如具有SEQ ID NO:1528所示的氨基酸序列),或者上述任何蛋
白的等位变体。在一些实例中,所述多特异性抗体可以免疫特异性地结合RSV F蛋白的表位和RSV G蛋白的表位。
性抗体包含来源于58c5或sc5的抗RSV抗原结合片段以及来源于选自以下抗RSV抗
体的抗RSV抗原结合片段:帕利珠单抗 及其衍生物,例如但不限于莫他
珠 单 抗 AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、
A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S(参见,例如,美国专利第5,824,307号和第
6,818,216号)。在一些实例中,所述多特异性抗体包含来源于58c5或sc5的抗RSV抗
原结合片段以及来源于人抗RSV抗体的抗RSV抗原结合片段,所述人抗RSV抗体例如但
不限于rsv6、rsv11、rsv13、rsv19(即Fab 19)、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1和RF-2(参
见,例如,美国专利第6,685,942号和第5,811,524号)。在一些实例中,所述多特异性抗
体包含来源于58c5或sc5的抗RSV抗原结合片段以及来源于抗RSV小鼠单克隆抗体的
抗RSV抗原结合片段,所述抗RSV小鼠单克隆抗体包括但不限于MAbs 1153、1142、1200、
1214、1237、1129、1121、1107、1112、1269、1269、1243(Beeler et al.(1989)J.Virology
63(7):2841-2950)、MAb151(Mufson et al.(1987)J.Clin.Microbiol.25:1635-1539)、
MAbs 43-1 和 13-1(Fernie et al.(1982)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171:266-271)、MAbs
1436C、1302A、1308F、和 1331H(Anderson et al.(1984)J.Clin.Microbiol.19:934-936),以及它们的人源化衍生物。可以用来产生包含来源于58c5或sc5的抗RSV抗原结合
片段的多特异性抗体的额外的示例性抗体或其抗原结合片段包括但不限于例如美国专
利 号 6,413,771、5,840,298、5,811,524、6,656,467、6,537,809、7,364,742、7,070,786、
5,955,364、7,488,477、6,818,216、5,824,307、7,364,737、6,685,942和5,762,905以及美国专利公开号2007-0082002、2005-0175986、2004-0234528、2006-0198840、2009-0110684、
2006-0159695、2006-0013824、2005-0288491、2005-0019758、2008-0226630、2009-0137003和2009-0092609所述的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
PCT公开号WO 93/17715、WO 92/08802、WO91/00360和WO 92/05793;美国专利号4,474,893、
4,714,681、4,925,648、5,573,920 和 5,601,819;Tutt,et al.,(1991)J.Immunol.147:
60-69;以及Kostelny et al.,(1992)J.Immunol.148:1547-1553)。
和第二多肽的N末端。这个结构可以重复多次,从而至少1个,例如2、3、4或更多个可溶性多肽通过在它们各自末端的肽接头互相连接。例如,聚合物多肽可以具有序列Z1-X-Z2,其中Z1和Z2各自为抗RSV抗原结合片段序列(例如抗RSV单链抗体;参见,例如,美国专利第
6,759,518号,描述单链抗体的多聚化),并且其中X为肽接头序列。在某些情况下,Z1和/
或Z2是本文所提供的抗RSV抗原结合片段。在另一实例中,Z1和Z2是不同抗RSV抗原结合
片段,其中至少Z1或Z2来源于本文所提供的抗RSV抗体或抗原结合片段。在一些实例中,
所述聚合物多肽具有Z1-X-Z2-(X-Z)n序列,其中“n”为任何整数,即一般为1或2。通常,所述肽接头具有足够长度以允许每个抗RSV抗原结合片段结合其各自的表位而不干扰抗体
的结合特异性。
的连接可以通过化学连接实现或者通过异双功能接头来促进,例如本领域已知或本文所提
供的任何异双功能接头。
Catalog & Handbook,1992-1993,其描述这类试剂的制备和用途,并且提供这类试剂的商业来源;还参见,例如,Cumber et al.,(1992)Bioconjugate Chem.3:397-401;Thorpe et al.,(1987)Cancer Res.47:5924-5931;Gordon et al.,(1987)Proc.Natl.Acad Sci.84:
308-312;Walden et al.,(1986)J.Mol.Cell Immunol.2:191-197;Carlsson et al.,
(1978)Biochem.J.173:723-737;Mahan et al.,(1987)Anal.Biochem.162:163-170;
Wawryznaczak et al.,(1992)Br.J.Cancer 66:361-366;Fattom et al.,(1992)Infection & Immun.60:584-589)。这些试剂可以用来形成两个抗体之间或每个抗体与接头之间的共价
键。示例性试剂包括但不限于:N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP;二硫
键接头);磺基琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫代)-丙酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SPDP);
琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基苄基硫代硫酸酯(SMBT,受阻焦硫酸盐接头);琥珀酰亚
胺基6-[3-(2-吡啶二硫代)丙酰胺基]-己酸酯(LC-SPDP);磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马
来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC);琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丁
酸酯(SPDB;受阻二硫键接头);磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙
酰胺)乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(SAED);磺基-琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆
素-3-乙酸酯(SAMCA);磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶二硫代)甲苯甲酰
胺基]-己酸酯(磺基-LC-SMPT);1,4-二-[3′-(2′-吡啶二硫代)3-戊酮-酰氨基]
丁烷(DPDPB);4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶硫代)甲苯(SMPT,受阻
焦硫酸盐接头);磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-嘧啶基二-硫代)甲苯甲酰胺
基]己酸酯(磺基-LC-SMPT);间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(MBS);
间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS);N-琥珀酰亚胺基
(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB;硫代酸酯接头);磺基琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)
氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB);琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB);
磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基-苯基)丁酸酯(磺基-SMPB);以及叠氮苯甲酰
基酰肼(ABH)。在一些实例中,所述接头可以与肽接头联用,例如增加柔性或溶解性或者提供或消除空间位阻的肽接头。可以采用本领域技术人员已知的将多肽分子连接至另一分子
的任何其他接头。
进。例如,分别编码的多肽链可以通过多聚化连接,所述多肽的多聚化由多聚化结构域介
导。通常,所述多聚化结构域提供第一嵌合多肽与第二嵌合多肽之间稳定的蛋白-蛋白相
互作用的形成。嵌合多肽包括例如具有多聚化结构域的抗体或其抗原结合片段的一条链
(例如,可变重结构域链或可变轻链结构域)的连接(直接或间接)。通常,所述多聚化结
构域连接至所述抗体或其抗原结合片段的重链结构域。这类嵌合多肽可以利用将编码所述
抗体链的核酸融合至编码所述多聚化结构域的核酸的重组技术作为融合蛋白产生。
独的嵌合多肽的共表达产生。所述第一和第二嵌合多肽可以相同或不同。
疏水区、亲水区或者形成同源聚合物或异源聚合物的嵌合分子之间的分子间二硫键的游离
硫醇来相互作用。此外,多聚化结构域可以包括包含突起的氨基酸序列,所述突起与包含洞或口袋的氨基酸序列互补,例如美国专利第5,731,168号所述。这样的多聚化区可以工程
化,使得空间相互作用不仅促进稳定的相互作用,而且进一步促进从嵌合单体的混合物形
成异源二聚体超过同源二聚体。
其抗原结合片段,例如,58c5或sc5。
段,所述多聚化结构域可以缀合至一条链,通常为重链。所述抗原结合片段通常通过其N端或C端连接至所述多聚化结构域的N端或C端来连接至所述多聚化结构域。通常,所述多聚
化结构域缀合至所述抗原结合片段的C端(例如,单链抗体的C端或者所述抗原结合片段
的一条链的C端)。所述连接可以是直接的,或者是通过接头间接的。而且,所述嵌合多肽
可以是融合蛋白,或者可以通过化学连接形成,例如通过共价或非共价相互作用。例如,当制备包含多聚化结构域的嵌合多肽时,编码全部或部分抗RSV抗原结合片段的核酸可以可
操作地连接至编码所述多聚化结构域序列的核酸,直接或间接或任选通过接头结构域。通
常,构建体编码嵌合蛋白,其中所述抗-RSV抗原结合片段(或者所述抗原结合片段的单链)
的C端连接至所述多聚化结构域的N端。
多肽时,将编码所述抗RSV抗原结合片段(或者所述抗原结合片段的单链)多聚化结构域
嵌合多肽的基因融合物插入适当的表达载体。所得的抗RSV抗原结合片段-多聚化结构域
嵌合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达,并且允许装配为聚合物,其中所
述多聚化结构域相互作用以形成多价抗体。多聚化结构域化学连接至抗RSV抗原结合片段
还可以如上文所讨论利用异双功能接头实现。在一些实例中,所述多价抗体是来源于结合
不同表位的两个或更多个抗RSV抗原结合片段的多特异性抗体。
两个核酸分子转化入细胞时,同源二聚体和异源二聚体的形成会发生。可以调整表达条件,从而异源二聚体的形成优于同源二聚体的形成。
以包括免疫球蛋白分子的部分,例如来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgM和IgE。通常,选择用作多聚化结构域的免疫球蛋白的部分为恒定区(Fc)。已描述包含融合至抗体来
源多肽的各种部分(包括Fc结构域)的多肽的融合蛋白的制备(参见,例如,Ashkenazi
et al.(1991)PNAS 88:10535;Byrn et al.(1990)Nature,344:677;和 Hollenbaugh and Aruffo,(1992)“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins,”in Current
Protocols in Immunology,Suppl.4,pp.10.19.1-10.19.11)。
含代替铰链区的额外的C结构域(C4)。IgG、IgD和IgA的Fc区通过它们的Cγ3、Cδ3和
Cα3结构域互相配对,而IgM和IgE的Fc区通过它们的Cμ4和Cε4结构域二聚化。IgM
和IgA分别形成具有10个和4个抗原结合位点的多价结构。
多肽可以包含抗原结合结构域以及用于多聚化的一个或多个免疫球蛋白结构域,其中所述
嵌合多肽不是全长免疫球蛋白)。在一些实例中,所述抗RSV抗原结合嵌合多肽装配为单价
或异多价或同多价抗体,例如二价、三价、四价、五价、六价、七价或更高价抗体。不同结构的链或基本单元(例如,一个或多个异源恒定区或结构域)可以用来装配单价和异多价和同
多价抗体。抗RSV抗原结合嵌合多肽可以通过用适当的核酸分子转化的哺乳动物细胞很容
易产生和分泌。在一些实例中,一个或超过一个核酸融合分子可以转化入宿主细胞以产生
多价抗体,其中所述多价抗体的抗RSV抗原结合部分相同或不同。通常,所述多价抗体的至少一个抗RSV抗原结合部分来源于本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段,例如,58c5
或sc5。
IgG亚型的重链恒定区的示例性序列如SEQ IDNOS:1601(IgG1)、SEQ ID NO:1602(IgG2)、SEQ ID NO:1603(IgG3)和SEQID NO:1604(IgG4)所示。例如,对于SEQ ID NO:1601所示的示例性重链恒定区,CH1结构域对应氨基酸1-103,铰链区对应氨基酸104-119,CH2结构域对应
氨基酸120-223,而CH3结构域对应氨基酸224-330。
IgG1的全长Fc序列包括SEQ ID NO:1601所示序列的氨基酸104-330。hIgG1的示例性Fc
序列如SEQ ID NO:1605所示,并且包含对应于SEQ ID NO:1601的氨基酸104-119的铰链序列,以及如SEQ ID NO:1601所示的CH2和CH3结构域的完整序列。另一示例性Fc多肽如PCT
申请WO 93/10151所示,并且是从N端铰链区延伸至人IgG1抗体Fc区的天然C端的单链
多肽(SEQ ID NO:1606)。进行连接的精确位点不是关键:具体位点是本领域公知的,并且可以选择以便优化所述抗RSV抗原结合嵌合多肽的生物活性、分泌或结合特征。例如,其他示例性Fc多肽序列开始于SEQ ID NO:1601所示序列的氨基酸C109或P113(参见例如,美国
2006/0024298)。
蛋白序列,所述抗体类别包括但不限于抗体的IgG(包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE和IgM类别。
可以使用与难以募集补体或效应细胞的IgG同种型,例如IgG2或IgG4的Fc的融合物。
2008/0287657;以及国际专利公开第WO2005/063816号。Fc结构域的示例性氨基酸修饰还
在本文其他地方提供。
合物插入适当的表达载体。所得的嵌合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表
达,并且允许装配,其中Fc部分之间形成链间二硫键以产生二价抗RSV抗体。通常,宿主细胞和表达系统为哺乳动物表达细胞以允许所述嵌合蛋白的糖基化。所得的包含Fc部分的
嵌合多肽以及由其形成的多价抗体可以在A蛋白或G蛋白柱上通过亲和层析轻易纯化。当
编码不同抗RSV嵌合多肽的两个核酸转化入细胞时,异源二聚体的形成必须生化实现,因
为携带Fc-结构域的抗RSV嵌合分子还会表达为二硫键连接的同源二聚体因此,可以在有
利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下减少同源二聚体。通常,将具有不同细
胞外部分的嵌合单体以等摩尔量混合并氧化以形成同源二聚体和异源二聚体的混合物。通
过层析技术分离混合物组分。
二聚体。因为亮氨酸拉链主要形成异源二聚体,当需要时它们可以用来驱动异源二聚体的
形成。包含Fc区的抗RSV嵌合多肽还可以工程化以包括具有金属螯合物或其他表位的标
签。标记的结构域可以用于通过金属螯合层析和/或通过抗体快速纯化,允许在生物测定
中蛋白印迹、免疫沉淀或活性消耗/阻断检测。
原结合片段的免疫原性,改善所述抗体或抗原结合片段的半衰期,例如降低对蛋白水解的
敏感性和/或降低对氧化的敏感性,以及改变或改善所述抗体或其抗原结合片段的结合特
性。示例性修饰包括但不限于所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的一级氨基酸序列的修饰
以及所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰的改变。示例性翻译后修饰包括例如
糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切割、连接至细胞配体或其他蛋白。其他示例性修饰包括将一个或多个异源肽连接至所述抗RSV抗体
或抗原结合片段以改变或改善所述抗体或其抗原结合片段的一种或多种特性。
合RSV F蛋白的方法如本文所提供,并且是本领域已知的。例如,可以通过例如但不限于
ELISA、表面等离子共振(SPR)的方法或者通过体外微量中和测定来测定修饰的抗体或其
抗原结合片段与RSV F蛋白的结合。
段的疗效,并且允许较低频率施用所述抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗,例如
预防或治疗RSV感染,预防、治疗和/或缓解RSV感染的一种或多种症状,或者减少RSV感
染的持续时间。
已知的技术的Fc修饰来增强。本领域技术人员已知的标准技术可以用来将突变引入编码
本文所提供的抗体或抗原结合片段的核苷酸分子以便产生具有一个或多个氨基酸取代的
多肽。引入突变的示例性技术包括但不限于位点定向诱变和PCR介导的诱变。
合至所述肽的抗体。常用于纯化的示例性肽包括但不限于6-组氨酸肽、血凝素(HA)肽和
flag标签肽(参见例如,Wilson et al.(1984)Cell 37:767;Witzgall et al.(1994)Anal Biochem 223:2,291-8)。融合不必是直接的,而是可以通过接头肽发生。在一些实例中,所述接头肽包含蛋白酶切割位点,其允许纯化之后通过用特异性识别所述蛋白酶切割位点的
蛋白酶切割来去除纯化肽。
上皮细胞)。在一些实例中,本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过将所述抗
体或其抗原结合片段融合或缀合至特定细胞表面受体特异性的抗体或者与特定细胞受体
相互作用的其他多肽来靶向至特定细胞类型。
TAT肽),来靶向至靶细胞表面和/或被靶细胞吸收。示例性蛋白转导结构域包括但不限于
来源于诸如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)TAT的蛋白的PTD(Ruben et al.(1989)J。Virol.63:
1-8;例如,SEQ IDNO:1571-1582,例如,GRKKRRQRRR(TAT 48-57)SEQ ID NO:1575)),疱疹病毒被膜蛋白VP22(Elliott and O’Hare(1997)Cell 88:223-233;例如,SEQID NO:1587),果蝇(Drosophila melanogaster)触角足(Antp)蛋白的同源异型蛋白(Penetratin PTD;
Derossi et al.(1996)J.Biol.Chem.271:18188-18193;例 如,SEQ ID NO:1556-1559),protegrin 1(PG-1)抗菌肽SynB(例如,SynB1、SynB3和Syn B4;Kokryakov et al.(1993)
FEBS Lett.327:231-236;例如,分别为SEQ ID NO:1568-1570)以及碱性成纤维细胞生长因子(Jans(1994)FASEB J.8:841-847;例如,SEQ ID NO:1552)。PTD还包括合成PTD,例如但不限于聚精氨酸肽(Futaki et al.(2003)J.Mol.Recognit.16:260-264;Suzuki et
al.(2001)J.Biol.Chem.276:5836-5840;例如SEQ ID NO:1560-1561),transportan(Pooga et al.(1988)FASEB J.12:67-77;Pooga et al.(2001)FASEB J.15:1451-1453;例如,SEQ ID NO:1583-1586),MAP(Oehlke et al.(1998)Biochim.Biophys.Acta.1414:127-139;
例 如,SEQ ID NO:1550),KALA(Wyman et al.(1997)Biochemistry 36:3008-3017;例如,SEQID NO:1548)以及其他阳离子肽,例如,各种β-阳离子肽(Akkarawongsa et al.(2008)Antimicrob.Agents and Chemother.52(6):2120-2129)。
通过将任何类型的分子,例如诊断或治疗分子共价连接至所述抗体或其抗原结合片段来修
饰,所述共价连接不阻止所述抗体或其抗原结合片段结合其相应表位。例如,本文所提供
的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以通过共价连接分子来进一步修饰,所述共价连接不阻
止所述抗体或其抗原结合片段结合RSV。在一些实例中,所述抗体或其抗原结合片段可以
在N端或C端重组融合至异源多肽,或者化学缀合至异源多肽或其他组合物,包括共价和非
共价缀合。例如,所述异源多肽或组合物可以是诊断多肽或其他诊断部分或者治疗性多肽
或其他治疗性部分。示例性诊断和治疗性部分包括但不限于药物、放射性核苷酸、毒素、荧光分子(参见,例如国际PCT公开号WO 92/08495;WO 91/14438;WO89/12624;美国专利第
5,314,995号;以及EP 396,387)。诊断多肽或诊断部分可以用作例如标记用于体内或体外
检测。治疗性多肽或治疗性部分可以用于例如病毒感染(如RSV感染)的治疗,或者用于
病毒感染的一种或多种症状的治疗。
组可以用来改变本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的活性,例如,产生具有较高
亲和性和较低解离速率的抗体或其抗原结合片段(参见,通常,美国专利号5,605,793;
5,811,238;5,830,721;5,834,252;和5,837,458,以及Patten et al.(1997)Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33;Harayama(1998)Trends Biotechnol.16(2):76-82;Hansson et al.,(1999)J.Mol.Biol.287:265-76;以 及 Lorenzo and Blasco(1998)Biotechniques
24(2):308-13)。
个氨基酸以改变人T-细胞的潜在表位,以便消除或降低所述抗体或其抗原结合片段暴露
于对象的免疫系统时的免疫原性。示例性修饰包括一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入,这消除或降低所述抗体或其抗原结合片段的免疫原性。通常,这类修饰不改变所述抗体或
其抗原结合片段对其各个抗原的结合特异性。降低所述抗体或其抗原结合片段的免疫原性
可以改善所述抗体或其抗原结合片段的一种或多种特性,例如,提高所述抗体或其抗原结
合片段的疗效和/或增加所述抗体或其抗原结合片段在体内的半衰期。
肽的一种或多种特性。例如,可以修饰所述Fc区以改变(即或多或少)与野生型免疫球
蛋白重链的Fc区的效应子功能相比的效应子功能。抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相
互作用,赋予称为效应子功能的一批重要功能性能力。Fc效应子功能包括例如Fc受体结
合、补体结合以及T细胞消除活性(参见例如,美国专利第6,136,310号)。测定T细胞消
除活性、Fc效应子功能以及抗体稳定性的方法是本领域已知的。例如,IgG分子的Fc区与
FcγR相互作用。这些受体在各种免疫细胞中表达,包括例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤(NK)细胞以及γδT细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞募集至结合
抗原的位点,通常导致细胞内的信号事件以及重要的随后的免疫应答,例如释放炎症介质、B细胞活化、胞吞作用、吞噬作用以及细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。表达FcγR的细胞毒性细胞识别和裂解靶细胞上结合
的抗体称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。各种抗体同种型的其他Fc受体包括
FcεR(IgE)、FcαR(IgA)和FcμR(IgM)。
通常基本上比IgG2和IgG4更好地结合受体。此外,不同的FcγR介导不同的效应子功
能。FcγR1、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发活化的正调节物,其特征在于具
有细胞内结构域,所述细胞内结构域具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。然而,
FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM),并且因此是抑制的。因此,改变Fc
区对受体的亲和性可以调节Fc结构域所诱导的效应子功能。
多个氨基酸残基(根据Kabat编号方案,Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of
Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services)处的修饰,包括但不限于氨基酸位置249、252、259、262、268、271、273、277、280、281、285、287、296、300、
317、323、343、345、346、349、351、352、353和424。例如,Fc区中的修饰可以对应于以下任一个或多个进行:SEQ ID NO:1601所示的示例性IgG1序列的G119S、G119A、S122D、S122E、S122N、S122Q、S122T、K129H、K129Y、D132Y、R138Y、E141Y、T143H、V147I、S150E、H151D、E155Y、E155I、E155H、K157E、G164D、E166L、E166H、S181A、S181D、S187T、S207G、S307I、K209T、K209E、K209D、A210D、A213Y、A213L、A213I、I215D、I215E、I215N、I215Q、E216Y、E216A、K217T、K217F、K217A和P279L,或者它们的组合。包含这些突变的修饰的Fc可以
具有增强的与FcR(例如活化受体FcγIIIa)的结合,和/或可以具有减少的与抑制受体
FcγRIIb的结合(参见例如,美国2006/0024298)。修饰以具有增加的与FcR的结合的Fc
区可以在促进破坏患者中病毒(例如RSV)感染的细胞中更有效。
的体内半衰期和药物动力学(参见,例如,美国专利第7,217,797号,美国专利公开第
2006/0198840号和第2008/0287657号)。FcRn为新生儿FcR,其结合将胞吞的抗体或其抗
原结合片段从核内体回收至血流。这个过程,加上由于全长分子的大尺寸而不被肾过滤,导致有利抗体的血清半衰期范围为1-3周。Fc结合FcRn还在抗体运输中起作用。
述的Fc的突变,例如在Fc重链恒定区的CH2结构域中的氨基酸残基(Kabat编号,Kabat
et al.(1991))251-256、285-90、308-314和/或CH3结构域中的氨基酸残基385-389和
428-436中的一个或多个处的突变,其中相对于未修饰的抗体或其抗原结合片段,所述修饰改变Fc受体结合亲和性和/或血清半衰期。在一些实例中,在Fc区中于IgG重链恒定区
的CH2结构域中的氨基酸位置250、251、252、254、255、256、263、308、309、311、312和314和/或CH3结构域的氨基酸位置385、386、387、389、428、433、434、436和459中的一个或多个处修饰IgG恒定结构域。这类修饰对应SEQ ID NO:1601所示示例性IgG1序列中的CH2结构
域中的氨基酸Gly120、Pro121、Ser122、Phe124、Leu125、Phe126、Thr133、Pro174、Arg175、Glu177、Gln178和Asn180以及CH3结构域中的氨基酸Gln245、Val246、Ser247、Thr249、
Ser283、Gly285、Ser286、Phe288和Met311。在一些实例中,所述修饰在一个或多个表面暴露的残基,并且所述修饰是用与被取代的残基具有相似电荷、极性或疏水性的残基取代。
或Thr取代,位置254用Thr或Ser取代,位置255用Leu、Gly、Ile或Arg取代,和/或位
置256用Ser、Arg、Gln、Glu、Asp、Ala、Asp或Thr取代。在一些实例中,在氨基酸位置308、
309、311、312和314中的一处或多处修饰Fc重链恒定区,其中位置308用Thr或Ile取代,
位置309用Pro取代,位置311用丝氨酸或Glu取代,位置312用Asp取代,和/或位置314
用Leu取代。在一些实例中,在氨基酸位置428、433、434和436中的一处或多处修饰Fc重
链恒定区,其中位置428用Met、Thr、Leu、Phe或Ser取代,位置433用Lys、Arg、Ser、Ile、Pro、Gln或His取代,位置434用Phe、Tyr或His取代,和/或位置436用His、Asn、Asp、
Thr、Lys、Met或Thr取代。在一些实例中,在氨基酸位置263和459中的一处或多处修饰
Fc重链恒定区,其中位置263用Gln或Glu取代,和/或位置459用Leu或Phe取代。
白酶C1r和C1s形成复合物以形成C1复合物。C1q能够结合6个抗体,虽然结合2个IgG
足以激活补体级联。与Fc与FcR相互作用相似,不同IgG亚类对C1q具有不同亲和性,IgG1
和IgG3通常基本上比IgG2和IgG4更好地结合。因此,具有增加的与C1q结合的修饰的Fc
可以介导增强的CDC,并且可以增强破坏病毒(例如,RSV)感染的细胞。增加与C1q结合的
Fc区中的示例性修饰包括但不限于在位置345和353(Kabat编号)处的氨基酸修饰。示
例性修饰包括对应SEQ ID NO:1601所示示例性IgG1序列中的K209W、K209Y和E216S的修
饰。
但不杀死包含靶抗原的细胞时这是常有的事。这样的Fc的实例是美国专利第5,457,035号
所述的Fc突变蛋白,其在氨基酸位置248、249和251(Kabat编号)处修饰。在SEQ ID NO:
1601所示的示例性IgG1序列中,氨基酸117从Leu修饰为Ala,氨基酸118从Leu修饰为
Glu,并且氨基酸120从Gly修饰为Ala。相似突变可以在任何Fc序列中进行,例如,示例性
Fc序列。该突变蛋白表现出降低的对Fc受体的亲和性。
例如美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、
5,783,181、5,908,626、5,844,095 和 5,112,946;EP 307,434;EP 367,166;EP 394,827;
PCT公开WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813;Ashkenazi et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539;Traunecker et al.(1988)
Nature331:84-86;Zheng et al.(1995)J.Immunol.154:5590-5600;以及Vil et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341(1992)所述,并且在本文其他地方描述。在一些实例中,具有增加FcRn结合亲和性和/或改善半衰期的一个或多个修饰的修饰的Fc区可
以融合至本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。
技术人员已知的技术来进行。据证实治疗性抗体与PEG的缀合增强药效学而不干扰功能
(参见,例如,Deckert et al.,Int.J.Cancer 87:382-390,2000;Knight et al.,Platelets
15:409-418,2004;Leong et al.,Cytokine 16:106-119,2001;和 Yang et al.,Protein Eng.16:761-770,2003)。PEG可以连接至所述抗体或抗原结合片段(有或无多功能接头),通过将PEG位点特异性缀合至所述抗体或抗原结合片段的N端或C端,或者通过赖氨酸残
基上存在的ε-氨基。可以使用导致生物活性的最小损失的线性或支化聚合物衍生化。缀
合程度可以通过SDS-PAGE和质谱分析法监测以确保PEG分子适当缀合至所述抗体。未反
应的PEG可以通过例如大小排阻层析或离子交换层析从抗体-PEG缀合物分离。可以利用
本领域技术人员已知的方法测试PEG衍生的抗体或其抗原结合片段与RSV抗原的结合活性
以及体内效力,例如,通过本文所述的免疫测定。
以体内和/或体外检测。例如,可检测部分可以用于检测暴露于RSV或RSV的定位的诊断
方法或者确定所述抗RSV抗体或其抗原结合片段对RSV的结合亲和性的结合测定。可检测
部分还可以用于制备所述抗RSV抗体的方法,例如,所述抗体或其抗原结合片段的纯化。通常,选择可检测部分,从而可检测部分的缀合不干扰所述抗体或其抗原结合片段结合靶表
位。通常,可检测部分的选择取决于所需的灵敏度、容易与化合物缀合、稳定性要求、可用仪器以及处理规定。本领域技术人员熟悉标记,并且可以鉴定适合和相容于所采用的测定的
可检测的标记。用可检测部分标记抗体的方法是本领域已知的,并且包括例如重组和化学
方法。
应用于所提供的方法。因此,标记是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的任何组合物。有用的标记包括但不限于荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素、德克
3 125 35 14 32
萨斯红、罗丹明等),放射性标记(例如,H、I、S、C或 p),特别地,γ和正电子发射放
157 55 162 52 56 111 97 67 68 72
射性同位素(例如,Gd、Mn、 Dy、Cr和 Fe),金属离子(例如, In、Ru、Ga、Ga、As、
89 201
Zr和 TL),酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及ELISA中常用的其他酶),电子转
移剂(例如,包括金属结合蛋白和化合物),发光和化学发光标记(例如,萤光素和2,3-二
TM
氢酞嗪酮(2,3-dihydrophtahlazinediones),例如,鲁米诺),磁珠(例如,DYNABEADS ),以及比色标记,例如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。可以使用的各种标记或信号产生系统的综述参见例如美国专利第4,391,904号。
细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如,α-发射体)。示例性细胞毒素或细胞毒剂
包括但不限于对细胞有害的任何物质,例如但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、
溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二氢蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素,以及它们的类似物或同系物。示例性治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如,甲氨
蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine)),烷
化剂(例如,氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、
环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C以及顺铂
(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂(cisplatin)),蒽环类(例如,柔红霉
素(原来为道诺霉素)和多柔比星),抗生素(例如,放线菌素D(dactinomycin)(原来
为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC)),抗有丝分裂剂(例如,长春新碱
和长春碱),以及抗病毒药,例如但不限于核苷类似物,如齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦(gangcyclovir)、阿糖腺苷、碘苷、曲氟尿苷和利巴韦林;膦甲酸(foscamet)、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦和α-干扰素。
蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素;或者免疫刺激剂,如细胞因子,例如但不限于干扰素(例如,IFN-α、β、γ、ω),淋巴因子,造血生长因子,例如但不限于GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-7(IL-7)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素-14(IL-14)和肿瘤坏死因子
(TNF)。
克隆和表达抗体种类的文库。其他人已描述产生组合文库的各种噬粒克隆系统。参见,例
如Kang et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:4363-4366;Barbas et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:7978-7982;Zebedee et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3175-3179;Kang et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:11120-11123;
Barbas et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:4457-4461;和Gram et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3576-3580所述在噬粒上制备组合抗体文库,这些文献援引加入本文。
一起并克隆入噬粒载体(例如,p CANTAB 6或pComb 3HSS)。将所述载体电穿孔入大肠杆
菌(E.coli),并且将所述大肠杆菌用辅助噬菌体感染。用于这些方法的噬菌体典型为丝状
噬菌体,包括fd和M13,并且VH和VL结构域通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。
表达结合RSV抗原(例如,RSV F蛋白)的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原选择或鉴
定,例如,利用标记的抗原或者结合或捕获至固体表面或珠的抗原。可以用来通过噬菌体
展示制备所述抗体的噬菌体展示方法实例包括例如Brinkman et al.(1995)J.Immunol.
Methods 182:41-50;Ames et al.(1995)J.Immunol.Methods 184:177-186;Kettleborough et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:952-958;Persic et al.(1997)Gene 187:9-18;Burton et al.(1994)Advances in Immunology 57:191-280;PCT公开号WO 90/02809、WO91/10737、WO
92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844;以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、
5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108所公开的方法;这些文献每个整体援引加入本文。
中表达,包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌,例如,如本文所述。还可以采用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术,利用本领域已知的方法,例如PCT公
开 第 WO92/22324 号;Mullinax et al.(1992)BioTechniques 12(6):864-869;Sawai et al.(1995)AJRI 34:26-34;和Better et al.(1988)Science 240:1041-1043所公开的方法。
如,可以将重链和轻链编码DNA中的任一或两者在免疫球蛋白多肽可变区的互补性决定区
(CDR)中诱变,并且随后筛选可取的免疫反应和中和能力。然后可以在本文所述的确定中和能力的一个或多个测定中筛选所得的抗体。
备,包括上文所述的噬菌体展示方法,利用来源于人免疫球蛋白序列或与人免疫球蛋白序
列同源的合成序列的抗体文库。参见美国专利第4,444,887号和第4,716,111号;以及PCT
公开号WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO96/33735和WO 91/10741;这些文献每个整体援引加入本文。
Sci USA 77:5429-5431;这类抗体可以如本文其他地方所述人源化用于人),表达人
免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见,例如,Kellerman andGreen(2000)Curr.Opin
Biotechnol.13:593-597),噬菌体展示(参见,例如,Mancini(2004)New Microbiol.27:
315-28),以及从诸如B细胞的成熟人免疫细胞分离(参见,例如,Banchereau and
Rousset(1992)Adv Immunol.52:125-262,Crotty and Ahmed(2004)Semin Immunol.16:
197-203,Carsetti(2004)Methods Mol Biol.271:25-35.,McHeyzer-Williams and
McHeyzer-Williams(2005)Annu Rev Immunol.23:487-513)。在本文所提供的示例性方法
中,本文所提供的人抗RSV抗体及其抗原结合片段鉴定和分离自人B细胞。
胞活化和增殖(参见,例如,Sugimoto et al.,(2004)Cancer Res.64:3361-3364.;Bishop and Busch(2002)Microbes Infect.4:853-857)。例如,已通过人B细胞的EBV永生化产生
抗体分泌细胞,例如来自可以暴露于所述抗原的患者或其他对象或者利用标记的抗原预先
选择的健康对象的外周血、淋巴结、脾、扁桃体或胸膜液(参见,例如,Casali et al.(1986)Science 234:476-9,Yamaguchi et al.(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84:2416-2420,Posner et al.(1991)J Immunol.146:4325-4332,Raff et al.(1988)J Exp Med.168:
905-917,Steenbakkers et al.(1993)Hum Antibod Hybrid.4:166-173,Steenbakkers et al.(1994)Mol Biol Rep.19:125-134,Evans et al.(1988)J Immunol 140:941-943, 和Wallis R et al.(1989)J Clin Invest84:214-219)。
2416-2420;Posner et al.(1991)J Immunol.146:4325-4332,Niedbala and Stott(1998)Hybridoma17:299-304;Li et al.(2006)Proc Natl Aacd Sci USA 103:3557-62)。提高EBV永生化的其他技术包括例如用致癌病毒永生化,用癌基因转化,小-电融合,以及在单一过程中小鼠-人异源融合(参见,例如,美国专利第4,997,764号;Steenbakkers et al.(1993)
Hum Antibod Hybrid.4:166-173;Dessain et al.(2004)J Immunol Methods.291:109-22)。
人单克隆抗体可以分离自B细胞,并且如本领域所述通过在细胞培养中结合各种操作来
分离,所述B细胞已在抗原存在或不存在的情况下活化和永生化(参见例如,Borrebaeck
C et al.(1988)Proc Natl Aacd Sci USA 85:3995-3999,Davenport et al.(1992)FEMS Microbiol Immunol.4:335-343,Laroche-Traineau et al.(1994)Hum Antib Hybrid.5:
165-177,Morgenthaler et al.(1996)J.Clin Endocrinology.81:3155-3161,Niedbala and Kurpisz(1993)Immunol Lett.35:93-100,Mulder et al.(1993)Hum Immunol.36:186-192,Hur et al.(2005)Cell Prolif.38:35-45,Traggiai et al.(2004)Nat Med 10:871-875,Tsuchiyama et al.(1997)Hum Antibodies 8:43-47;以及PCT公开 号WO 91109115、WO
041076677、WO88101642、WO 90102795、WO 96140252和WO 02146233)。
体(例如幼稚、免疫接种的、或多或少最近感染和血清反应阳性对象)以及B细胞停留并
发挥它们的活性的不同组织(例如血液、扁桃体、脾、淋巴结)(Viau and Zouali(2005)Clin Immunol.114:17-26)。在本文所提供的示例性方法中,本文所提供的抗RSV抗体可以分离
自含有B细胞的外周血单核细胞(PBMC)的样品,分离自人供体和/或已经或者具有已暴露
于RSV的高概率的健康人供体,例如医护人员。
态状态的基础上进行抗体分泌细胞的特异性选择。特别地,从人样品纯化抗体分泌细胞
的各种技术对于正选择或负选择使用不同方法和条件。这些细胞通过物理分离表达细胞
表面标记的细胞更容易和有效选择,所述细胞表面标记是表达和分泌抗体的细胞特异性
的(例如人B细胞)。具体方案是已知的,并且可以在文献中找到(参见,例如,Callard
and Kotowicz″Human B-cell responses to cytokines″in Cytokine Cell Biology:A practical Approach.Balkwill F.(ed.)Oxford University Press,2000,17-31)。
利用荧光激活细胞分选术(FACS)检测的荧光染料标记。例如,在EBV永生化之前,人B细
胞已在它们对支持物(例如微珠)结合的CD19、CD27和/或CD22微珠的亲和性基础上选
择,或者选择缺少对某些同种型特异性抗体的结合亲和性(参见,例如,Li et al.(1995)
Biochem Biophys Res Commun 207:985-993,Bernasconi et al.(2003)Blood101:4500-4504和Traggiai et al.(2004)Nat Med 10:871-875)。用于纯化的细胞标记的选择可以影响永生化过程的效率,例如,由于选择过程所触发的细胞内信号以及可以改变细胞生长和生存
力的细胞内信号。例如,控制抗原识别和B细胞活化相关的信号转导通路的B-细胞限制跨
膜蛋白CD22是初始B细胞选择的示例性分子。因为CD22阳性群体包含表达具有不同同种
型和特异性的抗体的细胞,其他细胞表面标记也可以用于选择细胞,刺激阶段之前或之后。
的标记(Borst J et al.(2005)Curr Opin Immunol.17:275-281.)。诸如CD5、CD24、CD25、CD86、CD38、CD45、CD70或CD69的其他标记也可以用来减少或富集期望的细胞群体。因此,根据因素,例如供体暴露于抗原(例如RSV抗原)的历史和抗体效价,可以选择总CD22富
集的B细胞或者进一步富集的B细胞亚群,如CD27阳性B细胞。
体激动剂,如CpG寡核苷酸(Bernasconi et al.(2003)Blood 101:4500-4504,Bernasconi et al.(2002)Science 298:2199-2202,Bourke et al.(2003)Blood 102:956-63);例如,CpG核苷酸,例如,CpG2006、CPG2395和CpG2395,可获得自Cell Sciences,Canton,MA)和诸如细胞因子的免疫调节分子(例如,已知具有免疫刺激活性的白介素,例如,IL-6、IL-10和
IL-13(参见Callard and Kotowicz″Human B-cell responses to cytokines″in Cytokine Cell Biology:A practical Approach.Balkwill F(ed.)Oxford University Press,2000,
17-31)和TNF受体家族的细胞膜受体的激动剂,特别是激活B细胞中的NF-κB通路和增
殖的激动剂,例如但不限于APRIL、BAFF、CD 40配体(CD40L)(参见,例如,Schneider(2005)Curr Opin Immunol.17:282-289,He et al.(2004)J Immunol.172:3268-79,Craxton et al.(2003)Blood101:4464-4471,和Tangye et al.(2003)J Immunol.170:261-269)。利用EBV永生化与一种或多种多克隆激活剂联合或顺序刺激B细胞的示例性方法是本领域已知
的(参见,例如,Traggiai et al.(2004)Nat Med 10:871-875,Tsuchiyama et al.(1997)Hum Antibodies 8:43-47,Imadome et al.(2003)Proc Natl AcadSci USA 100:7836-7840,以及PCT公开号WO 2007/068758、WO04/76677、WO 91/09115和WO 94/24164)。刺激剂的组合可
以在永生化阶段之前同时或顺序加入细胞培养基(例如在初始细胞选择之后马上加入第
一刺激剂并且在数小时或数天后加入第二刺激剂)。所述刺激剂可以从稀释的储备溶液直
接加入细胞培养基,或者在适当配制之后,例如,利用可以提高它们的吸收和免疫刺激活性的脂质体或其他化合物(Gursel et al.(2001)J Immunol.167:3324-3328)。所述刺激剂还可以连接至固体基质(微珠或直接在细胞培养板上),这可以允许有效去除所述试剂。可以
将细胞用新鲜培养基洗涤一次或多次,并且任选维持在普通细胞培养基中(例如,1-6天)
以便进一步稀释和消除所述刺激剂的任何剩余影响。所述刺激剂还可以通过将特定化合物
加入细胞培养物来抑制。
细胞可以通过应用正(允许分离特定细胞)或负(允许消除不需要的细胞)选择的方法来
进行。例如,刺激的IgG阳性细胞的群体可以正选择(通过FACS或磁性细胞分离器),或
者通过从细胞群体减少表达IgM的细胞,并且因此富集表达IgG的细胞。利用荧光激活或
磁性细胞分离器的抗体分泌细胞的分离技术在文献中已知(参见,例如,Li et al.(1995)
Biochem Biophys Res Commun 207:985-93,Traggiai et al.(2004)Nat Med10:871-875)。根据抗体分泌细胞的来源和它们的最终用途,还可以进行减少(或富集)其他同种型表达细
胞,例如IgD或IgA表达细胞。如果期望这样精细的选择,相似的方法可以用来基于特定亚
类分离细胞(例如,选择表达IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的人B细胞)。
毒的实例是包括在疱疹病毒的γ类之内的病毒。这个病毒家族的成员以物种特异性方式
感染淋巴细胞,并且与淋巴组织增生性疾病和几种恶性肿瘤的发展有关(Nicholas(2000)
J.Mol Pathol.53:222-237和Rickinson(2001)Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.356:
595-604)。在所提供的方法中用作永生化物质的示例性病毒包括EBV(埃巴病毒,也称为疱
疹病毒4)和HHV-8(人疱疹病毒8,也称为KSHV,卡波西肉瘤相关性疱疹病毒),其可以感
染和永生化人淋巴细胞。用于所述方法的其他示例性病毒包括但不限于MHV-68(小鼠疱疹
病毒68)、HVS(疱疹病毒Samiri)、RRV(恒河猴疱疹病毒)、LCV(灵长类淋巴滤泡病毒)、
EHV-2(马疱疹病毒2)、HVA(疱疹病毒Ateles)和AHV-1(狷羚疱疹病毒1),它们是具有一
些保守的常见遗传特征并且在不同哺乳动物宿主细胞中具有相似致病作用的其他致癌的
嗜淋巴细胞疱疹病毒。
J.17:1700-1709)。在所提供的方法中可以将包含病毒基因的相似载体转导入细胞。制备
这类构建体的方法是本领域公知的,并且包括例如使用反转录病毒系统或病毒样颗粒和包
装细胞系,这又提供形成这类颗粒的所有必需因素。
4-约24小时的时间。在一特定实例中,将细胞用EBV永生化约16小时的时间。
控B细胞应答(Fearon and Carroll(2000)Ann Rev Immun.18:393-422)。用EBV转化细胞
的能力可以通过添加B细胞刺激剂来增强,但是条件必须确保CD21维持在细胞表面上,允
许高效率EBV永生化。
长和增殖的突变EL4胸腺瘤细胞系。其他示例性饲养细胞包括如本文其他地方所述的辐照
的去除B-细胞的PMBC饲养细胞。诸如用来刺激B细胞群体的生长促进剂也可以用来在永
生化之后维持永生化的B细胞群体。
组技术从分离自大量细胞群体的DNA构建。在一些实例中,如本文所述,可以将永生化的细胞进一步培养并划分为抗体分泌细胞的池。例如,可以将细胞池在饲养细胞层上培养。
测量结合特异性的示例性方法如本文其他地方所述,并且是本领域已知的。
核宿主细胞中)并重新筛选,鉴定表达期望的抗体或其抗原结合片段的单个克隆。
方法分离编码所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的DNA。可以表达分离自细胞池的DNA(例
如,在原核或真核宿主细胞中)以证实与RSV抗原的结合。
或其抗原结合部分的核苷酸序列并克隆入表达VH恒定区(例如,人γ1恒定区)、VL恒定区
(例如,人κ或λ恒定区)的载体。还可以将VH和VL结构域克隆入表达所选恒定区的载
体。然后利用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染入细胞系
以产生表达全长抗体(例如,IgG)的稳定或瞬时细胞系。
于接受、保持、再生和扩增核酸(例如,编码例如提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的抗
体的核酸),以及表达所述核酸编码的多肽。通常,宿主细胞和载体的选择取决于是否期望扩增、多肽表达和/或在诸如噬菌体的遗传包装上展示。转化宿主细胞的方法是公知的。任何已知的转化方法(连丽如,转化、转染、感染、电穿孔和超声穿孔)可以用于用核酸转化宿主细胞。制备抗体的方法是本领域公知的,所述抗体例如单克隆抗体和抗体片段,例如但不限于Fab片段和单链抗体。
来制备,包括本领域已知和教导的那些,例如Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988);Hammerling,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas5630681(Elsevier N.Y.1981)。
在适合于制备所需量和形式的蛋白的任何生物体中表达,例如用于分析、施用和治疗。表达宿主包括原核和真核生物体,例如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞,包括人细胞系和转基因动物(例如,兔、小鼠、大鼠和家畜,例如但不限于山羊、绵羊和牛),包括血清、乳和卵中的产生。表达宿主可以在其蛋白产生水平以及存在于表达的蛋白上的翻译后
修饰类型有所不同。表达宿主的选择可以基于这些和其他因素,例如调控和安全考虑、生产成本以及纯化的需求和方法。
列的VH CDR3。
Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.and Ausubel et al.,eds.(1998)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY)。在一些实例中,例如但不限于重组DNA技术、定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)的方法可以用于产生修饰的抗体或其抗原结合片段,其具有不同氨
基酸序列,例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
见,例如Chothia et al.(1998)J.Mol.Biol.278:457-479的示例性框架区)。通常,通过框架区和CDR的组合产生的多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段,其保留亲本抗RSV抗体或
其抗原结合片段的抗原-结合特异性。可以对多核苷酸进行改变以改进编码的抗体或其抗
原结合片段的一种或多种特性,并且在本领域的技术内。在一些实例中,可以进行多核苷酸的一个或多个修饰以产生框架区中的氨基酸取代,其例如改进抗体或其抗原结合片段对其
抗原的结合。此外,这样的方法可以用于产生参与链间二硫键的一个或多个可变区半胱氨
酸残基的氨基酸取代或缺失以产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。
达系统的选择影响。这样的选择在本领域技术人员的水平之内。通常,表达载体可以包含
转录启动子和任选存在的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表
达载体通常具有可选择标记,其允许选择和保持转化的细胞。在一些情况下,复制起点可以用于扩增细胞中载体的拷贝数。
胞和昆虫细胞的其他合适启动子为本领域公知,并且示例于下文。用于指导异源核苷酸
表达的启动子的选择取决于具体应用,并且在本领域技术人员的水平之内。可用的启动
子包括但不限于真核表达载体,其包含SV40早期启动子(Bernoist and Chambon,(1981)
Nature290:304-310);启动子,其包含于劳氏肉瘤病毒的3’长末端重复序列(Yamamoto
et al.(1980)Cell 22:787-797);疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441-1445);金属硫蛋白的调控序列(Brinster et al.,(1982)Nature
296:39-42);原核表达载体,如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5543)或tac启动子(DeBoer et al.,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:
21-25);还参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:in Scientific American
242:79-94(1980));植物表达载体,其包含胭脂氨酸合成酶启动子(Herrera-Estrella
et al.,(1984)Nature303:209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner et
al.,(1981)Nucleic Acids Res.9:2871)和光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子
(Herrera-Estrella et al.,(1984)Nature 310:115-120);来自酵母和其他真菌的启动子元件,例如Gal4启动子、乙醇降解酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子以及表现出组织特异性和用于转基因动物的以下动物转录控制区:弹性蛋白酶I基因控制区,
其在胰腺腺泡细胞中是活跃的(Swiftet al.,(1984)Cell 38:639-646;Ornitz et al.,(1986)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409;MacDonald,(1987)Hepatology
7:425-515);胰岛素基因控制区,其在胰β细胞中是活跃的(Hanahan et al.,(1985)
Nature315:115-122);免疫球蛋白基因控制区,其在淋巴样细胞中是活跃的(Grosschedl et al.,(1984)Cell 38:647-658;Adams et al.,(1985)Nature318:533-538;Alexander et al.,(1987)Mol.Cell Biol.7:1436-1444);小鼠乳腺肿瘤病毒控制区,其在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中是活跃的(Leder et al.,(1986)Cell 45:485-495);白蛋白基因控制区,其在肝中是活跃的(Pinckert et al.,(1987)Genes and Devel.1:268-276);甲胎蛋白基因控制区,其在肝中是活跃的(Krumlauf et al.,(1985)Mol.Cell.Biol.5:1639-1648);
Hammer et al.,(1987)Science 235:53-58);α-1抗胰蛋白酶基因控制区,其在肝中是活跃的(Kelsey et al.,(1987)Genes andDevel.1:161-171);β珠蛋白基因控制区,其在髓样细胞中是活跃的(Magram et al.,(1985)Nature 315:338-340);Kollias et al.,(1986)Cell 46:89-94);髓鞘碱性蛋白基因控制区,其在脑的少突胶质细胞中是活跃的(Readhead et al.,(1987)Cell 48:703-712);肌球蛋白轻链-2基因控制区,其在骨骼肌中是活跃的(Shani(1985)Nature 314:283-286);以及促性腺释放激素基因控制区,其在下丘脑的促性腺激素细胞中是活跃的(Mason et al.,(1986)Science 234:1372-1378)。
核酸序列的启动子以及转录的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和转录终止所需的信号。
所述盒的额外元件包括增强子。此外,所述盒通常包含结构基因下游的转录终止区以提供
有效的终止。终止区可以获得自与启动子序列相同的基因,或者可以获得自不同的基因。
和合成技术以及体内重组(遗传重组)。插入克隆载体可以,例如通过将DNA片段连接入具
有互补粘性末端的克隆载体来完成。如果克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性
位点,则可以酶促修饰DNA分子的末端。或者,可以通过将核苷酸序列(接头)连接至DNA
末端来产生期望的任何位点;这些连接的接头可以包含特定的化学合成的核酸,其编码限
制性内切酶识别序列。
早期基因内含子A;以及多腺苷酸化(polyA)信号,如晚期SV40 polyA信号。质粒可以是多
顺反子的以允许表达抗体的全长重链和轻链、单链Fv片段或其他免疫球蛋白片段。
任何细胞类型可以被改造以表达异源DNA并具有合适的分泌途径。表达宿主包括原核和真
核生物体,例如细菌细胞(如大肠杆菌)、酵母细胞、真菌细胞、古细菌、植物细胞、昆虫细胞以及包括人细胞在内的动物细胞。表达宿主可以在其蛋白产生水平以及存在于表达的蛋白
上的翻译后修饰类型有所不同。此外,表达宿主的选择通常涉及所用的载体以及转录和翻
译元件的选择。例如,表达宿主的选择通常,但不总是取决于所用的前体序列的选择。例如,许多异源信号序列仅可以在相同物种的宿主细胞中表达(即,昆虫细胞信号序列在昆虫细
胞中最优地表达)。相比之下,其他信号序列可以用于异源宿主,例如人血清白蛋白(hHSA)信号序列,其在酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞中很好地发挥作用;以及组织纤溶酶原激活物前/原序列,其证实为在昆虫和哺乳动物细胞中发挥功能(Tan et al.,(2002)Protein
Eng.15:337)。表达宿主的选择可以基于这些和其他因素,例如调控和安全考虑、生产成本以及纯化的需求和方法。因此,载体系统必需与所用的宿主细胞相容。
(Drosophila)细胞和鳞翅目(lepidopteran)细胞;植物和植物细胞,如烟草、玉米、稻、藻类和柠檬(lemna)。用于表达的真核细胞还包括哺乳动物细胞系,如中国仓鼠卵巢(CHO)细
胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主还包括转基因动物中的产生,例如包括血清、乳和卵中的产生。
al.(1989)J.Biol.Chem.,264:17619-17622;Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.),1990)。真核和原核细胞的转化根据标准技术进行(参见,例如Morrison(1977)J.Bact.132:349-351;Clark-Curtiss and Curtiss(1983)Methods in Enzymology,101,347-362)。例如,可以使用任何公知的将外源核苷酸序列
引入宿主细胞的方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质融合、电穿孔、轰击(biolistic)、脂质体、微注射、等离子(plasma)载体、病毒载体(如杆状病毒、痘病毒、腺病毒和其他病毒)以及任何其他将克隆的基因组DNA、cDNA、质粒DNA、粘粒DNA、合成DNA或
其他外源遗传物质引入宿主细胞的公知方法。
提供的变体多肽。大肠杆菌的转化是本领域技术人员公知的简单且快速的方法。大肠杆菌
的表达载体可以包含诱导型启动子,例如用于诱导高水平的蛋白表达和用于对宿主细胞表
现出一些毒性的蛋白。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调控的λPL启动子。
β-巯基乙醇的还原剂以及诸如胍-HCl和尿素的变性剂可以用来重溶解蛋白,随后该可溶
性蛋白重折叠。可选的方法是在细菌的周质间隙中表达蛋白,细菌的周质间隙提供氧化环
境以及伴侣蛋白样蛋白(chaperonin-like)和二硫键异构酶,并且可以导致可溶性蛋白的
产生。例如,为了蛋白的噬菌体展示,可以将蛋白输出至周质,从而它们可以装配入噬菌体。
通常,将前导序列融合至待表达的蛋白,其将蛋白引导至周质。然后前导序列被周质中的信号肽酶去除。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酸裂合酶基因的pelB前导序列以
及来源于碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况下,周质表达允许所表达的蛋白渗漏至
培养基。蛋白的分泌允许从培养上清液快速而简单的纯化。不分泌的蛋白可以通过渗透裂
解从周质获得。与细胞质表达相似,在一些情况下蛋白可以变为不溶的,并且变性剂和还原剂可以用来促进溶解和重折叠。诱导和生长的温度也可以影响表达水平和溶解性,通常使
用25℃-37℃的温度。通常,细菌产生非糖基化的蛋白。因此,如果蛋白的功能需要糖基化,则可以在从宿主细胞纯化后体外加入糖基化。
(Kluyveromyces lactis)和毕赤酵母(Pichia pastoris)是众所周知的酵母表达宿主,可
以用来表达本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。酵母可以用游离型复制载体转化
或者通过同源重组进行稳定染色体整合。通常,诱导型启动子用于调控基因表达。这类启
动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子,如CUP1、AOX1,或者其他毕赤
酵母(Pichia)或其他酵母启动子。表达载体常包含用于选择和维持转化DNA的选择标记,
如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。在酵母中表达的蛋白通常是可溶的。与诸如Bip和蛋白二硫
键异构酶的伴侣蛋白共表达可以提高表达水平和溶解性。此外,在酵母中表达的蛋白可以
被引导分泌,利用诸如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号的分泌信号肽融合以
及与诸如Aga2p交配粘附受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的酵母细胞表面蛋白融
合。可以工程化诸如Kex-2蛋白酶的蛋白酶切割位点以在表达多肽离开分泌途径时从表达
多肽去除融合序列。酵母还能够在Asn-X-Ser/Thr基序处糖基化。
翻译后修饰。杆状病毒具有有限的宿主范围,这提高了安全性并且减少了真核表达的监
管问题。典型的表达载体为了高水平表达使用启动子,如杆状病毒的多角体蛋白启动子。
常用的杆状病毒系统包括杆状病毒和昆虫细胞系,杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa
californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV),
昆虫细胞系如来源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、美洲粘虫(Pseudaletia
unipuncta)(A7S)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。为了高水平表达,将待表达的分子的核苷酸序列直接融合至病毒多角体蛋白起始密码子的下游。哺乳动物分泌信号在昆
虫细胞中被准确加工并且可以用来将表达蛋白分泌入培养基。此外,细胞系美洲粘虫(A7S)和黑脉金斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白。
(Drosophila)金属硫蛋白启动子可以用来在镉或铜的重金属诱导存在的情况下诱导高水
平表达。表达载体通常通过使用诸如新霉素和潮霉素的选择标记来保持。
转移至哺乳动物细胞,所述直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过诸如电
穿孔和显微注射的物理方法。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包含mRNA帽位点、TATA
框、翻译起始序列(Kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。这类载体常包含用于高水平表达
的转录启动子-增强子,例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤
病毒(RSV)的长末端重复序列。这些启动子-增强子在许多细胞类型中活跃。组织和细胞
类型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自诸如
弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳癌病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素基因调控的基因的启动子/
增强子区。可选择标记可以用来选择和保持具有表达构建体的细胞。可选择标记基因的实
例包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。与诸如TCR-ζ和FcεRI-γ的细胞表面信号
分子融合可以引导蛋白在细胞表面上以活性状态表达。
构建体转移至植物。表达载体可以包含启动子和增强子序列、转录终止元件以及翻译控制
元件。在诸如拟南芥(Arabidopsis)和烟草的双子叶植物宿主以及诸如玉米和水稻的双子
叶植物宿主之间通常划分表达载体和转化技术。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜
花叶病毒启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及泛素和UBQ3启动
子。诸如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶的可选择标记常用来促进转化细
胞的选择和维持。转化的植物细胞可以在培养中保持为细胞、团聚体(愈伤组织)或再生
为整个植物。转基因植物细胞还可以包括工程化以产生蛋白酶或修饰的蛋白酶的藻类(参
见例如,Mayfieldet al.(2003)Proc Natl AcadSci USA 100:438-442)。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式,所以这可以影响这些宿主中产生的蛋白的选择。
养基纯化。对于细胞内表达,可以将细胞裂解并从提取物纯化蛋白。在一实例中,通过离心和细胞裂解(例如通过在干冰/乙醇浴中反复冻融)然后离心并保留含有多肽的上清液来
从宿主细胞分离多肽。当诸如转基因植物和动物的转基因有机体用于表达时,组织或器官
可以用作起始原料以产生裂解的细胞提取物。此外,转基因动物产品可以包括乳汁或卵中
的多肽产品,可以将其收集,并且如有必要可以利用本领域的标准方法提取和进一步纯化
蛋白。
SDS-PAGE、大小分级和大小排阻层析、硫酸铵沉淀以及诸如阴离子交换的离子交换层析。亲和纯化技术也可以用来提高制品的效率和纯度。例如,抗体、受体以及结合蛋白酶的其他分子可以用于亲和纯化。还可以将表达构建体工程化以将诸如myc表位、GST融合或His6的
亲和标签加入蛋白,并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和纯化。可以通过本
领域已知的任何方法评价纯度,包括凝胶电泳以及染色和分光光度技术。
在Sephacryl S-200HiPrep 16x60大小排阻柱(Amersham from GE Healthcare Life
Sciences,Piscataway,NJ)上分离)来分析分离的多肽。还可以在结合测定中分析分离的
多肽,通常为利用结合诸如板(例如基于ELISA的结合测定)或珠的固体支持物的结合配
对物的结合测定,以测定它们结合期望的结合配对物的能力。结合测定如下文的章节所述,其用来评价沉淀的噬菌体展示的多肽的结合,还可以用来评价直接分离自宿主细胞裂解物
的多肽。例如,可以进行结合测定以测定抗体多肽是否结合一种或多种抗原,例如,通过将抗原包被在固体支持物上,如测定板的孔,并且将分离的多肽在所述固体支持物上温育,然后洗涤并用第二试剂检测,例如酶标记的抗体和底物。
结合人呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白的能力。这样的测定可以例如在以下物质中进
行:在溶液中(如Houghten(1992)Bio/Techniques 13:412-421)、在珠上(Lam(1991)
Nature 354:82-84)、在芯片上(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、在细菌上(U.S.Pat.No.5,223,409)、在孢子上(U.S.Pat.Nos.5,571,698;5,403,484;和5,223,409)、在质粒
上(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)或在噬菌体上(Scott
and Smith(1990)Science 249:386-390;Devlin(1990)Science 249:404-406;Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382;和 Felici(1991)J.Mol.Biol.222:
301-310)。可以测定已经鉴定为免疫特异性地结合RSV抗原或其片段的抗体或其抗原结合
片段对RSV抗原的特性和亲和力。可以确定结合特异性或表位,例如利用抗单克隆抗体突
变体(MARM),通过与其他抗RSV抗体和/或病毒中和测定的竞争测定。此外,利用本文提供
的抗RSV抗体或其抗原结合片段,可以使用体外测定和体内动物模型来测量通过抗RSV抗
体或其抗原结合片段的接触或施用进行的RSV中和的水平。
性。示例性测定提供于下文的实施例5和8,以及描述于下文。结合测定可以在溶液、悬浮
液或在固体支持物上进行。例如,可以将靶抗原固定于固体支持物(如碳或塑料表面、组织培养皿或芯片),并与抗体或其抗原结合片段接触。可以洗去未结合的抗体或靶蛋白,并且可以检测结合的复合物。可以在降低非特异性结合的条件下进行结合测定,例如利用高离
子强度缓冲液(如0.3-0.4M NaCl)与非离子去污剂(如0.1%Triton X-100或Tween 20)
和/或封闭蛋白(如牛血清白蛋白或明胶)。这样的测定中还可以包括阴性对照作为背景
结合的量度。结合测定可以利用Scatchard分析(Munson et al.,(1980)Anal.Biochem.,
107:220)、表面等离子共振、等温量热法或本领域技术人员已知的其他方法来进行。
ELISA(酶联免疫吸附测定)、Meso Scale Discovery(MSD,Gaithersburg,Maryland)、″夹心″免疫测定、免疫沉淀测定、ELISPOT、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定。这样的测定是本领域常规和公知的(参见,例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York,其整体援引加入本文)。其他测定形式包括脂质体免疫测定(LIA),其使用设计为结合特定分子(如抗体)的脂质体,并释放包封
的试剂或标记。然后根据标准技术检测释放的化学物质(参见Monroe et al.,(1986)Amer.Clin.Prod.Rev.5:34-41)。下文简述非限制性的示例性免疫测定。
aprotinin,sodium vanadate);向细胞裂解物加入所关注的抗体或其抗原结合片段;在
40℃下温育一定时间(如1-4小时);向细胞裂解物加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠;
在40℃下温育约1小时或更长时间;将珠用裂解缓冲液洗涤并再悬浮于SDS/样品缓冲液
中。可以通过例如蛋白印迹分析评价所关注的抗体或其抗原结合片段免疫沉淀特定抗原的
能力。本领域技术人员应当理解,可以改变参数以增加抗体或其抗原结合片段对抗原的结
合并降低背景(例如用琼脂糖珠预清理细胞裂解物)。关于免疫沉淀方法的进一步讨论可
见,例如Ausubel et al.,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.16.1。
酸纤维素、PVDF或尼龙的膜;将膜在封闭液(如包含3%BSA的PBS或脱脂牛奶)中封闭;
将膜在洗涤缓冲液(如PBS-Tween20)中洗涤;将膜用在封闭缓冲液中稀释的一抗或其抗
原结合片段(即,所关注的抗体或其抗原结合片段)封闭;将膜在洗涤缓冲液中洗涤;将膜
用在封闭缓冲液中稀释的缀合至酶促底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性
32 125
分子(如 P或 I)的二抗(其识别一抗,如抗人抗体)封闭;将膜在洗涤缓冲液中洗涤;
以及检测抗原的存在。本领域技术人员应当了解,可以改变参数以增加检测的信号并降低
背景噪音。关于蛋白印迹方法的进一步讨论可见,例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.8.1。
结合片段加入孔并温育一段时间,以及检测所述抗原的存在。在ELISA中,所关注的抗体
或其抗原结合片段不必缀合至可检测的化合物;作为替代,可以将缀合至可检测的化合物
的二抗(其识别所关注的抗体)加入孔。而且,代替用所述抗原包被孔,可以将所述抗体
包被至孔。在这种情况下,将所关注的抗原加入包被的孔之后可以加入缀合至可检测的化
合物的二抗。本领域技术人员知道可以修改以增加检测的信号的参数以及本领域已知的
ELISA的其他变化。关于ELISA的进一步讨论参见,例如Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 11.2.1。实施例5和8示例抗RSV抗体结合RSV F蛋白的结合测定。
3 125
包括在增加量的未标记的抗原存在的情况下将标记的抗原(例如,H或 I)与所关注的
抗体或其抗原结合片段温育,并且检测结合标记的抗原的抗体或其抗原结合片段。可以通
过Scatchard图分析从该数据确定本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段对RSV抗
原的亲和性以及结合解离速率。还可以利用放射免疫测定来测定与二抗的竞争。在这种情
3
况下,在增加量的未标记的二抗存在的情况下将RSV抗原与缀合至标记的化合物(例如,H
125
或 I)的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段温育。在一些实例中,表面等离子共
振(例如,BiaCore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare Life Sciences;
Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)动力学分析可以用来测定抗体或其抗原结
合片段与RSV抗原的结合速率和解离速率。表面等离子共振动力学分析包括分析RSV抗原
从表面上具有固定的抗体或其片段的芯片结合和解离。
在存在或不存在抗体或其抗原结合片段的情况下接触,并且所述抗体或其片段抑制RSV的
结合能力可以通过例如流式细胞术或闪烁测定来测量。RSV(例如RSV抗原,如F糖蛋白或
32 35 125
G糖蛋白)或者抗体或其抗体片段可以用可检测的化合物如放射性标记(如 P、S和 I)
或荧光标记(如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺)标记以允许检测RSV与其宿主细胞受体之间的相互作用。
体片段抑制RSV或RSV抗原结合其宿主细胞受体的能力。在一些实例中,将抗体或抗原结合
片段固定于固体支持物上,并且将RSV或RSV抗原用可检测的化合物标记。在一些实例中,
将RSV或RSV抗原固定于固体支持物上,并且将抗体或其片段用可检测的化合物标记。RSV
或RSV抗原可以是部分或完全纯化的(如部分或完全不含其他多肽)或者是细胞裂解物的
一部分。在一些实例中,RSV抗原可以是融合蛋白,其包含RSV抗原和诸如谷胱甘肽-S-转
移酶的结构域。在一些实例中,可以将RSV抗原利用本领域技术人员公知的技术生物素化
(如生物素化试剂盒,Pierce Chemicals;Rockford,Ill.)。
单克隆抗体突变体(MARM)的病毒中和测定。表位可以在分离的蛋白(即分离的F蛋白)
中,或者在病毒中的蛋白中。两种抗体结合相同表位的能力可以通过本领域已知的测定来
确定,例如,表面等离子共振测定和抗体竞争测定。通常,免疫特异性地结合相同表位的抗体可以竞争结合所述表位,这可以例如利用本领域已知的技术通过体外结合竞争测定(例
如竞争ELISA)来测量。通常,免疫特异性地与第二抗体结合相同的表位的第一抗体可以约
或30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%竞争结合所述表位,其中百分比竞争是测量的所述第二抗体置换所述第一抗体结合所述表
位的能力。在示例性竞争测定中,在预定的有限稀释的标记的抗体(例如,50-70%包含浓
度)和连续稀释的未标记的竞争抗体存在的情况下温育所述抗原。通过在所述竞争抗体存
在的情况下测量所述标记的抗体结合所述抗原的结合中的任何减少来测定竞争。这类测定
的变化是本领域已知的,包括各种标记技术和检测方法,包括例如辐射、荧光、酶促和比色检测。例如,如下文实施例10所示例,抗体IgG 58c5和莫他珠单抗不竞争结合RSV F蛋白,因此表明抗体IgG 58c5与莫他珠单抗结合不同的表位。
道合胞病毒(RSV),即MARM是RSV逃逸突变体。通过在单克隆抗体存在的情况下培养野生
型RSV来产生MARM,在所述抗体存在的情况下经过连续数轮的病毒复制,从而在连续的每
轮病毒复制之后,在增加浓度的抗体存在的情况下观察到致细胞病变效应(CPE),直至不被所述抗体中和的突变病毒结果。如果第一抗体可以中和针对第二抗体产生的MARM,可以得
出结论所述抗体特异性结合不同表位或与不同表位相互作用。例如,当第一抗RSV抗体中
和野生型RSV但不中和特定突变的RSV(即,MARM)时,中和所述野生型RSV但不中和所述
特定突变的RSV的第二抗体一般与所述第一抗体结合相同的RSV上的表位。当第一抗RSV
抗体中和野生型RSV但不中和特定突变的RSV时,中和所述野生型RSV和所述特定突变的
RSV的第二抗体一般不与所述第一抗体结合相同的RSV上的表位。
MARM 1129(参见,Johnson et al.(1997)J.Infect.Diseases 176:1215-1224和美国专利第
5,824,307号)、针对Fab 19产生的MARM 19(参见Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.
Sci.USA89:10164-10168)以及针对MAb 151产生的MARM 151(参见,Mufson et al.,(1985)J.Gen.Virol,66:2111-2124)。因此,IgG 58c5与抗体Fab 19、MAb 151和MAb 1129结合不同的F蛋白上的表位。
1642)。氨基酸K272处的突变与已知破坏莫他珠单抗的亲本抗体的结合的突变一致(参
见,Zhao et al.,(2004)J.Infectious Disease 190:1941-1946)。10轮选择后产生的IgG
58c5MARM与野生型RSV F蛋白相比含有3个氨基酸突变(N63K、M115K和E295G,SEQID
NO:1643)。IgG 58c5MARM中影响逃逸的突变以前未被鉴定为免疫特异性地结合RSV F蛋
白的各种单克隆抗体的抗原位点(参见,例如,Beeler et al.(1989)J.Virology 63(7):
2841-2950,Crowe et al.(1998)Vorology252:373-375;Zhao et al.,(2004)J.Infectious Disease 190:1941-1946;Liu et al.,(2007)VirologyJ ournal 4:71)。此外,如下文实施例11所示,IgG 58c5中和莫他珠单抗MARM,并且莫他珠单抗中和IgG 58c5MARM。因此,IgG
58c5与莫他珠单抗结合不同的RSV F蛋白的表位。
合胞体形成抑制的测定。这类测定可以用来评价例如病毒吸附、病毒进入和病毒的细胞
至细胞传播的抑制(参见,例如Burioni et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:
355-359;Sanna et al.(2000)Virology 270:386-3961;and De Logu et al.,(1998)J Clin Microbiol36:3198-3204)。本领域技术人员可以鉴定能够测量病毒中和的任何测定。
以用于空斑减少测定的示例性靶细胞系包括但不限于非洲绿猴肾细胞、MRC-5细胞、RC-37
细胞、BHK-21/C13细胞和HEp-2细胞。本领域技术人员可以鉴定用于空斑测定的适当靶细
胞系。用于空斑测定的适当细胞系的选择可以取决于已知因素,例如,细胞感染性以及病毒在靶细胞中增殖和裂解靶细胞的能力。实施例6和9示例体外中和测定。
温育。然后将靶细胞用抗体/病毒混合物感染,并且在预定的感染期之后进行空斑测定。本领域技术人员可以基于本领域已知的实例确定所需的温育时间。靶细胞感染之后产生的病
毒空斑数量的减少表明抗体或其抗原结合片段防止病毒结合靶细胞的能力,其不依赖于抗
体或其抗原结合片段吸附至靶细胞和/或抗体或其抗原结合片段内化。
例确定所需的温育时间。病毒空斑大小(即直径)的减小表明抗体或其抗原结合片段能够
防止病毒的细胞至细胞传播。
病毒中和测定中,将抗体或其抗原结合片段和靶细胞预温育预定的一段时间以允许抗体或
其抗原结合片段结合靶细胞。预温育期之后,去除未结合的抗体并用病毒感染靶细胞。这
个测定中空斑数量的减少表明抗体或其抗原结合片段防止病毒感染的能力,其依赖于吸附
至靶细胞和/或抗体或其抗原结合片段的内化。这个测定还可以用于通过改变抗体或抗原
结合片段浓度和预温育时间来测量中和动力学。
的适当的融合病毒株。
文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段抑制或下调RSV多肽表达的能力。本领域技术人
员已知的技术可以用来测量RSV多肽的表达,包括但不限于蛋白印迹分析、RNA印迹分析和
RT-PCR。
段的任何毒性。各种测定(例如采用体内动物模型的测定)对于本领域技术人员是可用
的,其用于评价抗RSV抗体抑制或治疗RSV病毒感染的能力以及用于评价任何毒性。可
以利用包括病毒感染动物模型在内的病原感染动物模型评价抗RSV抗体的疗效。这类动
物模型是本领域已知的,并且包括但不限于RSV感染的动物模型,例如但不限于棉鼠、近
交系小鼠、小牛、雪貂、仓鼠、豚鼠、黑猩猩、枭猴、猕猴、非洲绿猴、卷尾猴、松鼠猴、帽猴、狒狒(参见,例如,Prince et al.(1978)Am.J.Pathol.93:771-791;Prince et al.(1979)Infect.Immunol.26:764-766;Byrd and Prince(1997)Clinical Infectious Diseases 25:
1363-1368,包括其中所引用的RSV感染的示例性模型的参考文献)。为了体内测试抗体或
抗原结合片段或者组合物的毒性,可以使用本领域已知的任何动物模型系统,包括但不限
于大鼠、小鼠、牛、猴和兔。
率或者防止、改善或减轻与RSV感染相关的一种或多种症状的能力来证实。例如,如果施用本文所提供的抗体或组合物之后有病毒载量的减少、一种或多种症状的改善、RSV感染持续时间的减少或者死亡率和/或发病率的降低,那么认为治疗是治疗性的。而且,如果施用一种或多种免疫特异性地结合一种或多种RSV抗原的抗体或其抗原结合片段之后免疫应答
有增加,那么认为治疗是治疗性的。
例如,细胞因子的表达水平可以通过例如RT-PCR和RNA印迹分析分析细胞因子的RNA水平
来测量,以及通过例如免疫沉淀然后蛋白印迹分析或ELISA分析细胞因子的水平来测量。
RSV抗体或抗原结合片段调节免疫细胞的生物活性的能力可以通过检测抗原的表达、检测
免疫细胞的增殖、检测信号分子的活化、检测免疫细胞的效应子功能或者检测免疫细胞的
分化来评价。本领域技术人员已知的技术可以用于测量这些活性。例如,细胞增殖可以通
3
过 H-胸苷掺入测定和台盼蓝细胞计数来测定。抗原表达可以例如通过免疫测定来测定,所述免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统,使用诸如蛋白印迹、免疫组织化学
放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、A蛋白免疫测定以及FACS分析的技术。信号分子的活化可以例如通过激酶测定和电泳
迁移测定(EMSA)来测定。
短RSV感染的时间进程的能力。还可以测定所述抗RSV抗体或其抗原结合片段增加患有
RSV感染的人的生存期至少或约25%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约75%、至少或约85%、至少或约95%或者至少或约99%的能力。而且,可以测定抗RSV抗体或其抗原
结合片段减少患有RSV感染的人的住院期至少或约60%、至少或约75%、至少或约85%、至少或约95%或者至少或约99%的能力。本领域技术人员已知的技术可以用来分析本文所
提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段在体内的功能。
原结合片段的体外和动物模型研究可以外推至人,并且足以证实所述抗RSV抗体或抗原结
合片段的预防和/或治疗效用。
供的抗RSV抗体或其抗原结合片段定性和定量测量分离的生物样品(例如,痰)中或体内
RSV水平的测定。
位(例如,粘膜部位)的定位和/或持久性。偶联至可检测部分的抗RSV抗体或其抗原结
合片段可以通过本领域已知的任何合适的方法在体内检测。偶联至可检测部分的抗RSV抗
体或其抗原结合片段还可以在分离的生物样品中检测,例如获得自施用所述抗体或其抗原
结合片段之后的对象的组织或流体样品。
在。本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以用于检测结合生物样品中的物质的抗
原和/或表位的水平。
触并检测样品中结合所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的多肽的水平来测定。
基团并特异性结合抗体/多肽复合物的检测试剂检测结合的多肽。这类检测试剂可以含有
例如特异性结合所述多肽的结合剂或者抗体或者特异性结合所述结合剂的其他物质。
RSV抗体或其抗原结合片段的反应性。用于这类测定的合适的多肽包括如上文所述抗RSV
抗体或其抗原结合片段结合的全长RSV F蛋白及其部分,包括RSV F蛋白的细胞外结构域。
物还可以是珠或盘,例如玻璃、玻璃纤维、胶乳或塑料,如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物还可以是磁性颗粒或光纤传感器,例如美国专利第5,359,681号所公开的物质。可以利
用本领域技术人员已知的各种技术将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段固定在所述固体
支持物上。可以通过吸附至微量滴定板中的孔或膜来固定所述抗RSV抗体或其抗原结合片
段。在这类情况下,可以通过使合适的缓冲液中的抗RSV抗体或其抗原结合片段与固体支
持物接触适量的时间来实现吸附。接触时间随温度变化,但是通常在约1小时和约1天之
间。一般来说,使塑料微量滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与约10ng-约10μg,
典型约100ng-约1μg的抗RSV抗体或其抗原结合片段接触足以固定适量的抗RSV抗体或
其抗原结合片段。
其抗原结合片段上的功能基团(例如羟基或氨基)反应。例如,可以利用苯醌或者通过支
持物上的醛基与结合配对物上的胺和活性氢缩合来将所述RSV抗体或其抗原结合片段共
价连接至具有适当聚合物包被的支持物(参见,例如,Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook,1991,at A12-A13)。
时,第二标记的结合剂结合抗RSV抗体或其抗原结合片段-多肽复合物。
方案以使用RSV多肽检测结合生物样品中的这类多肽的抗体。检测这类蛋白特异性抗体可
以允许鉴定RSV感染。
种引物或探针。RSV蛋白标记的选择可以基于常规实验以确定导致最佳灵敏度的组合。此
外或可选地,本文所提供的RSV蛋白的测定可以与其他已知的RSV抗原的测定联合。
染组织的成像,例如,抗RSV抗体的抗体部分一般会结合RSV(例如,结合RSV F蛋白表位),并且显像剂是成像时可检测的物质,例如偶联至所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的顺磁
剂、放射性物质或荧光剂。通常,为了用作诊断剂,将所述抗RSV抗体或其抗原结合片段直接或间接偶联至显像剂。
接方法包括使用金属螯合复合物,采用例如连接至所述抗体或其抗原结合片段的有机螯合
剂,如DTPA(美国专利第4,472,509号)。还可以在诸如戊二醛或高碘酸盐的偶联剂存在的
情况下使所述抗体与酶反应。在这类偶联剂存在的情况下或者通过与异硫氰酸盐反应来制
备具有荧光标记的缀合物。
位素另一因素是所述放射性同位素的半衰期足够长,从而在靶最大吸收时仍可检测;但是
足够短,从而最小化对宿主的有害辐射。通常,用于体内成像的放射性同位素缺少颗粒发
射,但是产生大量140-250 keV范围中的光子,这可以通过常规γ相机容易地检测。
的示例性中间官能团包括双功能螯合剂,例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸
(EDTA)以及相似分子。可以结合所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的金属离子的实
72 211 14 51 36 57 58 67 152 67 68 3 123 125
例包括但不限于 砷、 砹、碳、铬、氯、钴、钴、铜、 铕、镓、镓、氢、 碘、
131 111 59 32 186 188 97 75 35 99m 201 90 89
碘、 碘、 铟、铁、磷、 铼、 铼、钌、硒、硫、 锝、 铊、钇以及 锆。
断成像的任何常规方法。通常,γ和正电子发射放射性同位素用于相机成像和MRI的顺磁
157 55 162 52 56
同位素。在这类技术中特别有用的元素包括但不限于 Gd、Mn、 Dy、Cr和 Fe。
以及铋(III)。
系统迅速清除是可取的,以便给出最好的靶标比背景信号比。
2 2 2 2 2 2
m-约500mg/m、0.1mg/m-约200mg/m 或者约0.1mg/m-约10mg/m。此类剂量可以例如根
据是否施用多次注射、组织以及本领域技术人员已知的其他因素变化。
片段可以用来测定旨在改善致病性疾病的特定治疗方案是否有效。
供的抗体或其抗原结合片段用于治疗疾病或疾病状况,例如RSV感染。在一些实例中,可以将所提供的抗体或其抗原结合片段给对象施用用于预防用途,例如RSV感染的防止和/或
传播,包括但不限于抑制宿主中RSV感染的建立或者抑制对象间的RSV传播。在一些实例
中,可以将所提供的抗体或其抗原结合片段给对象施用,用于减少所述对象中的RSV病毒
载量。还可以将所述抗体或其抗原结合片段给对象施用,用于防止、治疗和/或缓解RSV感
染的一种或多种症状,或者减少RSV感染的持续时间。
99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中,相对于抗RSV抗体或抗原结合片段不存在的情况下RSV
感染的一种或多种症状的严重程度,施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段降低
RSV感染的一种或多种症状的严重程度至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约
30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
患者;以及有RSV感染风险的对象,如人类患者。示例性RSV病毒感染包括RSV病毒引起
的感染,例如但不限于急性RSV疾病、RSV上呼吸道感染(URI)和/或RSV下呼吸道感染
(LRI),包括例如细支气管炎和肺炎。
在特定实例中,用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段治疗的对象为人。
施用以缓解与RSV病毒感染相关的一种或多种症状或疾病状况,包括但不限于哮喘、喘息、反应性气道疾病(RAD)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。这类疾病和疾病状况是公知的,并且
很容易被医生或技术人员诊断。
37周胎龄);婴儿(例如,超过37周胎龄出生的人类婴儿),患有囊性纤维化、支气管肺发育不良、先天性心脏病、先天性免疫缺陷或获得性免疫缺陷(例如,AIDS患者)的对象,免疫
抑制的患者,例如,移植(例如骨髓移植或肾移植)受体,或者老年对象,包括养老院或康复中心中的对象。在一些实例中,可以将本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于
对象,例如早产婴儿或婴儿,其暴露于一种或多种环境风险因素,例如但不限于参加日托、有学龄的兄弟姐妹、暴露于环境空气污染物、先天性气道异常和/或严重神经肌肉疾病。在一些实例中,可以将所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段施用于对象,例如婴儿或小于2
岁的儿童,其患有慢性肺疾病或先天性心脏病,包括充血性心力衰竭、肺动脉高压和发绀性心脏病。
的,并且包括例如病毒培养空斑测定、抗原检测测试、聚合酶链式反应(PCR)测试以及各种抗体血清学测试。病毒感染的测试可以在获得自组织或流体样品(例如脊髓液、血液或尿)
的样品上进行。其他测试包括但不限于可以显示肺炎征兆的胸透,其他血液测试,例如化学筛选、全血细胞计数或动脉血气(ABG)分析,以及血氧定量法,以测量血液中氧的量。
增加的对病毒感染的敏感性的对象(例如婴儿、老年人或免疫低下患者)施用本文所提供
的抗RSV抗体或其抗原结合片段,用于在RSV季节之前和/或期间预防和/或治疗RSV感
染。在一些实例中,在RSV季节期间施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段1次、
2次、3次、4次或5次。在一些实例中,在RSV季节前1个月、2个月或3个月之内施用本文
所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段1次、2次、3次、4次或5次。
试多肽来凭经验确定抗RSV抗体或其抗原结合片段的治疗有效浓度,例如通过利用本文所
提供或本领域已知的测定。
用途径以获得最佳疗效。通常,临床医生会施用所述抗体或其抗原结合片段,直至达到实现期望效果的剂量。这种治疗的进展通过常规测定很容易监测。用于监测病毒感染的治疗的
示例性测定是本领域已知的,并且包括例如病毒滴度测定。
毒感染的可能性降低。在一些实例中,以有效诱导对象中的免疫应答的量施用本文所提供
的抗RSV抗体或其抗原结合片段。剂量不是那么大,不会引起有害副作用,例如高粘滞综合征、肺水肿或充血性心力衰竭。通常,剂量会随年龄、疾病状况、性别以及患者中的疾病程度变化,并且可以由本领域技术人员确定。在出现任何有害副作用的情况下,个体医生可以
调整剂量。用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状的示例性剂
量包括但不限于约或0.01mg/kg至约或300mg/kg,例如,约或0.01mg/kg、约或0.1mg/kg、
约或0.5mg/kg、约或1mg/kg、约或5mg/kg、约或10mg/kg、约或15mg/kg、约或20mg/kg、约或25mg/kg、约或30mg/kg、约或35mg/kg、约或40mg/kg、约或45mg/kg、约或50mg/kg、约或
100mg/kg、约或150mg/kg、约或200mg/kg、约或250mg/kg或者约或300mg/kg。
约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现至少或约1μg/ml、至少
或约2μg/ml、至少或约3μg/ml、至少或约4μg/ml、至少或约5μg/ml、至少或约6μg/
ml、至少或约7μg/ml、至少或约8μg/ml、至少或约9μg/ml、至少或约10μg/ml、至少或约
15μg/ml、至少或约20μg/ml、至少或约25μg/ml、至少或约30μg/ml、至少或约40μg/
ml、至少或约50μg/ml、至少或约60μg/ml、至少或约70μg/ml、至少或约80μg/ml、至少或约90μg/ml、至少或约100μg/ml的血清滴度的量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗
原结合片段,用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状。
以在施用第一剂量的所述抗体或其抗原结合片段后或约10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现插管样品或来自肺
的灌洗液中10ng/mg(ng抗RSV抗体或其抗原结合片段/mg肺蛋白)或约10ng/mg、15ng/
mg或约15ng/mg、20ng/mg或约20ng/mg、25ng/mg或约25ng/mg、30ng/mg或约30ng/mg、
40ng/mg或约40ng/mg、50ng/mg或约50ng/mg、60ng/mg或约60ng/mg、70ng/mg或约70ng/
mg、80ng/mg或约80ng/mg、90ng/mg或约90ng/mg、100ng/mg或约100ng/mg、110ng/mg或约
110ng/mg、120ng/mg或约120ng/mg、130ng/mg或约130ng/mg、140ng/mg或约140ng/mg或者
150ng/mg或约150ng/mg的滴度的剂量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段,用
于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多种症状。
抗原结合片段。对于根据疾病状况在几天或更长的时间中重复施用,可以重复治疗直至期
望的疾病症状抑制发生或者实现期望的患者疾病状况的改善。重复施用可以包括根据治疗
的进展增加或减少的所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的量。还考虑其他剂量方案。
8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现至少或约1μg/ml、至少或约2μg/ml、至少或约3μg/ml、至少或约4μg/ml、至少或约5μg/ml、至少或约6μg/ml、至少或约7μg/ml、至少或约8μg/ml、至少或约9μg/ml、至少或约10μg/ml、至少或约15μg/ml、至少或约20μg/ml、至少或约
25μg/ml、至少或约30μg/ml、至少或约40μg/ml、至少或约50μg/ml、至少或约60μg/
ml、至少或约70μg/ml、至少或约80μg/ml、至少或约90μg/ml、至少或约100μg/ml的血清滴度的量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段1次、2次、3次、4次、5次、6次、
7次、8次、9次、10次或更多次,用于防止或治疗RSV感染和/或改善RSV感染的一种或多
种症状。在一特定实例中,以在施用第四剂量的所述抗体或其抗原结合片段后或约1天、2
天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天或者40天并在随后剂量的所述抗体或其抗原结合片段之前有效实现至少或约72μg/ml的血清滴度的
量施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段4次,用于防止或治疗RSV感染和/或
改善RSV感染的一种或多种症状。
4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或者3个月。
文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段一次或多次,和/或在RSV期间施用预防有效量
的本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段一次或多次。
以根据期望的对象中的病毒清除速率来修改。
治疗方法的范围之内。应当进一步理解,对于任何特定对象,具体剂量方案可以根据对象需要以及管理或监督药物制剂的施用的人的专业判断随时间调整,并且本文所示的剂量仅为
示例,并不是为了限制其范围。为了治疗诸如病毒感染(例如RSV病毒感染)的疾病或疾
病状况施用的抗RSV抗体或其抗原结合片段的量可以通过标准临床技术(例如病毒滴度或
抗原检测测定)来确定。此外,体外测定和动物模型可以用来帮助鉴定最佳剂量范围。这
类测定可以提供剂量范围,所述剂量范围可以外推至给对象对象如人的施用。基于动物模
型的鉴定最佳剂量范围的方法是本领域技术人员公知的。
段外部给对象施用,用于发挥局部或透皮作用。可以通过任何方便的途径施用含有抗RSV
抗体或其抗原结合片段的组合物,例如通过输液或团注射、通过上皮粘膜或皮肤粘膜(例
如,口腔粘膜、直肠和肠粘膜)吸收。可以与其他生物活性剂一起施用含有抗RSV抗体或其
抗原结合片段的组合物。施用模式可以包括体表或者其他在身体区域上、中或周围施用组
合物,其可以接触感染、污染诸如RSV病毒的病毒或与诸如RSV病毒的病毒有关的流体、细
胞或组织。为了直接递送至靶器官,例如肺,可以通过体表或气雾剂途径(例如,通过肺气雾剂)施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,所提供的抗RSV
抗体或其抗原结合片段可以作为控释制剂例如通过泵(参见,例如,Langer(1990)Science
249:1527-1533;Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20;Buchwald et al.(1980)Surgery 88:507;and Saudek et al.(1989)N.Engl.J.Med.321:574)或者通过使用本领域已知和本文其他地方所述的各种聚合物施用。在一些实例中,可以将控释或缓释系统放置
于接近治疗靶标,例如,肺,因此仅需要全身剂量的部分(参见,例如,Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。
5,290,540和4,880,078;以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO
98/31346和WO 99/66903)。肺部递送的示例性方法是本领域已知的,并且包括但不限于气
雾剂法,例如吸入器(例如,压力定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、雾化吸入器(例如,喷射或超声雾化吸入器)以及其他一次呼吸液体系统)、气管内灌输和吹入。在一些实例
中,可以通过共施用或施用含有本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段和渗透促进剂
的共制剂来促进肺部递送,所述渗透促进剂例如表面活性剂、脂肪酸、糖、螯合剂和酶抑制剂,如蛋白酶抑制剂。
包括但不限于溶解性、吸湿性、结晶特性、熔点、密度、粘度、流动、稳定性以及降解谱。
抗体或其抗原结合片段,例如,通过体表安装或施用(例如,利用支气管镜或其他人工气道气管内灌输和吹入)液体溶液、凝胶剂、软膏剂、散剂,或者通过吸入(例如,鼻腔喷雾剂、吸入器(压力定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、雾化吸入器(例如,喷射或超声雾化吸入
器)以及其他一次呼吸液体系统))。施用可以在暴露于病毒之前或暴露于病毒之后进行。
原结合片段可以与一种或多种抗病毒剂联合施用,用于预防和/或治疗病毒感染,如呼吸
道病毒感染。在一些实例中,所述呼吸道病毒感染为RSV感染。抗病毒剂可以包括减少和/
或消除病原感染的物质或者缓解病原感染的一种或多种症状的物质。在一些实例中,还可
以联合施用多种抗体或其抗原结合片段(例如,一种或多种抗病毒抗体),其中所述抗体中
的至少一种为本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,可以联合施用
多种抗体用于预防和/或治疗RSV感染或多种病毒感染,其中所述抗体中的至少一种为本
文所提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,所提供的抗RSV抗体可以与结
合并中和诸如RSV的病毒的一种或多种抗病毒抗体联合施用。在一些实例中,所提供的抗
RSV抗体或其抗原结合片段可以与可以抑制或缓解诸如RSV感染的病毒感染的一种或多种
症状的一种或多种抗体联合施用。在一些实例中,联合施用两种或更多种本文所提供的抗
RSV抗体或其抗原结合片段。
合片段同时共施用,但是通过不同的递送方式。还可以在与施用所述抗RSV抗体或其抗原
结合片段不同的时间施用所述物质,但是在时间上与施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片
段足够接近以具有联合预防或治疗效果。在一些实例中,在施用所述抗RSV抗体或其抗原
结合片段之后或之前施用一种或多种额外的物质,间隔选定的时间。在一些实例中,所述时间为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些实例中,多次施用一种或多种额外的物质和/或多次施用本文所提供的抗RSV抗体或其抗原结
合片段。
80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中,相对于组合不存在的情况
下RSV感染的一种或多种症状的严重程度,施用组合降低RSV感染的一种或多种症状的严
重程度至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约
20%、至少或约15%或者至少或约10%。
85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中,相对于组
合不存在的情况下的RSV复制,组合抑制RSV复制至少或约99%、至少或约95%、至少或约
90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
Gilman et al.,Goodman and Gilman′s:The Pharmacological Basis of Therapeutics,
10th ed.,McGraw-Hill,New York,2001;The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,Berkow,M.D.et al.(eds.),17th Ed.,Merck Sharp & Dohme Research Laboratories,Rahway,N.J.,1999;Cecil Textbook of Medicine,20th Ed.,Bennett and Plum(eds.),W.B.Saunders,Philadelphia,1996,关于已用于或用于防止、治疗、管理或改善RSV感染或者其一种或多种症状的治疗(例如,预防剂或治疗剂)的信息)。这类物质的实例包
括但不限于免疫调节剂,抗炎剂(例如,肾上腺类皮质激素、皮质类固醇(例如,倍氯米松
(beclomethasone)、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、曲安西龙、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松)、糖皮质激素、类固醇、非类固醇抗炎药(例如,阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸和COX-2抑制剂)),止痛药,白三烯拮抗药(例如,孟鲁司特、甲基黄嘌呤、扎鲁司特和齐留通),支气管扩张药,例如β2-激动剂(例如,班布特罗、比托特罗、克仑特罗、非诺特罗、福莫特罗、茚达特罗、异他林、奥西那林、吡布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、利米特罗、沙丁胺醇(salbutamol)(沙丁胺醇(Albuterol)、万托林)、左沙丁胺醇、沙美特罗、妥洛特罗和特布他林)和抗胆碱能剂(例如,异丙托溴铵和奥封溴铵),柳氮磺吡啶(sulphasalazine),
青霉胺,氨苯砜,抗组胺药,抗疟剂(例如,羟氯喹)以及抗病毒剂。本文所提供的抗RSV
抗体或其抗原结合片段还可以与治疗RSV感染的一种或多种治疗联合施用,所述治疗包括
但不限于静脉内输液的免疫球蛋白的施用,补充氧和液体或辅助呼吸的施用。本文所提供
的抗RSV抗体或其抗原结合片段还可以与调节肺成熟和表面活性蛋白表达的一种或多种
物质联合施用,所述物质例如但不限于糖皮质激素、PPARγ配体和血管内皮细胞生长因子
(VEGF)。
剂。使用本文所提供的抗体和/或抗RSV抗体和抗原结合片段的联合治疗预期作为本文所
提供的抗体和/或抗RSV抗体和抗原结合片段与其他抗RSV抗体以及抗RSV抗体和抗原结
合片段的组合。
stampidine、艾夫西他滨、racivir、氨多索韦、司他夫定、扎西他滨、替诺福韦、依法韦仑、奈韦拉平、依曲韦林、利匹韦林、洛韦胺、地位韦啶、阿扎那韦、呋山那韦、洛匹那韦、达芦那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、替拉那韦、氨普那韦、茚地那韦、恩夫韦肽、马拉韦罗、维立韦罗、PRO 140、ibalizumab、raltegravir、elvitegravir、bevirimat、vivecon,包括它们的互变异构形式、类似物、异构体、多晶型物、溶剂化物、衍生物或盐。
PFP-1 和 PFP-2(American Home Products)、RSV 疫 苗 (Avant Immunotherapeutics)、
F-50077(Pierre Fabre)以及其他抗RSV抗体或他们的抗原结合片段。
示例性免疫刺激剂包括细胞因子,例如但不限于干扰素(例如,IFN-α、β、γ、ω);淋
巴因子和造血生长因子,例如但不限于GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、白介
素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-7(IL-7)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素-14(IL-14)和肿瘤坏死因子(TNF)。
毒抗原,其为表面蛋白,例如病毒衣壳蛋白或病毒包膜蛋白。在一些实例中,所述一种或多种其他抗体结合病毒抗原,其表达于感染的细胞的表面。在一些实例中,所述一种或多种其他抗体结合病毒抗原,其是细胞内表达的(例如在感染的细胞内)。在一些实例中,所述一
种或多种其他抗体结合病毒,其导致呼吸道疾病,例如但不限于RSV、副流感病毒(PIV)或
人偏肺病毒(hMPV)。本文还提供包含抗体混合物的组合物。
供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(如
IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
RSV抗体或其抗原结合片段联合使用的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更高的多特异性的。
例性抗体或其抗原结合片段衍生物包括修饰的抗体,例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇
化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切割、连接至细胞配体或其他蛋白或者包含对FcRN受体具有更高亲和力的异源Fc结构域(参见,例如U.S.Pat.
No.7,083,784)。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种,包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化或者衣霉素存在下的合成。此外,衍生物可以包含一个或多个非经典氨基酸。
抗体可以与所述抗RSV抗体或其抗原结合片段共施用,例如作为相同的药物组合物或相同
的递送方法的一部分。在一些实例中,所述一种或多种额外的抗体可以与所述抗RSV抗体
或其抗原结合片段在相同的时间共施用,但是通过不同的递送方式。所述一种或多种额外
的抗体可以与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段在不同的时间施用,但是时间上与
施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段足够接近以具有联合的预防或治疗效果。在一些实
例中,所述一种或多种额外的抗体在施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段之后或之前施
用,被选定的时间段分隔。在一些实例中,所述时间段为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些实例中,所述一种或多种额外的抗体多次施用和/或本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段多次施用。
抗RSV抗体或其抗原结合片段以预防和/或治疗RSV感染。用于与本文提供的抗RSV抗体
或其抗原结合片段联合治疗的示例性抗RSV抗体或其抗原结合片段包括免疫特异性地结
合并中和RSV的抗RSV抗体或其抗原结合片段。在一些实例中,所述一种或多种额外的抗
RSV抗体或其抗原结合片段包括免疫特异性地结合RSV A亚型和/或RSV B亚型的抗体或
其抗原结合片段。
所示的氨基酸序列)、RSV RNA聚合酶β亚基大结构蛋白)(L蛋白)(例如,具有SEQ ID NO:
1521所示的氨基酸序列)、RSV核壳体蛋白(例如,具有SEQ ID NO:1522所示的氨基酸序
列)、RSV核蛋白(N)(例如,具有SEQ ID NO:1523所示的氨基酸序列)、RSV磷蛋白P(例如,具有SEQ ID NO:1524所示的氨基酸序列)、RSV基质蛋白(例如,具有SEQ ID NO:1525所示的氨基酸序列)、RSV小疏水(SH)蛋白(例如,具有SEQ ID NO:1526所示的氨基酸序列)、
RSV RNA-依赖性聚合酶、RSVF蛋白(例如,具有SEQ ID NO:1527所示的氨基酸序列)、RSV G蛋白例如,具有SEQ ID NO:1528氨基酸序列),或者它们的任何等位变体。在具体实例中,所述一种或多种额外的抗病毒抗体包括结合RSV F蛋白的抗RSV抗体。在具体实例中,结合
RSV F蛋白的一种或多种额外的抗病毒抗体结合RSV F糖蛋白的A、B、C、I、II、IV、V或VI抗原位点(参见,例如Lopezet al.(1998)J.Virol.72:6922-6928)。
AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、
1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、( 参 见 U.S.Pat.Nos.5,824,307 and6,818,216)、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23(see U.S.Pat.No.6,685,942)、RF-1、RF-2(参见U.S.Pat.No.5,811,524),或他们的抗原结合片段。在一些实例中,用于联合
治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有以下抗体
的VH链和/或VL链的氨基酸序列的VH链和/或VL链:帕利珠单抗 莫
他珠单抗 AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、
A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1或RF-2。在一些实例中,用于联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包
括抗体或其抗原结合片段,其包含以下抗体的一个或多个CDR:帕利珠单抗
莫他珠单抗 AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、
A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1或RF-2。在一些实例中,用于联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包
括抗体或其抗原结合片段,其包含来自例如但不限于以下的抗RSV小鼠单克隆抗体的
一 个 或 多 个 CDR:MAb 1153、1142、1200、1214、1237、1129、1121、1107、1112、1269、1269、
1243(BeeLer et al.(1989)J.Virology63(7):2841-2950)、MAb151(Mufson et al.(1987)J.Clin.Microbiol.25:1635-1539)、MAbs 43-1and 13-1(Fernie et al.(1982)Proc.
Soc.Exp.Biol.Med.171:266-271)、MAbs 1436C、1302A、1308F 和 1331H (Anderson et al.(1984)J.Clin.Microbiol.19:934-936)。可以用于与本文提供的抗RSV抗体或抗
原结合片段联合治疗的额外的示例性抗体或其抗原结合片段包括但不限于例如以下
文献描述的抗RSV抗体或其抗原结合片段:U.S.Patent Nos.6,413,771、5,840,298、
5,811,524、6,656,467、6,537,809、7,364,742、7,070,786、5,955,364、7,488,477、
6,818,216、5,824,307、7,364,737、6,685,942 和 5,762,905 以 及 U.S.Patent Pub.
Nos.2007-0082002、2005-0175986、2004-0234528、2006-0198840、2009-0110684、
2006-0159695、2006-0013824、2005-0288491、2005-0019758、2008-0226630、2009-0137003和2009-0092609。
基酸序列的VH链:SEQ ID NO:103、113、122、131、137、144、149、155、161、167、172、176、179、
182、186、190、194、198、201、205、210、215、222、356、363、369、376、382、387、1607 和 1611。
在一些实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额
外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列
的VH结构域:SEQ ID NO:104、114、123、132、138、145、150、156、162、168、173、187、206、357、
362、364、370、377、383和388。在一些实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有
任何以下序列所示的氨基酸序列的VH CDR1:SEQ ID NO:105、115、124、1608和1612。在具体实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的
抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有氨基酸序列TSGMSVG(SEQ ID NO:105)、TAGMSVG(SEQ ID NO:115)、AYAMS(SEQID NO:1608)或GYTMH(SEQ ID NO:1612)的VH CDR1。
在一些实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额
外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列
的VH CDR2:SEQ ID NO:106、125、133、157、226-235、365、389、397-408、1609和1613。在一具体实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外
的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有氨基酸序列DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:106)或DIWWDDKKHYNPSLKD(SEQ ID NO:125)、GISGSGDSTDYADSVKG(SEQ ID NO:1609)或SITGGSNFINYSDSVKG(SEQ ID NO:1613)的VH CDR2。在一些实例中,用于与本文提供的
抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗
原结合片段,其包含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VH CDR3:SEQ ID NO:107、116、
126、139、188、236-238、371、1610和1614。在一具体实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片
段,其包含具有氨基酸序列SMITNWYFDV(SEQ ID NO:107)、DMIFNFYFDV(SEQ ID NO:126)、HLPDYWNLDYTRFFYYMDV(SEQ IDNO:1610)或APIAPPYFDH(SEQ ID NO:1614)的VH CDR3。
基酸序列的VL链:SEQ ID NO:108、117、127、134、140、146、152、158、164、169、174、177、180、
183、189、191、195、199、202、207、211、216、220、223、358、366、372、378、384、390、393、1615、
1619和1623。在一些实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗
的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有任何以下序列所
示的氨基酸序列的VL结构域:SEQ ID NO:109、118、128、135、141、147、153、159、165、170、
175、178、181、184、192、196、200、203、208、212、217、221、224、359、367、373、379、385、391和394。在一些实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种
或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有任何以下序列所示的氨
基酸序列的VL CDR1:SEQ ID NO:110、119、129、142、154、166、239-255、257-297、299-314、
374、380、395、409-544、1616、1620和1624。在一具体实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片
段,其包含具有氨基酸序列KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:110)、SASSRVGYMH(SEQ ID NO:154)、RATQSISSNYLA(SEQ ID NO:1616)、KASQNINDNLA(SEQ ID NO:1620) 或 RATQSVSNFLN(SEQ ID NO:1624)的VL CDR1。在一些实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联
合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有任何以下
序列所示的氨基酸序列的VL CDR2:SEQ ID NO:111、120、136、143、160、171、185、218、225、
315-355、360、368、375、381、386、392、396、545-1509、1617、1621和1625。在一具体实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒
抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有氨基酸序列氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:
111)、DTLLLDS(SEQ ID NO:218)、GASNRAT(SEQ ID NO:1617)、GASSRAT(SEQ ID NO:1621)或DASTSQS(SEQ ID NO:1625)的VL CDR2。在一些实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其
抗原结合片段联合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包
含具有任何以下序列所示的氨基酸序列的VL CDR3:SEQ ID NO:112、121、193、1510-1511、
1618、1622和1626。在一具体实例中,用于与本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段联
合治疗的一种或多种额外的抗病毒抗体包括抗体或其抗原结合片段,其包含具有氨基酸序
列氨基酸序列FQGSGYPFT(SEQ IDNO:112)、QQYDISPYT(SEQ ID NO:1618)、QQYGGSPYT(SEQ ID NO:1622)或QASINTPL(SEQ ID NO:1626)的VL CDR3。
MedImmune Inc,Gaithersburg,MD;参见,例如Groothius et al.(1993)New Eng.J.Med 329:
1524-1530)。
例如选自抗人偏肺病毒(hMPV)抗体、抗副流感病毒(PIV)抗体、抗禽肺病毒(APV)抗体或
者本领域已知的额外的抗病毒抗体。
原例如PIV核衣壳磷蛋白、PIV融合(F)蛋白、PIV磷蛋白、PIV大(L)蛋白、PIV基质(M)蛋
白、PIV血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白、PIV RNA-依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D
蛋白、PIV C蛋白或它们的任何等位变体。在具体实例中,所述PIV抗原为PIV F蛋白。在
一些实例中,所述抗PIV抗体为免疫特异性地结合1型人PIV、2型人PIV、3型人PIV和/
或4型人PIV的抗原的抗体。
抗原例如hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水蛋白、hMPV RNA-依赖性
RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPVG蛋白或它们的任何等位变体。在具体的实例中,所述hMPV
抗原为PIV F蛋白。在一些实例中,所述抗hMPV抗体为免疫特异性地结合A型hMPV或B型
hMPV的抗原的抗体。在一些实例中,所述抗hMPV抗体为免疫特异性地结合A1和/或A2亚
型hMPV和/或B1和/或B2亚型hMPV的抗原的抗体。
用的抗体或其抗原结合片段可以包括但不限于单克隆抗体、人抗体、非人抗体、重组产生的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、胞内抗体和抗体片段,例如但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型抗-Id)抗体或者它们的任何抗原结合片段。联合本文提供的抗RSV抗体施用的抗体可以包括任何免疫球蛋白类型(如
IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何种类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(如IgG2a和IgG2b)的成员。
至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约
70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%
或者至少或约10%。在一些实例中,相对于缺少抗病毒抗体或抗原结合片段的组合的情况
下RSV感染的一种或多种症状的严重性,施用抗病毒抗体或抗原结合片段的组合降低RSV
感染的一种或多种症状的严重性至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约
85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
合至少或约99%、至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约
75%、至少或约70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。在一些实例中,相对于缺少抗病毒抗体或抗原结合片段的
组合的情况下RSV复制,抗病毒抗体或抗原结合片段的组合抑制RSV复制至少或约99%、
至少或约95%、至少或约90%、至少或约85%、至少或约80%、至少或约75%、至少或约
70%、至少或约65%、至少或约60%、至少或约55%、至少或约50%、至少或约45%、至少或约40%、至少或约35%、至少或约30%、至少或约25%、至少或约20%、至少或约15%或者至少或约10%。
通过向对象施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。在这个实例中,核酸产生它们所编
码的介导预防或治疗效果的抗体或其抗原结合片段。
物的表达载体的一部分。特别地,这样的核酸具有可操作地连接至抗体编码区的启动子,例如异源启动子,所述启动子是诱导型或组成型,以及任选地组织特异性的。在另一具体实
施方案中,使用核酸分子,其中抗体编码序列和任何其他期望的序列的侧翼是促进基因组
中期望位点处的同源重组的区域,因而提供编码抗体的核酸的染色体内表达(Koller and
Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935;Zijlstra et al.(1989)Nature
342:435-438)。在一些实例中,表达的抗体分子为单链抗体。在一些实例中,核酸序列包含编码抗体的重链和轻链或它们的片段的序列。在一具体实例中,核酸序列包含编码抗RSV
Fab片段的序列。在一具体实例中,核酸序列包含编码全长抗RSV抗体的序列。在一些实例
中,编码的抗RSV抗体为嵌合抗体。
建为合适的核酸表达载体的一部分,并施用所述载体,从而其变为细胞内的,例如通过利用缺陷或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体的感染(参见U.S.Pat.No.4,980,286),或者通
过裸DNA的直接注射,或者通过使用微粒轰击(例如,基因枪;Biolistic,Dupont),或者用脂质或细胞表面受体或转染剂包衣,封装于脂质体、微粒或微胶囊中,或者通过连接至已知进入细胞核的肽而施用,通过连接至进行受体介导的内吞作用的配体(参见,例如Wu and
Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)(其可以用于,例如靶向特异性表达所述受体的细
胞类型)。在一些实例中,可以形成核酸-配体复合物,其中所述配体包含膜融合的病毒肽
以破坏核内体,从而允许所述核酸避免溶酶体降解。在一些实例中,可以通过靶向特异性受体来体内靶向所述核酸以用于细胞特异性摄取和表达(参见,例如PCT公开WO 92/06180;
WO 92/22635;WO92/20316;WO93/14188和WO 93/20221)。或者,可以细胞内引入所述核酸并通过同源重组并入宿主细胞DNA以用于表达(Koller and Smithies(1989)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 86:8932-8935和Zijlstra et al.(1989)Nature 342:435-438)。
DNA所需的组分。将要用于基因治疗的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列克隆入一
种或多种促进基因递送入对象的载体。关于逆转录病毒载体的更多细节可见,例如Boesen et al.(1994)Biotherapy 6:291-302。示例逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的其他
参见文献包括例如Clowes et al.(1994)J.Clin.Invest.93:644-651;Klein et al.(1994)Blood 83:1467-1473;Salmons and Gunzberg(1993)Human Gene Therapy 4:129-141; 和Grossman and Wilson(1993)Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114。
于腺病毒的递送系统的其他靶包括肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够
感染非分裂细胞的能力的优势。Kozarsky and Wilson(1993)Current Opinion in Genetics and Development3:499-503提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout et al.(1994)
Human Gene Therapy 5:3-10证实了腺病毒载体将基因转移至猕猴的呼吸上皮细胞的用
途。腺病毒在基因治疗中的用途的其他实例可见,例如Rosenfeld et al.(1991)Science
252:431-434;Rosenfeld et al.(1992)Cell 68:143-155;Mastrangeli et al.(1993)J Clin.Invest.91:225-234;PCT公开WO94/12649;和Wang et al.(1995)Gene Therapy 2:
775-783。在一具体实例中,腺病毒载体用于递送编码本文提供的抗RSV抗体、其抗原结合
片段和/或衍生物的核酸。
因的细胞递送至对象。
进行,包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微室介导的基因转移以及原生质球融合。本领域已知许多用于将外源基因引入细胞的技术(参见,例如Loeffler and Behr(1993)Meth.Enzymol.217:
599-618;Cohen et al.(1993)Meth.Enzymol.217:618-644;Cline(1985)Pharmacol.
Ther.29:69-92),并且可以用于施用编码本文提供的抗RSV抗体、其抗原结合片段和/或衍生物的核酸,条件是接受细胞的必需的发育和生理功能不被破坏。所述技术提供核酸稳定
转移至细胞,从而所述核酸可被所述细胞表达,并且通常是可遗传的并可被其后代细胞表
达。
期望的预防和/或治疗效果以及患者状态,并且可以由本领域技术人员确定。
体内施用重组细胞以用于治疗效果。在一具体实例中,使用干细胞或祖细胞。可以使用能
够体外分离并维持的任何干细胞和/或祖细胞(参见,例如PCT公开WO 94/08598;Stemple
and Anderson(1992)Cell 71:973-985;Rheinwald(1980)Meth.Cell Bio.21A:229;和
Pittelkow and Scott(1986)Mayo Clinic Proc.61:771)。
控制。
可以与药物可接受的载体或稀释剂配制。通常,这样的药物组合物使用不会明显破坏所述
抗体或其抗原结合片段的生物学性质的组分,所述生物学性质例如结合其特异性表位(例
如,结合RSV F蛋白上的表位)。每种组分在与其他成分相容并且不伤害患者的意义上是药
学和生理学可接受的。制剂可以常规地以单位剂型存在,并且可以通过药学领域公知的方
法制备,包括但不限于片剂、丸剂、散剂、液体溶液剂或混悬剂(例如,包括可注射、可吸收和体表制剂(例如,滴眼液、凝胶剂或软膏剂)、气雾剂(例如,鼻腔喷雾剂)、脂质体、栓剂、可注射和可灌注的溶液以及缓释形式。参见,例如Gilman,et al.(eds.1990)Goodman and Gilman′s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press;and Remington′s Pharmaceutical Sciences,17th ed.(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Pa.;Avis,et al.(eds.1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,
Dekker,NY;and Lieberman,et al.(eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Dekker,NY。当全身施用时,治疗组合物是无菌、无热原的,通常不含颗粒物,并且在具有应有的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的溶液中。这些条件是本领域技术人
员已知的。制备可肠胃外施用的组合物的方法是本领域技术人员公知的或者显而易见,并
且更详细地描述于,例如″Remington:The Science and Practice of Phamacy(Formerly Remington′s Pharmaceutical Sciences)″,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1995)。
可以利用本文所述的体外和体内方法确定。因此,当在药物制剂中时,本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以存在于用于施用的单位剂型。
可以使用本领域已知的冷冻干燥和重建技术。
材料(参见,例如Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984);Ranger and Peppas(1983)J,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61;see also Levy et al.(1985)Science 228:190;During et al.(1989)Ann.Neurol.25:351;Howard et al.(1989)
J.Neurosurg.7 1:105;U.S.Pat.Nos.5,679,377,5,916,597,5,912,015,5,989,463,
5,128,326;PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的实例包
括但不限于聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙
烯-共-乙烯基乙酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯烷
酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙交酯)(PLGA)
和聚原酸酯。通常,用于缓释制剂中的聚合物为惰性的、无可滤去的杂质、存储上稳定、无菌并且生物可降解的。本领域已知用于制备缓释制剂的任何技术可以用于制备包含本文提供
的一种或多种抗RSV抗体或抗原结合片段的缓释制剂。
珠单抗 及其衍生物,例如但不限于莫他珠单抗 AFFF、P12f2、
P12f4、P11d4、A1e9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1、FR H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R和A4B4-F52S (参见U.S.Pat.Nos.5,824,307和6,818,216)、rsv6、rsv11、rsv13、rsv19、rsv21、rsv22、rsv23(参见,例如U.S.Pat.Nos.5,824,307、6,685,942和6,818,216);人抗RSV抗体,例
如但不限于rsv6、rsv11、rsv13、rsv19(i.e.Fab 19)、rsv21、rsv22、rsv23、RF-1、RF-2(参见,例如U.S.Pat.Nos.6,685,942和5,811,524);源自抗RSV小鼠单克隆抗体的人源化
抗体,例如但不限于MAb 1153、1142、1200、1214、1237、1129、1121、1107、1112、1269、1269、
1243(Beeler et al.(1989)J.Virology63(7):2841-2950)、MAb151(Mufson et al.(1987)J.Clin.Microbiol.25:1635-1539)、MAbs 43-1 和 13-1(Fernie et al.(1982)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171:266-271)、MAb 1436C、1302A、1308F和 1331H(Anderson et al.(1984)J.Clin.Microbiol.19:934-936),或它们的抗原结合片段。可以用于包含本文提供的抗
RSV抗体或其抗原结合片段的药物组合物中的其他示例性抗体其抗原结合片段包括但不
限于例如以下文献中描述的抗RSV抗体或其抗原结合片段:U.S.Patent Nos.6,413,771、
5,840,298、5,811,524、6,656,467、6,537,809、7,364,742、7,070,786、5,955,364、
7,488,477、6,818,216、5,824,307、7,364,737、6,685,942和5,762,905以及 U.S.Patent Pub.Nos.2007-0082002、2005-0175986、2004-0234528、2006-0198840、2009-0110684、
2006-0159695、2006-0013824、2005-0288491、2005-0019758、2008-0226630、2009-0137003和2009-0092609。
疗所述疾病或病症的标签。所述药物组合物可以包装于单位剂型中,其包含用于单剂量或
多剂量的量的药物组合物。包装的药物组合物可以包含药物组合物的冻干粉末,所述药物
组合物包含提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段,可以在施用前重建(例如,用水或盐水)。
单呼吸液体系统)、泵、袋、瓶、容器、注射器、瓶以及适合于所选制剂和预期的施用和治疗模式的任何包装材料。所述药物组合物还可以加入、应用于或涂覆在用于避免感染的屏障或
保护性装置。
和组分,例如用于实施所述方法的管、溶液和注射器。示例性试剂盒可以包含本文提供的
抗RSV抗体或其抗原结合片段,并且可以任选地包含使用说明、用于向对象施用所述抗RSV
抗体或其抗原结合片段的装置、用于检测对象中的所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装
置、用于检测获得自对象的样品中的所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装置、以及用于
向对象施用其他治疗剂的装置。
定对象的适当状态的方法、适当的剂量、剂量方案以及用于施用所述抗RSV抗体或其抗原
结合片段的适当施用方法。说明还可以包括在治疗持续时间监测所述对象的指导。
品。
结合片段和/或一种或多种对照抗体(即,非RSV结合抗体)的组(panel),其中所述组中
的一种或多种抗体为本文提供的抗RSV抗体或抗原结合片段。
试剂盒中。示例性装置包括但不限于吸入器(如定量加压施用吸入器(MDI)、干粉吸入器
(DPI)、雾化吸入器(如喷雾或超声雾化吸入器)和其他单呼吸液体系统)、皮下针、静脉内
针、导管和液体分配器,如滴眼药器。通常,试剂盒的用于施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的装置与施用所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的期望方法是相容的。例如,例如,可以通过肺施用递送的抗RSV抗体或其抗原结合片段可以包含于具有或包含于吸入器或
雾化吸入器的试剂盒中。
结合片段或者根据本文提供的方法进行其治疗的试剂。例如,组合可以包括任何抗RSV抗
体或其抗原结合片段和抗病毒剂。组合还可以包括本文提供的抗RSV抗体或其抗原结合片
段与一种或多种其他治疗性抗体。如本文所述,提供的抗RSV抗体或其抗原结合片段的组
合还可以包含药物组合物,所述药物组合物包含所述抗RSV抗体或其抗原结合片段或者包
含编码所述抗RSV抗体或其抗原结合片段的核酸的宿主细胞。本文提供的组合可以配制为
单一组合物或分离的组合物。
实施例
行纯化。在第一实例中,克隆仅包含胞外结构域(SEQ ID NO:25)的重组RSV F蛋白,并在
293F细胞中表达。在第二实例中通过用RSV A2病毒株感染HEp-2细胞来表达天然RSV F蛋
白(SEQ IDNO:1629)。
示于SEQ ID NO:1630)的RSVA2F基因(SEQ ID NO:21)。改造RSV A2F基因以包含Kozak序列(SEQ ID NO:21的核苷酸7-16)、c-myc序列(SEQ ID NO:21的核苷酸1600-1629)和6X-His
标签(SEQ ID NO:21的核苷酸1645-1662)。此外,分别在5’和3’端改造NheI(SEQ ID NO:
22)和HindIII(SEQ ID NO:23)限制性位点以允许克隆入表达载体。利用标准分子生物学
TM
技术消化DNA,并连接入类似地消化的哺乳动物表达载体pcDNA 3.1/myc-His(-)C(SEQ ID
NO:24,Invitrogen)。将包含RSV A2 F基因的载体转化入电转感受态(electrocompetent)XL1-Blue细胞(Strategene)。选择单菌落并使其生长,并纯化质粒DNA。通过DNA测序来
证实在分离载体中RSV A2 F基因插入的存在,并将含有所述插入的一个克隆用于产生DNA
的大规模制备物(Megaprep kit,Qiagen)。
F蛋白。简言之,将3x10 个细胞用30μg的RSV A2F/pcDNA3.1/myc-His(-)C质粒DNA和
5μg的pAdVAntage(Promega)共转染,并在37℃下温育72hr。将细胞通过离心沉淀,并且
7
每3x10RSV F-转染的-293-F细胞加入3mL冷裂解缓冲液(300mM NaCl、50mMNaH2PO4、1%
TM
Triton X-100、Complete Protease Inhibitor cocktail (Cat.No.sc-29131,Santa Cruz),pH 8)。将混合物在4℃下摇动30min,然后以14,000rpm在4℃下离心30min。将澄清上清
液转移至新管中,并冷冻于-80℃直至使用。在于ELISA板上捕获之前,将上清液解冻,短暂离心,并用1∶1v/v的包含0.8%脱脂奶粉的PBS稀释(终浓度为0.4%脱脂奶粉)。
1%L-谷氨酰胺和1%pen-Strep),将HEp-2细胞接种于10层细胞培养架中,并在37℃和
5%CO2中温育。一旦细胞达到80%汇合,将HEp-2单层用RSV A2病毒(ATCC VR-1540)以
0.01-0.1的感染复数(MOI)感染。将感染的细胞培养3-5天,直至观察到明显的细胞合胞
体。将感染的细胞用PBS洗涤一次,并通过向培养架加入500mL PBS和5mM EDTA并在37℃
7
下温育1hr来收获细胞。将细胞收集入50mL锥形管(5x10 个细胞/管),并通过离心沉淀。
将细胞沉淀用PBS洗涤2X,并以1200rpm离心5分钟。将细胞沉淀保存在-20℃下,直至进
一步加工。将冷冻的细胞解冻,并向每个细胞沉淀加入3mL冷裂解缓冲液(300mM NaCl,50mM TM
NaH2PO4,1%Triton X-100,Complete Protease Inhibitor cocktail(Cat.No.sc-29131,Santa Cruz),pH 8)。将细胞在4℃下摇动30min,然后超声处理(每次10%功率下3次脉
冲10秒),最后于4℃下以14,000rpm离心30min。将澄清上清液转移至新管中,并冷冻
于-80℃下直至使用。在捕获于ELISA板上之前,将上清液解冻,短暂离心并1∶2000稀
释。
用1xPBS中的4%脱脂奶粉于37℃下封闭2小时。加入裂解酶之前,将平板用包含0.05%
Tween-20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤。通过向抗RSV mAb ELISA平板每孔加入50μL任何
上文制备的裂解物并在37℃下温育2小时来进行RSV F蛋白(重组或天然)的捕获。
cat.#130-042-401)从供体PBMC分离3.2x10 个CD22+B细胞。在48孔板中,将分离的
6
CD22+B细胞以1x10 个细胞/孔在RPMI(Hyclone,cat.#SH30096.01)培养,所述RPMI包含
10%热灭活的低IgG胎牛血清(FBS,Invitrogen,cat.#16250-078)、1%抗生素(Hyclone,cat.# SV30010)、1%丙酮酸钠(Hyclone,cat.# SH30239.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.#SH30034.01)。选择多克隆B细胞刺激剂激活分离的B细胞以诱导增殖和抗体产生。
555778)和4μL的缀合FITC的抗IgA(Jacksons Immunoresearch,cat.309-096-043)抗体
温育15分钟。将细胞在PBS(包含0.5%BSA和2mM EDTA)洗涤1X,并再悬浮于90uL的相同
缓冲液中。根据生厂商的说明书,利用10μL抗FITC磁珠(Miltenyi,cat.# 130-048-701)
和LS柱(Miltenyi,cat.# 130-042-401),通过负选择表达IgM、IgD、IgA的细胞来富集
IgG+B细胞。
No.VR-1492,来自B95-8细胞)将1.87x10 个IgG+、CD22+富集的B细胞温育16小时来进行
B细胞的大量(bulk)永生化。感染后,将细胞洗涤,并在RPMI(Hyclone,cat.# SH30096.01)
6 6
中和0.5x10 个辐照的饲养细胞/24孔板的孔进一步培养9天(两孔中每个10/mL),所述
RPMI包含10%热灭活的低IgG胎牛血清(FBS,Invitrogen,cat.# 16250-078)、1%抗生素
(Hyclone,cat.# SV30010)、1%丙酮酸钠(Hyclone,cat.# SH30239.01)和1%L-谷氨酰胺(Hyclone,cat.# SH30034.01)、200IU/ml rhIL-2(R&D Systems Cat.# 202-IL-50)。
Cancer Center),并利用抗CD19磁珠(Miltenyi Biotec,Cat.No.130-050-301)和LD柱
(Miltenyi Biotec,cat.# 130-091-509)去除B细胞。简言之,将获得自Ficoll分离的冷冻和辐照的PMBC解冻,洗涤两次并计数。然后将细胞以300g离心10分钟,并吸出上清液。将
7
细胞沉淀以每10 个细胞重悬浮于80μl MACS缓冲液(包含0.5%BSA和2mMEDTA的PBS)
7
中,并加入20μl CD19微珠(每10 个细胞)。完全混合后,将细胞在4℃下温育15分钟。
7
然后通过加入1-2mL缓冲液(每10 个细胞)洗涤细胞,然后以300g离心10分钟,并吸出
8
上清液。然后将至多10 个细胞重悬浮于500μl缓冲液中。磁分离通过将LD柱(由磁铁
球组成,其覆盖有塑料涂层以允许快速和温和地分离细胞)置于MACS分离器的磁场中来进
行。将LD柱用2mL缓冲液洗涤,并将细胞悬浮液应用于柱的顶端。在添加2x1mL缓冲液后,
当非B细胞通过柱时进行收集。
液用于ELISA以确定哪些细胞产生能够结合RSV F蛋白的抗体。简言之,如下进行ELISA:
(1)如实施例1所述,利用96孔半面积板制备RSV F蛋白ELISA板,并且进行以下改变:将
抗RSVmAb(克隆2F7,小鼠腹水,Cat.No.ab43812,Abcam)用作捕获抗体,并且将RSV F蛋白和所述捕获抗体在4℃下温育过夜。(2)将来自2孔的每一个的10μL B细胞上清液(总共
20μL混合)加入96半孔ELISA板,并在37℃下温育2h。将来自血库供体的血浆(Ficoll
Hypaque分离后收集并冷冻,1∶1000稀释)用作阳性对照。(3)如上文所述将平板洗涤
4X,并向每孔加入50μL山羊抗人Fc IgG HRP-缀合的抗体(在包含0.05%Tween20的PBS
中1∶1000稀释),并将平板在37℃下温育1小时。(4)如上文所述将平板洗涤6X,并利
用50μL的∶1v/v TMB:过氧化物溶液(Pierce,Cat No.34021)底物显影,并且使得显影7
分钟。通过加入50μL 2N H2SO4立即停止反应,并利用ELISA酶标仪测量450nm的吸光度。
阳性结合由大于0.5的OD450(0.5-0.9为中等结合,>1为强结合)和比背景高3倍的应答
指示。
再证实,并用于通过PCR产生抗RSV抗体(下文描述)。
将细胞用70%乙醇(无RNase水中)洗涤;4)DNase处理根据生产商的补充说明书“柱中
(in-column)”进行。RNA洗脱为最终体积26μL。
0.2mL无菌管中合并,在65℃下温育5分钟,然后在冰上温育1分钟。随后,将2μL 0.1mM
DTT、4μL 25mM MgCl2、2μLRT缓冲液、1μL RNaseOut和1μL SuperScript III RT加入该管中,并将反应混合物在50℃下温育50分钟,然后在80℃下温育15分钟。cDNA立即使用或
冷冻于-80℃下长期保存。
方法扩增。然后,利用“重叠PCR”将扩增的重链和轻链基因连接至单盒。
pCALCL(T)-R用作反向引物(见下文表3B)。反应条件如下:
重链,CL为轻链)。
设计为引入SfiI限制性位点(SEQ ID NO:41)。
和反向引物(见下文表7)扩增,从而允许扩增包含轻链-接头-重链的1200碱基对(bp)
的抗体片段。
Kit(Qiagen;Cat.No.28106)纯化为30μl总体积。简言之,将5倍PCR反应体积的PBI缓冲
液加入PCR产物。混合物结合QIA Spin柱,并用PE缓冲液洗涤两次。将样品洗脱为30μl,
并高速离心1.5分钟以洗脱全部30μl。约1μg的重叠产物为每50μl重叠反应的典型收
率。
加入150μl异丙醇,并将样品应用于QiaSpin柱。将柱用缓冲液PE(Qiagen)洗涤两次,并
将样品洗脱于30μl的EB缓冲液(Qiagen)。从约1μg的PCR重叠产物回收约15ng/μl
消化的样品。
mk+)phoA supE44λ-thi-1 gyrA96relA1)。简言之,将1μl连接产物(1/5稀释)加入50μl DH5α,并在冰上温育30分钟。
(100μg/mL)和20mM葡萄糖的LB平板上。将平板在37℃下温育过夜。
或母平板提供补充了100ug/ml羧苄青霉素的500μlSB。使原始平板在30℃下生长过夜,
并使子平板(包含葡萄糖)在37℃下生长过夜。将来自30℃平板的细胞裂解物用于细菌
ELISA(见下文实施例4),并将37℃平板用于mini-prep DNA制备(Qiagen)。
制备Fab抗体的模板的RNA。
T细胞、NK细胞、树状细胞、巨噬细胞、粒细胞和类红细胞)来分离高纯的B细胞。根据生产商的方法,通过利用作为一级标记试剂的生物素缀合的单克隆抗体(生物素-抗体混合物)
和缀合至微球的抗生物素单克隆抗体作为二级标记试剂(抗生物素微球)的混合物来间接
磁性标记非B细胞。然后通过磁性分离从纯的静息B细胞除去非B细胞。
以300g离心10分钟,并吸出上清液。将细胞沉淀再悬浮于40μl MACS缓冲液(每10 个
7
细胞),并加入10μl生物素-抗体混合物(每10 个细胞)。完全混合后,将细胞在4℃下
7
温育10分钟。温育时间段后,加入30μl缓冲液(每10 个细胞)和20μl抗生物素微球
7
(每10 个细胞)。完全混合后,将细胞在4℃下温育15分钟。然后将细胞通过加入1-2mL
7 8
缓冲液(每10 个细胞)洗涤,然后以300g离心10分钟,并吸出上清液。然后将高达10
个细胞再悬浮于500μl缓冲液中。
用于柱的顶端。在添加3x3mL缓冲液后,当未标记的B细胞通过柱时进行收集。
Probes,A-20186),用Alexa Fluor 647标记RSV-F抗原。
定FACSAria的光电倍增器设定和分选参数。将剩余的1.8x10 个细胞用Alexa Fluor 647/
RSV-F标记,终浓度为20nM。加入抗体前15分钟,向样品加入标记的蛋白。CD19和CD27抗
体以1∶20的稀释使用,而IgG抗体以1∶50的稀释使用。加入Alexa Fluor 647/RSV-F
蛋白和抗体后,将管在冰上温育30分钟,随后洗涤两次。单细胞分选利用FACSAria流式
细胞仪(BD Biosciences)进行。标记包括PE-Cy5(抗human CD19)、PE-Cy7(抗人CD27)、
PE(山羊抗人IgG Fcg)、Pacific Blue(小鼠抗人CD3)、FITC(小鼠抗人IgD、小鼠抗人IgM、小鼠抗人IgA和小鼠抗人CD14)、碘化丙啶和Alexa Fluor 647(标记的RSV-F蛋白).
将每种阳性B细胞沉积入96孔板的单独孔中,其包含2μl cDNA反应缓冲液(Superscript
III 10X缓冲液,Invitrogen;Cat No.19090-051)、0.5μl RNaseOUT和7.5μl无菌水。将平板保存于-80℃直至进一步使用。
冻于-80℃下长期保存。
应条件如下:
正向引物(见表10)设计为引入SfiI限制性位点(SEQ ID NO:41)。反应条件如下:
引物(其退火至轻链的5’端,见下文表12)和JH反向引物(其退火至重链的3’端,见下
文表11)扩增,从而允许扩增包含轻链-接头-重链的1200碱基对(bp)的抗体片段。反
应条件如下(接头如上文实施例2所述产生):
加入150μl异丙醇,并将样品应用于QiaSpin柱。将柱用缓冲液PE(Qiagen)洗涤两次,并
将样品洗脱于30μl的EB缓冲液(Qiagen)。从约1μg的PCR重叠产物回收约15ng/μl
消化的样品。
mk+)phoA supE44λ-thi-1 gyrA96 relA1)。简言之,将1μl连接产物(1/5稀释)加入50μl DH5α,并在冰上温育30分钟。转化通过在42℃下热休克45秒,然后在冰上2分钟来进行。
加入0.9mL SOC培养基,并使细胞在37℃下恢复1小时,同时摇动。将细胞平板接种于补充
了羧苄青霉素(100μg/mL)和20mM葡萄糖的LB平板上。将平板在37℃下温育过夜。
40mM葡萄糖(最终20mM)和100μg/ml的羧苄青霉素的500μl SB的另一96孔形式的细
菌平板来产生子平板。向原始或母平板提供补充了100ug/ml羧苄青霉素的500μl SB。使
原始平板在30℃下生长过夜,并使子平板(包含葡萄糖)在37℃下生长过夜。将来自30℃
平板的细胞裂解物用于细菌ELISA(见下文实施例4),并将37℃平板用于mini-prep DNA制
备(Qiagen)。
共3体积的细菌细胞裂解物加入预先涂覆RSVF1裂解物(见上文实施例1)的96孔ELISA
板。将平板在37℃下温育2小时,或者在4℃下温育过夜,然后用洗涤缓冲液(PBS/0.05%
Tween20)洗涤。加入50μL在PBS/3%BSA/0.01%Tween20中1∶1000稀释的山羊抗人
IgGF(ab)-HRP抗体(Jackson Labs Cat.No.109-036-097),并将平板在37℃下温育1小时。
合)和比背景高3倍的应答指示。
阳性对照。作为确定每种细菌细胞裂解物包含完整Fab的阳性对照,将Affinipure山羊抗
人F(ab)2抗体(1μg/ml Jackson Immunoresearch Cat.No.109-006-097)用于涂覆96孔
ELISA板以捕获完整的Fab。这种抗体仅结合IgG抗体的F(ab)部分。然后,利用抗HA过氧
化物酶(Roche,Cat.# 12013819001;细菌表达的Fab具有HA标签)检测Fab表达。将肌动
蛋白(1μg/ml,Sigma Cat.No.A3653)用作Fab结合任何蛋白的阴性对照,并且作为ELISA
反应的阳性对照使用小鼠抗肌动蛋白抗体(1.25μg/ml,Sigma Cat.No.A3853)和山羊抗小
鼠IgG F(ab)-HRP抗体(Santa Cruz Biotech Cat.No.SC3697)。还包括小鼠抗RSV mAb(克
隆2F7,小鼠腹水,Cat.No.ab43812,Abcam)作为结合RSV F蛋白的特异性的阴性对照,因为使用这种抗体来使RSV F蛋白结合至ELISA板,并因此在人抗RSV抗体的筛选期间存在于
ELISA板上。
生为阳性,而88种细胞裂解物中的59种结合RSV F裂解物。证实ELISA表明,76种细胞裂
解物中的72种确实产生Fab,并且初始59种阳性命中中的46种再证实为RSV F裂解物的
结合物。
KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID
NO:5)
TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
EPKSC(SEQ ID NO:1)
YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(S
EQ ID NO:13)
SASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ ID NO:9)
Cocktail,Santa Cruz Biotech,Cat.# sc-29131)的磷酸缓冲盐水(PBS)。向再悬浮的细胞加入溶菌酶(0.2mg),并将混合物在室温下温育15分钟。将细胞通过两个冷冻/解冻循环
裂解。简言之,将再悬浮的细胞冷冻于乙醇/干冰浴中,然后在37℃水浴中解冻。一旦裂
解,将细菌裂解物以18000rpm离心,并将上清液通过0.4微米过滤器过滤和灭菌。
甘氨酸,pH 2.2洗脱,并收集于包含1mL的2M Tris的锥形管中,从而中和洗脱的蛋白。然
后,将洗脱的Fab利用10K MWCO透析盒(Pierce)对4L PBS进行透析。将蛋白在4℃下保
存过夜,然后利用10kDa Amicon Ultra Filter(Millipore)浓缩至1mL的体积。然后,通过ELISA再证实每种纯化的Fab抗体对RSV F裂解物(重组来源,实施例1A)和HEp2裂解物
(天然来源,实施例1B)的结合(见上文的实施例4)。另外,利用实施例6所述的测定,测
试每种纯化的Fab抗体中和RSV的能力。
Fab sc5以剂量依赖性方式结合RSV F蛋白(重组),但仅sc5能够识别纯化的F蛋白(天
然)(见下文表14-15)。
后将混合物加入细胞,并通过本文所述的标准空斑减少测定测量病毒感染。分析抗RSV抗
体中和几种RSV病毒株的能力,包括RSVA2(ATCC Cat.No.VR-1540)、RSV B-wash(ATCC Cat.No.VR-1580,病毒株18537)和RSV B-1(ATCC Cat.No.1400)。
DMEM(HyClone,cat no:SH 30285.01)中,所述DMEM补充了1%L-谷氨酰胺(HyClone,cat no:SH30034.01)和1%青霉素-链霉素溶液(HyClone,cat no:SV30010)。将非洲绿猴肾
细胞维持在5%CO2的37℃培养箱中,并且每周传代两次。
第2天形成细胞单层(>90%汇合)的密度(约1x10 个细胞/孔)平板接种。在第2天,
将每种抗体在简单伊格尔氏基本成分培养基(Eagle’s minimal essential medium,EMEM,ATCC,cat no:30-2003)中系列稀释(测试的最终抗体浓度:20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml和0.006μg/ml)。还将RSV病毒也在简单EMEM中稀释至浓度
3
为2x10pfu/ml(100pfu/50ul),并将110μl稀释的RSV病毒加入110μl每种稀释的抗体,
并通过吹吸混合。对于病毒对照样品,将110μl稀释的RSV病毒加入110μl简单EMEM。
将抗体-病毒或病毒对照混合物在37℃下温育2小时。温育后,将培养基从包含非洲绿猴
肾细胞宿主细胞的24空培养板倒出,然后将100μl预温育的病毒-抗体或病毒对照混合
物转移至每孔。每个测试和对照样品一式三份制备。然后将细胞在37℃下温育1小时,并
每15min进行混合。
后将24孔细胞培养板在37℃(包含5%CO2)下温育约72小时。将细胞板用10%福尔马
林在室温下固定,用ddH2O洗涤10次,并用包含0.05%Tween 20的PBS中的5%脱脂奶粉
(NFDM)在37℃下封闭1小时。
孔加入200μL山羊抗小鼠HRP-缀合的IgG(Pierce,Cat.No.31432,5%NFDM中1∶1000稀
TM
释)。将平板在37℃下温育2hr。将平板用ddH2O洗涤10次,并向每孔加入200μL TrueBlue
过氧化物酶底物(KPL Cat.No.50-78-02)。使平板在室温下显影10min。将平板用ddH2O洗
涤2次,在纸巾上干燥,并计数蓝色空斑的数目。利用Prism(GraphPad)计算ED50(50%中
和的有效稀释)。空斑减少率根据下式计算:
率。结果表明,Fab 58c5能够中和RSV的所有3种病毒株,而Fab sc5仅中和RSV A2和RSV
B-1,虽然以高得多的抗体浓度。基于中和测定中获得的数据和Fab 58c5片段的分子量(约
50kDa),Fab 58c5体外中和RSV的EC50据估计为约320pM。
重链扩增获得400bp片段。另外,产生接头,其允许重链和轻链的重叠。接头还包括标准重链恒定区。重链和轻链的重叠获得每种抗体的2.1kB盒,其在两端均具有SfiI限制性位点
(SEQ ID NO:41)。将每种盒用SfiI消化,并克隆入pCALM载体。证实细菌中的正确序列后,利用Maxi Prep Kit(Qiagen)分离用于哺乳动物转染的DNA。
产生IgG达72小时。转染后72小时,收获细胞培养基,离心除去细胞,并通过0.4微米过
滤器单元过滤灭菌。利用蛋白A柱,通过柱层析进行纯化。将包含表达的IgG的过滤的培
养基通过蛋白A柱两次。用50mL的PBS洗涤后,将IgG用9mL的pH 2.2的0.2M甘氨酸洗
脱,并收集在2M Tris中以进行中和。将洗脱物利用10kDa透析盒(Pierce)对4升PBS进
行透析。将样品用10 kDa Amicon Ultra(Millipore)浓缩至1mL。
的结合RSV F蛋白(重组)或RSV F蛋白(天然)裂解物的能力。估计的结合EC50(通过滴
定每种IgG来测定)列于下文的表19。58c5的IgG形式对RSV病毒株A2F蛋白的亲和力
与莫他珠单抗大约相同。
变体(MARM)的能力。MARM是不再被针对其所产生的抗体中和的突变体RSV病毒株。因此,
58c5的IgG形式中和特定MARM的能力表示58c5的结合表位不同于产生MARM所针对的抗
体的结合表位。
21列出各种RSV病毒株和变化抗体浓度的的空斑计数。表22列出各种RSV病毒株和变化
抗体浓度的的空斑减少率。结果表明,58c5的IgG形式能够中和RSV的所有3种病毒株。
基于中和测定中获得的数据和58c5片段的IgG形式的分子量(约150kDa),58c5的IgG形
式的体外中和RSV的EC50据估计为约133pM。莫他珠单抗相应的EC50为360pM。
MARM源自RSV野生型病毒株A2。针对人Fab 19(参见,例如Crowe et al.,Virology,252:
373-375(1998))产生的MARM 19包含异亮氨酸266至甲硫氨酸的氨基酸突变。针对鼠mAb
151产生的MARM151包含赖氨酸272至天冬酰胺的氨基酸突变。针对鼠mAb 1129(其为帕
利珠单抗(SYNAGIS)的亲本抗体)产生的MARM 1129包含丝氨酸275至苯丙氨酸的氨基酸
突变。
24列出变化的抗体浓度的针对各种MARM的空斑减少率。结果表明,IgG 58c5能中和所有
3种RSV MARM。因此,58c5结合的RSV病毒株的表位不同于Fab 19、鼠mAb 1129和鼠mAb
151。
液(PBS/0.05%Tween20)洗涤4x。在PBS/3%BSA/0.01%Tween20中从9μg/mL至
0.0001μg/mL滴定Fab 58c5(测试的实际浓度:9、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001、
0.0003、0.0001μg/mL)。 以0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL 和0.01μg/mL的 固 定浓度加入58c5的IgG形式和莫他珠单抗(如下文的表25所示)。如下文的表26所示,
同时向平板的每孔加入50μL每种稀释的Fab和固定浓度的IgG,一式两份,并且将平板
在37℃下温育2小时,然后用洗涤缓冲液洗涤4x。加入山羊抗人IgGFc-γHRP(Jackson
ImmunoResearch,Cat.No.109-035-098,1∶1000稀释),并将平板在37℃下温育1小时。用洗涤缓冲液洗涤6x后,加入50μL 1∶1v/vTMB:过氧化物溶液(Pierce,Cat No.34021),并允许显影7分钟。通过加入50μL 2N H2SO4立即停止反应,并利用ELISA酶标仪测量450nm
的吸光度。
单抗IgG的浓度之前测定为3.2μg/mL。将RSVA2病毒颗粒(2x10)用莫他珠单抗IgG稀
释物预温育,并将这种混合物用于感染非洲绿猴肾细胞单层(如上文实施例6所述)。选择
具有仍然证实细胞毒性效果的最高抗体浓度的孔进行额外轮的选择。10轮选择后,获得在
8μg/mL的莫他珠单抗的存在下生长的病毒的空斑。在中和测定中测试来自这些空斑的病
毒颗粒(如上文的实施例6所述),并且利用RNeasy提取试剂盒(Qiagen)制备来自阳性颗
粒的RNA。选择6个逃逸突变体,并通过PCR扩增F基因。将DNA测序,并且与亲本RSVA2
病毒株(示于EQ ID NO:1629)相比,所有6个克隆均编码位置272处的谷氨酸对赖氨酸的
单氨基酸取代(K272E,SEQ ID NO:1642)。
珠单抗浓度的CPE的抗体浓度所鉴定的(即>3.2μg/mL),7轮选择后鉴定了莫他珠单抗
逃逸突变体。
的IgG形式的浓度测定为0.8μg/mL。将RSV A2病毒颗粒(2x10)用58C5 IgG稀释物预温
育,并将这种混合物用于感染非洲绿猴肾细胞单层(如上文实施例6所述)。选择具有仍
然证实细胞毒性效果的最高抗体浓度的孔进行额外轮的选择。12轮选择后,获得在2μg/
mL的58c5的IgG形式的存在下生长的病毒的空斑。在中和测定中测试来自这些空斑的病
毒颗粒(如上文的实施例6所述),并且利用RNeasy提取试剂盒(Qiagen)制备来自阳性颗
粒的RNA。选择5个逃逸突变体,并通过PCR扩增F基因。将DNA测序,并且与亲本RSV A2
病毒株(示于EQ ID NO:1629)相比,所有5个克隆均编码3个氨基酸取代(N63K、M115K和
E295G;SEQ ID NO:1643)。
的IgG形式浓度的CPE的抗体浓度所鉴定的(即>0.8μg/mL),10轮选择后鉴定了58c5
的IgG形式逃逸突变体。
29-32。表29列出针对RSV A2亲代病毒的中和的空斑减少率。表30列出针对莫他珠单抗
MARM的中和的空斑减少率。表31列出针对58c5的IgG形式MARM的空斑减少率。表32为
中和数据(ED50值)的总结。
同。如所预期的,在任何测试浓度下,莫他珠单抗不能中和莫他珠单抗MARM。莫他珠单抗强烈地中和58c5的IgG形式MARM,在中和效力上没有不同(见表31)。如所预期的,在任何
测试浓度下,58c5的IgG形式不能中和58c5的IgG形式MARM。结果表明,58c5的IgG形式
中和莫他珠单抗MARM,表示没有竞争。