RNA的分析方法

摘要

本发明涉及从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法，其中，通过下述RNA的分析方法来分析被固定液固定了的组织或细胞的基因的表达信息和/或表达有无，所述RNA的分析方法具有以下步骤：当设对该RNA总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A(％)、对该RNA总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B(％)时，判定该RNA满足下式，式：B/A≤1。

权利要求

1.从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法，该RNA的分析方法具有以下步骤：当设对该RNA总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A％、对该RNA总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B％时，在满足下式的情况下，判定该RNA适于分析，所述适于分析是指在进行利用了RNA与选择结合性物质的分子间相互作用的RNA的分析的情况下，能够正确地测定该样品所保有的信息的状态，式：B/A≤1。

2.根据权利要求1所述的RNA的分析方法，进一步具有以下步骤：判定上述比率A％为

25％以上。

3.根据权利要求1所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA分析以扩增倍率2～20倍扩增所得的扩增产物。

4.根据权利要求2所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA分析以扩增倍率2～20倍扩增所得的扩增产物。

5.根据权利要求1所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA通过非扩增来进行分析。

6.根据权利要求2所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA通过非扩增来进行分析。

7.根据权利要求5所述的RNA的分析方法，上述RNA是miRNA。

8.根据权利要求6所述的RNA的分析方法，上述RNA是miRNA。

9.根据权利要求1～8的任一项所述的RNA的分析方法，上述固定液包含甲醛或低聚甲醛。

10.根据权利要求1～8的任一项所述的RNA的分析方法，对上述被固定液固定了的组织或细胞进行了石蜡包埋或OCT复合物包埋。

11.根据权利要求9所述的RNA的分析方法，对上述被固定液固定了的组织或细胞进行了石蜡包埋或OCT复合物包埋。

说明书

RNA的分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法。

背景技术

[0002] 近年来，对在医院、研究机构等保存有大量样本的、以福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织为代表那样的、被固定液固定了的组织、细胞的基因的分析技术的期待大幅提高。特别是对于FFPE组织，由于积累了过去的大量病患数据，因而如果确立能够从FFPE组织提取基因、分析它们的表达的技术，则能够进行使用长期保存后的组织的可追溯研究，可以对将来的病患的治疗和/或预防做出巨大贡献。

[0003] 然而，认为从FFPE等固定组织、固定细胞中提取出的RNA在一般的固定条件、保管条件下进行分解、片段化，因此难以进行基因表达分析。另外，由于作为固定液最常用的甲醛(福尔马林)，有时RNA-RNA间、RNA-蛋白质间发生交联、和/或甲醛被添加/修饰到RNA上，RNA在这样的状态下难以进行酶反应和/或化学反应，基因表达分析变得困难。因此，要求由进行了分解、片段化的RNA样品、和/或被交联、添加/修饰了的RNA样品进行基因表达分析的技术。另外，在进行这样的RNA样品的基因表达分析时，在分析之前确认RNA样品的分解、片段化、或者交联和/或添加/修饰的程度来判断品质、确认可否分析，对于进行正确的基因表达分析以及miRNA表达分析是非常有用的，要求能够进行这些确认的技术。

[0004] 专利文献1～4中公开了关于扩增分解了的RNA来进行基因表达分析的方法的技术。

[0005] 专利文献1提供与扩增靶多核苷酸、产生其大量拷贝相关的方法、组合物和试剂盒。1次扩增反应中的mRNA的扩增倍数标准达50～100或250倍，或者为500～1000倍或500～2000倍以上，从不足纳克量的总RNA获得尽可能多的扩增RNA。然而，如果使用这样从少量的RNA尽可能多地扩增来分析的方法，则基因的每个扩增倍率产生偏差的所谓扩增偏倚变大，因而可以说不能正确地分析基因的表达量。

[0006] 专利文献2涉及为了全基因表达谱分析而使用例如保管的固定化石蜡包埋组织材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或极度片段化的RNA试样，也能够完全扩增的试样的调制方法。然而，该方法包含将被片段化的RNA进行多聚腺苷酸化的工序，认为该工序中的反应的偏差作为结果可能严重影响基因表达谱。另外在专利文献2中，公开了新的线性RNA扩增法。通过合成5’末端具有锚定序列、且3’末端具有RNA聚合酶启动子序列的双链cDNA，由该cDNA依赖上述RNA聚合酶启动子序列合成cRNA，由该cRNA通过引发上述锚定序列而再次合成cDNA的方法，来扩增从利用激光捕获显微切割、细胞分选仪获得的少量的细胞和/或组织中得到的微量的RNA，从而抑制作为现有的扩增法的问题的、在每次重复cDNA合成-cRNA合成循环时产生的cDNA和cRNA上的mRNA5’相当区的缺失。

[0007] 专利文献1、专利文献2均作为无扩增偏倚的方法记载，认为每1个循环的偏倚与以往相比较小，但由于着眼于由少量的RNA尽可能多地扩增，因而作为扩增倍率相当大。因此，相应地偏倚积累，不可否认结果产生大的扩增偏倚。

[0008] 专利文献3涉及为了全基因表达谱分析而使用例如保管的固定化石蜡包埋组织材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或极度片段化的RNA试样也能够完全扩增的试样的调制方法。然而，该方法包含将被片段化的RNA进行多聚腺苷酸化的工序，认为该工序中的反应的偏差作为结果可能严重影响基因表达谱。

[0009] 专利文献4公开了包含例如分解度等核酸样品中的核酸的品质测定方法的、分解核酸样品中的靶标的扩增用组合物和方法，以及用于从分解RNA样品制成基因表达谱的方法。以来源于同一基因的不同尺寸的扩增子(扩增产物)的扩增效率为标准，随着样品分解，尺寸较大的扩增子的扩增效率降低，由此来评价品质。本方法对于十几种至二十几种基因分别进行多个尺寸的PCR。认为在RNA分解进行的情况下，PCR的探针尺寸越大则越不被扩增，因而可以一定程度确认分解度，但需要对每个RNA样品PCR扩增总共数十种基因，因此认为本方式难以实际进行。

[0010] 专利文献5公开了将以不分解的状态下长链级分所含的RNA的碱基序列为基础设计的分解指标核酸探针装载于核酸阵列，使从总RNA分级出短链而得的RNA样品对该核酸阵列杂交，通过分解指标核酸探针的信号的有无来测定RNA样品的分解度的方法，以及涉及RNA的分解度测定用核酸阵列的技术。然而，认为该核酸阵列限于微小RNA(miRNA)等短链RNA，难以适用于基因表达分析。而且，在从FFPE等的固定组织和/或固定细胞提取RNA的情况下，与从细胞和/或冻结组织提取情况不同，常常不能得到大量的RNA，在这样的状况下，仅用于RNA样品的品质确认就要使用几μg～几十μg这样大量的样品进行实验是不现实的，从成本方面也决不能说是优选的方法。

[0011] 专利文献6中有关于测定核酸的片段化水平的方法的记载。该专利文献的申请人销售分别测定RNA样品所含的2种核糖体RNA(18S、28S)的量，由28S/18S之比来判定能否分析的试剂盒。据说当RNA分解时，首先28S分解，接着18S分解，在该试剂盒中，如果28S/18S为0.1以下，则判定为RNA的品质差。然而，从被固定液固定了的组织、细胞中提取的RNA一般在固定时RNA分解，进而由于固定组织、细胞一般常温保管，随着经年RNA进一步分解。因此，从例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织提取的RNA经常检测不到上述2种核糖体RNA，在以上述基准判定RNA样品的品质的情况下，大半样品被认为不能分析。因此，在使用如上所述的长期保存的固定组织、固定细胞进行可追溯研究时，使用该试剂盒是极为困难的。

[0012] 专利文献7是通过加热处理等使包含分解的mRNA的保管组织中的、与RISC(RNA诱导型沉默复合体)结合而未被分解的miRNA游离，并通过PCR扩增来检测的RNA的谱分析方法。由于在从RISC使miRNA游离时，在95℃这样的高温下处理，因此不能否定由此发生分解的可能性，也谈不上涉及确认RNA的品质的方法。

[0013] 此外，在使用毛细 管电泳系统(例如，Agilent Technologies公司 制“Bioanalyzer(生物分析仪)”)的情况下，作为RNA分解的指标，计算出作为由Agilent Technologies公司所开发的测定基准的RIN(RNA Integrity Number，RNA完整性指数)。RIN是以电泳的RNA样品全体的电泳图谱为基础算出的，其值为0～10的范围(非专利文献1)。Agilent Technologies公司的Bioanalyzer成为评价核酸的品质时一般使用的装置，在使用该装置时，RIN成为显示RNA的品质的一般指标。然而，用Bioanalyzer分析从固定组织、固定细胞提取出的RNA时，即使对于其电泳图谱明显不同、分解行为各异的RNA，RIN的值也在2～3之间基本不变，因此RIN可能未必能够反应实际的RNA的状态。而且，实际情况是，缺乏判断从被固定液固定了的各种组织、细胞提取出的RNA是否是能够供给分析的样本的方法。

[0014] 现有技术文献

[0015] 专利文献

[0016] 专利文献1:特表2006-520603号公报

[0017] 专利文献2:特开2005-224172号公报

[0018] 专利文献3:特表2007-515964号公报

[0019] 专利文献4:特表2008-541699号公报

[0020] 专利文献5:特开2008-35779号公报

[0021] 专利文献6:特开2008-43332号公报

[0022] 专利文献7:特表2009-501531号公报

[0023] 非专利文献

[0024] 非 专 利 文 献 1:Schroeder A,Mueller O,Stocker S,Salowsky R,Leiber M,Gassmann M,Lightfoot S,Menzel W,Granzow M,Ragg T:The RIN:an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements;BMC Molecular Biology7:3(2006)

发明内容

[0025] 发明所要解决的课题

[0026] 在现有技术中，分析从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA时，没有简便且高准确度地判断所提取的RNA是否适于分析的方法，知晓分析所得的数据的有效性是困难的。

[0027] 用于课题的方法

[0028] 鉴于上述课题，本发明者们进行了深入研究，结果发现，在进行从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的基因表达分析时，在分析前对RNA进行电泳，根据电泳图谱来判断是否适于分析，对于判断为适于分析的RNA进行分析，可获得符合本来的RNA的存在量的有效性高的数据，而且可获得再现性高的数据，从而完成了本发明。

[0029] 另外发现，如果在扩增该RNA时，使其扩增倍率为原来的2～20倍，则能够抑制扩增所产生的偏倚，获得符合本来的RNA的存在量的有效性高的数据，而且发现数据的再现性高，从而完成了本发明。

[0030] 即，本发明由以下(1)～(7)构成。

[0031] (1)从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法，该RNA的分析方法具有以下步骤：当设对该RNA总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A(％)、对该RNA总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B(％)时，判定该RNA满足下式，

[0032] 式：B/A≤1。

[0033] (2)根据(1)所述的RNA的分析方法，进一步具有以下步骤：判定上述比率A(％)为25％以上。

[0034] (3)根据(1)或(2)所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA分析以扩增倍率2～20倍扩增所得的扩增产物。

[0035] (4)根据(1)或(2)所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA通过非扩增来进行分析。

[0036] (5)根据(4)所述的RNA的分析方法，上述RNA是miRNA。

[0037] (6)根据(1)～(5)的任一项所述的RNA的分析方法，上述固定液包含甲醛或低聚甲醛。

[0038] (7)根据(1)～(6)的任一项所述的RNA的分析方法，对上述被固定液固定了的组织或细胞进行了石蜡包埋或OCT复合物包埋。

[0039] 发明的效果

[0040] 通过本发明的RNA的分析方法，对于从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA，可以进行正确地反映本来的基因的存在量的分析，特别是在微阵列分析中可获得良好的效果。另外，通过本发明的RNA的分析方法，可以在分析前判定从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA是否适于分析，可以将浪费使用试剂等防患于未然。

附图说明

[0041] 图1显示当设通过Bioanalyzer得到的各种RNA的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A(％)、超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B(％)时，以横轴为A、以纵轴为B/A对各种RNA的数值作图而得的图。

[0042] 图2显示对于各种RNA的RIN和扩增量进行作图而得的图。

[0043] 图3将利用小鼠小脑、肝脏的FFPE组织的微阵列的表达分析进行2次，对于第1次、第2次各自的分析所得的各基因的信号强度，将两者的小脑/肝脏之比进行作图而得的散点图。

具体实施方式

[0044] 以下，更具体地说明本发明。

[0045] 本发明的“被固定液固定了的组织或细胞”，是指通过在称为固定液的溶液中浸渍组织、或者细胞，从而进行用于将生物试样维持在尽可能自然的状态下的处理、即固定处理。这里使用的固定液，优选使用甲醛溶液、低聚甲醛溶液、包含乙醇、甲醇等醇类、丙酮、氯仿等的溶液、包含苦味酸、重铬酸钾等酸的固定液(例如，鲍音固定液、Zamboni固定液、奥尔特氏固定液)、包含乙酸锌、氯化锌、硫酸锌等金属的溶液等。另外，还优选包含乙醇、氯仿、乙酸的卡诺伊固定液、包含甲醇、氯仿、乙酸的Methacarn固定液等、将上述溶液二种以上混合使用。

[0046] 在本发明中，作为上述固定液，更优选使用包含甲醛或低聚甲醛的溶液。甲醛溶液可以使用将市售的福尔马林(甲醛浓度37％)用水稀释而得的溶液，还优选使用将水稀释后的溶液的pH值用碳酸钙、碳酸镁等调节成中性而得的溶液，和/或用磷酸缓冲液稀释而将pH值调节成中性而得的溶液。另外，还可以使用除去了恶臭、刺激性气味、调节了浓度的福尔马林溶液(商品名：マスクドホルム)。此外，甲醛溶液中的甲醛含量优选为1～30％，更优选为2～20％。低聚甲醛溶液可以使用将聚甲醛的粉末用水或磷酸缓冲液等溶解而得的溶液，和/或用水和少量的氢氧化钠溶解后、用磷酸缓冲液等将pH值调节至中性而得的溶液，也可以使用市售的低聚甲醛溶液。其浓度优选为1～10％，更优选为2～8％。

[0047] 另外，上述被固定了的组织或者细胞可以被石蜡包埋。在将被固定了的组织或者细胞进行石蜡包理时，通过本领域技术人员公知的一般方法来操作即可。即，将固定组织或细胞用醇置换而脱水，接着用二甲苯、苯等置换，然后在注入了加热而液化的石蜡的铸模中加入组织、细胞而包埋，制成石蜡块。此外，在从石蜡包埋后的组织、细胞中提取RNA时，使用利用旋转式切片机、滑行式切片机等切片机切成薄片的样品。此时，对薄切片的厚度不特别限定，优选为1～100μm，更优选为2～50μm。此外，可以使用主要用于制作冻结组织切片的OCT(Optimal Cutting Temperature，最佳切削温度)复合物代替石蜡。另外，还优选使用以下方法：将石蜡块切成薄片而得的样品贴合在载玻片等上，使用激光捕获显微切割(LCM)和/或手术刀等从采取成为分析对象的组织的巨型拼合模块等将一部分取出而得的组织中提取RNA。在进行LCM时，为了提高视认性、确实地取出作为分析对象的组织、细胞，还可以将组织、细胞染色。此时，作为色素可利用例如甲酚紫、苏木精-伊红(HE)、核固红(NFR)等。

[0048] 本发明的“从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA”，是从使用上述固定液固定了的组织或者细胞，通过酶消化组织、细胞的蛋白质而提取的RNA，作为该RNA，可列举mRNA、rRNA、tRNA、miRNA，优选为mRNA或miRNA，更优选为miRNA。提取液中有时混入了DNA、蛋白质等杂质，优选提取后进行纯化操作。作为这里使用的纯化方法不特别限定，可列举例如，使用硅胶膜、担载有阴离子交换树脂等的柱的方法，使用逆相色谱法等液体色谱法的方法，使用有机溶剂使RNA沉淀的方法，将浓度高的乙酸铵溶液添加到含RNA的溶液中使RNA选择性沉淀的方法，使用磁珠的方法等。在上述提取、纯化中，适合使用例如，“RecoverAll(トレ一ドマ一ク)Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE”(Ambion公司)、“RNeasy FFPE Kit”(Qiagen公司)、“ISOGEN PB Kit”(ニツポンジ一ン株式会社)、“FFPE RNA Purification Kit”(Norgen公司)、“PureLink(商标)FFPE RNA Isolation Kit”(Invitrogen公司)、“High Pure FFPE RNA Micro”(Roche Applied Science社)、“Agencourt FormaPure(商标)Kit”(Beckman Coulter公司)、“QuickExtract(商标)FFPE Extraction Kit”(Epicentre社)等福尔马林固定石蜡包埋组织用RNA提取试剂盒。

[0049] 从上述被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA由于被固定液成分分解、和/或交联、修饰，因而难以将该RNA供给利用该RNA与能直接或间接地选择性结合的物质(以下也称为选择结合性物质)的分子间相互作用的分析的样品较多，事先判定是否适于分析成为了技术课题，但本发明者发现，如后述的实施例等所示，在从固定组织或细胞中提取出的RNA中，通过确认对该RNA的总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率、和对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率的工序，预先排除成为RNA的分解和/或片段化的指标的分子量小的RNA、和成为交联和/或添加/修饰等的指标的分子量大的RNA的比率多的RNA样品，从而可以判断该RNA是否适于上述微阵列分析。这里所说的“适于分析”，是指在进行利用了RNA与选择结合性物质的分子间相互作用的RNA的分析的情况下，能够正确地测定该样品所保有的信息的状态。如上所述，在将RNA供给分析的情况下，如果分解、片段化的程度大、和/或存在大量交联或者添加/修饰物，则有时与选择结合性物质的分子间相互作用被抑制，而且扩增时得不到充分的扩增量，产生偏倚，作为结果极有可能不能正确地分析。

[0050] 作为在从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA中，确认对该RNA总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率、和对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率的方法，可列举将该RNA以分子量大小来区分并定量各分子量范围中的RNA的存在比例的方法。作为将从被固定了的组织、细胞等中提取出的RNA样品以分子量大小区分并确认分子量分布的方法的电泳的具体例，可列举琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、芯片电泳，但作为定量特定的核苷酸范围中的RNA的存在比例的方法，例如在凝胶电泳的情况下，可列举使用本领域技术人员公知的各种光密度计和/或“Typhoon”(GEヘルスケア社)等的测量将谱带强度数值化的方法，另外在芯片电泳的情况下，在使用“Agilent2100Bioanalyzer”(Agilent Technologies公司)等电泳系统进行时，通过进行专用软件所具有的Smear分析，从而可以适当地求出特定分子量范围中的RNA的存在比例。此外，在将未发生分解的RNA(完整RNA)用电泳进行分析的情况下，据说为约4700核苷酸的核糖体RNA的28S有时显示以比4000核苷酸略小的分子量为峰的谱带。认为这是由于28S的分子中含有较多的双链区，结构变得紧凑，因而在电泳中比实际的分子量泳动速度快。关于该现象，在Agilent Technologies公司主页的FAQ中也可看到同样的记载。因此，在本发明中核糖体RNA的28S实质上包含在电泳中的1000～4000核苷酸的范围内。另外，18S的分子量为1874核苷酸，在电泳中也能在1000～4000核苷酸的范围观察到谱带，因而也包含在该范围中。

[0051] 在本发明中，判断从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA是否适于分析的具体方法是，通过确认相对于对该RNA的总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率A(％)，对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的RNA的重量的比率B(％)较小或相同、即B/A≤1，从而判定是否适于分析的方法。认为包含超过4000核苷酸的RNA的级分中含有产生交联的RNA，它们有时不能与探针杂交，因此在分析比率B大于比率A的RNA样品的情况下，有定量值小于实际存在的mRNA量或者miRNA量的倾向，而且还有时会发现本来表达但不能检测的mRNA或者miRNA。因此，在进行从固定组织或细胞中提取出的RNA的分析之前，通过确认该RNA的B/A是否为1以下，可以迅速判定该RNA是否适于分析。

[0052] 在对应于B/A≤1的RNA的情况下，与从相同组织或细胞提取出的无分解(完整)的RNA的微阵列分析结果相比，可得到较高的相关关系。这里，相关系数是定量地表示2个数据的相互关系的强度的指标，取-1至1之间，如果为正的值则表示正相关，如果使负的值则表示负相关，如果是零则表示无相关。一般地，如果绝对值为0.5以上则可判断为有相关，如果绝对值小于0.5则可判断为无相关，2个数据的相关程度越强，则其绝对值越接近1。此外，在通过“Microsoft Office Excel”(Microsoft公司)求相关系数的情况下，使用称为“correl”的函数即可。在本发明中，在对于确认了在两者中共同表达的基因求信号强度的相关系数的情况下，优选为0.7以上，更优选为0.8以上，进一步优选为0.9以上。

[0053] 进而，相对于从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA的总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率A(％)越大，显示该RNA越接近未分解的完整状态，这时，获得接近完整RNA的基因或者miRNA的表达行为的倾向高。具体地，如果A的比例优选为15％以上，更优选为20％以上，进一步优选为25％以上，则可以更迅速地判断是否是接近完整状态的RNA。

[0054] 进而，相对于从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA的总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率A(％)、与对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的RNA的重量的比率B(％)的和(A＋B)的值(0≤(A＋B)≤100)越小，显示小于1000核苷酸的RNA的重量的比率越大，即分解的RNA越多，但如果分解的RNA多，则特别是在进行短链的miRNA的微阵列分析的情况下，有时发生除本来应杂交的RNA以外的RNA与探针结合的、被称为所谓交叉杂交的现象的可能性变高。这种情况下，有时得到RNA似乎比实际存在量更强烈地表达这样的结果，和/或表达的RNA的数比实际多的结果。
在本发明中，A＋B的值优选为(A＋B)≥15，更优选为(A＋B)≥20，进一步优选为(A＋B)≥25。

[0055] 此外，还优选通过检测从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA所含的特定基因的存在有无，来详细判定该RNA能否分析。通过进行该操作，可能能够以更高比率判定可否分析。这种情况下，通过RNA的逆转录酶反应合成cDNA，以该cDNA为模板通过PCR扩增特定基因，当通过电泳评价该扩增产物时认定了其存在的情况下，判定为可以分析。此外，作为这里所说的特定基因，优选选择被称为持家基因或者内参基因的、理论上在样品间基本没有表达变动的基因，可列举例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、次黄嘌呤核糖基转移酶、胆色素原脱氨酶、磷酸甘油酸激酶、亲环素A、β-葡糖醛酸糖苷酶等。

[0056] 本发明中只要是利用RNA与选择结合性物质的分子间相互作用的分析即可，不特别限定，作为优选的分析工具，可列举微阵列。

[0057] 微阵列是在包含玻璃、陶瓷、硅等无机材料、不锈钢、金(镀)等金属类、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、硅胶等高分子材料的基板上固定化多种选择结合性物质而成的，作为一次检测被固定化的多种选择结合性物质与被验物质的结合的有无和/或被验物质的结合量的分析工具是有用的。作为固定化于微阵列的选择结合性物质，可列举核酸或其他抗原性化合物。核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、互补DNA(cDNA)、互补RNA(cRNA)等。作为其他抗原性化合物，包含低分子化合物。特别优选的选择结合性物质是核酸。这样的选择结合性物质可以是市售的，或者是合成的，也可以是从活体组织或细胞等天然来源调制的。

[0058] 对微阵列不特别限制，作为优选的例子，可以在基板表面具有凹凸部，还可以进一步在凸部的上面设有盖子。此时，盖子优选具备与空隙连通的1个以上贯通孔。该孔用于注入核酸溶液、结合用缓冲液等液体，另外同时也用于将基板内部的压力保持在大气压。贯通孔优选对一个空隙有多个，其中通过为3～6个而使样本溶液的填充容易，因此是特别优选的。此外，对如上所述的盖子的制造方法不特别限定，例如，在树脂的情况下优选使用注射成型法、热压印法、切削的方法等，在玻璃和/或陶瓷的情况下优选使用喷砂法，在硅的情况下优选使用公知的在半导体工艺中使用的方法等。进而，通过在微阵列与盖子之间的空隙中封入微粒，从而在空隙中加入样本溶液并向样本溶液传播振动时，封入的微粒在液体中剧烈地来回运动。其结果是搅拌效率显著提高，带来了杂交的反应促进效果，因此是优选的。这里，对微粒的材质不特别限定，优选使用例如玻璃、陶瓷(例如氧化钇稳定化氧化锆)、金属类(例如不锈钢)、聚合物(例如尼龙、聚苯乙烯)、磁性体等。其中，由于物理、化学上稳定、且比重大，因而优选使用陶瓷的微粒。进而，通过合并使用使基板旋转而使微粒沿重力方向落下的方法、和/或振荡基板的方法、使用磁性微粒通过磁力而使微粒移动的方法等，进一步提高搅拌效率。

[0059] 在本发明中，上述从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA(以下也称为被验物质)可以不扩增(非扩增产物)供给分析，也可以将扩增产物供给分析，可根据被验物质的种类适宜选择。例如在分析miRNA的情况下优选非扩增的分析。另外，在mRNA的分析的情况下，被验物质可以是非扩增产物也可以是扩增产物，但在分析需要防止扩增偏倚的被验物质的情况下，优选非扩增产物或如后述的以扩增倍率2～20倍扩增而得的扩增产物的分析。

[0060] 在分析扩增产物的情况下，作为扩增RNA的方法不特别限制，可以使用由各公司上市的与FFPE对应的扩增用试剂盒。在使用市售的试剂盒的情况下，优选利用例如“ExpressArt FFPE RNA Amplification Kit”(AmpTec公司)、“WT-Ovation FFPE System V2”(NuGen 公 司 )、“Arcturus Paradise Plus Reagent System”(MDS Analytical Technologies公司) 等。另 外，还 优选 使 用“SenseAMP Plus”、“RumpUp”、“RumpUp Plus”(Genisphere公司)合成正义链RNA，由该正义链RNA通过本领域技术人员公知的方法合成反义链RNA。

[0061] 另外，如上所述优选分析以扩增倍率2～20倍扩增而得的扩增产物。认为仅得到扩增倍率不到2倍的扩增产物的RNA，是由于RNA的分解、片段化剧烈、RNA链长非常短，或者由于RNA分子间或者RNA与蛋白质间产生的交联、和/或固定时甲醛等来源于固定液的物质与RNA结合而产生的添加/修饰物的影响，扩增反应被抑制，因此不扩增，或者扩增反应不充分，作为其结果有时不能正确地分析。另外，在扩增产物为超过20倍的扩增倍率的情况下，有时出现分解等的影响较少的RNA容易扩增、另一方面分解相当进行的RNA基本不扩增这样的所谓扩增偏倚显著出现的可能性高。

[0062] 作为扩增产物，可以是通过RT-PCR等获得的DNA，也可以是通过RNA聚合酶等合成的RNA，但在本发明中优选为RNA。另外，在扩增产物为RNA的情况下，可以是正义链RNA也可以是反义链RNA，不特别限定，但现有的微阵列中大部分所担载的探针对应于反义链RNA，因此在使用现有的微阵列的情况下，优选作为反义链RNA扩增。

[0063] 作为使扩增倍率为2～20倍的方法，可列举通过增减用于RNA扩增的酶和/或引物、底物等的浓度来使试剂的组成最适化的方法。另外，还有通过调整反应时间而使扩增倍率为2～20倍的方法。例如，在使用扩增倍率比较大的试剂来扩增从固定组织或细胞中提取出的RNA样品的情况下，比规定反应时间的时间缩短即可。另外，扩增次数优选为1次。如果将扩增反应重复2次以上，则有时即使在通过第1次扩增而扩增产物中产生了少许偏倚的情况下，第2次以后该偏倚也变得明显。这里，为了求溶液中的RNA重量，例如，可以由将RNA溶液使用光路长10mm的比色池用分光光度计测定时的260nm的值和溶液量通过下式A计算。

[0064] 式A：(260nm的值)×40(ng/μL)×溶液量(μL)。

[0065] 此外，为了确认扩增RNA的结果、扩增倍率是否为2～20倍，由使用光路长10mm的比色池通过分光光度计测定时的260nm的值和溶液量通过上式A求出扩增后的溶液的RNA重量，通过下式B计算出扩增倍率即可。

[0066] 式B：(扩增后的RNA重量)/(扩增前的RNA重量)。

[0067] 被验物质优选被本领域技术人员公知的核酸的标记物质进行标记，更优选被荧光标记。在将被验物质进行荧光标记的情况下，荧光标记可以在被验物质与选择结合性物质结合之前进行，也可以在结合之后进行。在被验物质是非扩增产物的情况下，优选为直接标记，作为这里使用的直接标记试剂，可列举例如，“PlatinumBright Nucleic Acid Labeling Kit”(Kreatech公司；荧光色素为Dyomics系列(Dyomics公司))、“ULS(商标)microRNA Labeling Kit”(Kreatech公司；荧光色素为Cy3、Cy5)、“miRCURY LNA(商标)miRNA Power Labeling Kit”(Exiqon公司；荧光色素为Hy3、Hy5)、“FlashTag RNA Labeling Kit”(Genesphere公司；荧光色素为Oyster-550、Oyster-650)等。另一方面，在分析扩增产物的情况下，通过使用在扩增反应时所用的核苷酸-3-磷酸(NTP)(腺苷-3-磷酸(ATP)、鸟苷-3-磷酸(GTP)、胞苷-3-磷酸(CTP)、尿苷-3-磷酸(UTP))的一部分、例如UTP的一部分上添加氨基烯丙基和/或生物素而得的化合物，在扩增产物中导入氨基烯丙基和/或生物素等反应基，从而可以将扩增产物容易地进行荧光标记，因此是优选的。在导入了氨基烯丙基的情况下，容易地与末端具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基的荧光色素进行偶联反应。作为这里所使用的荧光色素，可列举Cy3、Cy5、Hyper5(GEヘルスケア社)、“Alexa Fluor”(注册商标)系列(Molecular Probes社)等。另外，也可以不导入氨基烯丙基等反应基，与非扩增产物同样地，使用将所扩增的RNA进行直接荧光标记的试剂，这时可以优选使用上述的直接标记试剂。

[0068] 被荧光标记后的被验物质被供给至与固定化于微阵列等载体的选择结合性物质的结合反应。作为使被验物质与被固定化于载体的选择结合性物质结合的方法，可采用本领域技术人员公知的方法，特别是在选择结合性物质是核酸的情况下，可以通过本领域技术人员公知的杂交方法使其结合。另外，对于使核酸与选择结合性物质结合时的反应液，采用本领域技术人员公知的组成，特别是在选择结合性物质是核酸的情况下，可以使用本领域技术人员公知的杂交缓冲液。另外，作为检测与固定化于载体的选择结合性物质结合的被验物质的结合的有无、和/或所结合的被验物质的量的方法，可以通过本领域技术人员公知的荧光扫描装置读取标记于核酸的荧光的强度，从而检测、测定。

[0069] 实施例

[0070] 通过以下的参考例、实施例更详细地说明本发明。当然，本发明不限于下述实施例。

[0071] 参考例1

[0072] (RNA的荧光标记操作中的收量确认)

[0073] 在使用“3D-Gene(注册商标)Human 25k chip”(東レ株式会社)进行微阵列分析的情况下，优选可以准备被荧光标记后的反义链RNA(aRNA)1μg。于是，研究了用于获得1μg以上的荧光标记aRNA的条件。将从人胃冻结组织中提取出的RNA使用逆转录酶(“SuperScript(注册商标)III”(Invitrogen公司))合成第一链cDNA，接着添加DNA合成酶合成与第一链DNA互补的第二链cDNA。使用二氧化硅基的柱来纯化合成的cDNA，然后使用T7RNA聚合酶在42℃进行体外转录(IVT)8小时，从而进行aRNA的扩增反应。将该反应进行5次，合成aRNA共计50μg。此外，通过在IVT反应时所用的NTP混合物(ATP、GTP、CTP、UTP)中添加附带了氨基烯丙基(AA)基的UTP(AA-UTP)，从而在合成aRNA中导入AA基。将对合成的AA-aRNA 1μg、2μg、3μg、4μg标记Cy5(GEヘルスケア社)的操作进行各3次。将各样品中的标记后的回收量示于表1。显示在通过微阵列进行全面基因分析时为了获得1μg的荧光标记aRNA，未标记的扩增aRNA为2μg以上即可。

[0074] 表1

[0075]

[0076] 实施例1

[0077] (从固定组织的RNA提取)

[0078] 从人胃组织的FFPE标本32个样本中分别采集10μm厚的薄切片，分别装入1.5mL的管中。在其中加入二甲苯1mL进行搅拌，使石蜡溶解。以16,000×g离心5分钟，然后使用移液器避免吸入组织地除去二甲苯。接着，加入乙醇1mL进行搅拌，以16,000×g离心2分钟，然后用移液器避免吸入组织地充分除去乙醇，将该操作进行2次。在打开管盖的状态下风干约10分钟，除去组织所含的乙醇。添加蛋白酶K溶液(500μg/mL)100μL使组织悬浮，在37℃静置16小时。以16,000×g离心2分钟并除去残渣，然后使用二氧化硅柱纯化RNA。通过分光光度计(サ一モサイエンテイフイツク社、“Nano Drop”(注册商标))测定收量和纯度(260nm与280nm之比)的结果，以及通过“Agilent2100 Bioanalyzer”(Agilent Technologies公司)(以下简称为Bioanalyzer)分别计算1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量比率A(％)和超过4000核苷酸的范围的RNA的重量比率B(％)的结果，以及由各样品的A、B的值求出B/A的结果示于表2和3；横轴取A、纵轴取B/A作图，将B/A≤1的样品作为“○”表示，将B/A＞1的样品作为“×”表示，将所得的图示于图1。

[0079] (RNA的扩增)

[0080] 对于B/A≤1的18个样品，分别由1μg使用逆转录酶(“SuperScript(注册商标)III”(Invitrogen公司))合成第一链cDNA，接着添加DNA合成酶合成与第一链DNA互补的第二链cDNA。使用二氧化硅基的柱纯化所合成的cDNA，然后使用T7RNA聚合酶在42℃进行体外转录(IVT)8小时，进行aRNA的扩增反应。此外，本反应时，与参考例1同样地，使用AA-UTP在扩增aRNA中导入氨基烯丙基。使用二氧化硅基的柱纯化所扩增的aRNA。通过扩增后的收量计算出的扩增倍率如表2所述，全部样品都为2倍以上，可知满足B/A≤1的样品是适合本发明的RNA的分析方法的样品。

[0081] (扩增RNA的荧光标记、断裂)

[0082] 使用离心浓缩机(株式会社トミ一精工、MV-100)浓缩各扩增aRNA溶液至约1μL。在其中添加“3D-Gene(注册商标)Hybridization Buffer”(東レ株式会社)的试剂盒所附带的Sodium Bicarbonate Buffer 5μL通过抽吸搅拌，进一步加入溶解于DMSO的Cy5-NHS(GEヘルスケア社)5μL通过抽吸搅拌，然后在40℃保温1小时，从而进行偶联反应。将各反应溶液使用凝胶过滤离心柱(バイオラツド社)除去未反应的Cy5进行纯化，然后用无核酸酶的水稀释至32μL。在其中分别加入“3D-Gene(注册商标)Hybridization Buffer”(東レ株式会社)的试剂盒所附带的“5×Fragmentation Buffer”各8μL，轻轻抽吸搅拌，在94℃处理15分钟。将各样品用碎冰骤冷3分钟，用“Microcon YM-10”(Millipore公司)纯化。

[0083] (杂交)

[0084] 对于B/A≤1的18个样品，将标记、纯化后的aRNA通过以下操作进行微阵列分析。将包含各1000ng左右的RNA的溶液用无核酸酶水调制成16μL，加入“3D-Gene”(注册商标)Hybridization Buffer(東レ株式会社)的“Hybridization Buffer A”2μL，在95℃热处理5分钟。用碎冰骤冷3分钟，然后加入“Hybridization Buffer B”232μL，平稳地通过抽吸搅拌，调制250μL的样本溶液。将样本溶液在减压下脱气，然后在“3D-Gene(注册商标)小鼠全基因型DNA芯片”(東レ株式会社)中加样210μL。将盖子的4个孔用封条密封，放置于固定在振荡培养箱(东京理化器械株式会社、MMS-210)的桌面上的杂交盒(タカラバイオ株式会社、TX711)中。使盒库内的温度为37℃，一边以250转/分钟旋转进行搅拌，一边反应16小时。

[0085] (荧光信号值的测定)

[0086] 将反应后的芯片洗涤后，通过用扫描仪(3D-Gene(注册商标)Scanner(東レ株式会社))测定荧光信号值，从而对有效点数进行计数。其结果如表2所示，是有效点数一样多的结果。而且，对于从同一组织的冻结样品中提取出的RNA进行同样的实验，对于与来源于各FFPE标本的RNA相同的有效点计算出相关系数。这里，相关系数是定量地表示2个数据的相互关系的强度的指标，取-1至1之间，如果是正的值则表示正相关，如果是负的值则表示负相关，如果是零则表示无相关。一般地，如果绝对值为0.5以上则可判断为有相关，如果绝对值小于0.5则可判断无相关，2个数据的相关程度越强，其绝对值越接近1。此外，在用“Microsoft Office Excel”(Microsoft)求相关系数的情况下，使用称为“correl”的函数即可，在本实施例中也使用该软件。各样品中的相关系数如表2所示，在全部样品中，确认了与来源于冻结组织的RNA的高的正相关关系。

[0087] 比较例1

[0088] 对于B/A＞1的14个样品，分别从1μg中与上述同样地作为氨基烯丙基化aRNA(AA-aRNA)进行扩增。根据扩增后的收量计算出的扩增倍率如表3所示，不足2倍的样品是大多数，给RNA的标记化带来了障碍。即可知，B/A＞1的样品难以以高的准确率供给RNA的分析。

[0089]

[0090]

[0091] 实施例2

[0092] (从FFPE的RNA提取)

[0093] 如表5准备制成条件、保存时间不同的小鼠(7周龄、雄、Slc：ICR)小脑、肝脏的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块。从各FFPE块使用切片机分别采集10μm厚的薄切片10片，在1.5mL的管中各放入5片。在其中加入二甲苯1mL并用旋涡混合器搅拌10秒，使石蜡溶解。以16,000×g离心5分钟，然后使用移液器密切注意避免吸入组织地除去二甲苯。接着，加入乙醇1mL，用旋涡混合器搅拌10秒，以16,000×g离心2分钟，然后用移液器密切注意避免吸入组织地除去乙醇，重复该操作。打开管盖风干约10分钟，除去组织中所含的乙醇。添加蛋白酶K溶液(500μg/mL)100μL使组织悬浮，在37℃静置16小时。以16,000×g离心2分钟使残渣沉淀除去，然后使用二氧化硅柱纯化RNA。用分光光度计(サ一モサイエンテイフイツク社、“Nano Drop”(注册商标))测定收量和纯度(260nm与280nm之比)的结果，以及用Bioanalyzer计算1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量比率A(％)和超过4000核苷酸的范围的RNA的重量比率B(％)的结果，以及B/A的值分别示于表4的(a)和(b)。

[0094] (RNA的扩增)

[0095] 将各RNA样品1μg与实施例1同样地作为氨基烯丙基化aRNA(AA-aRNA)扩增。此时，对于分别从小鼠小脑、肝脏的冻结组织提取出的RNA也同样地进行扩增。将由扩增后的收量计算出的扩增倍率示于表4。与B/A≤1的样品全部扩增倍率为2倍以上相对，B/A＞1的样品的扩增倍率不足2倍。

[0096] (荧光标记、断裂)

[0097] 对于上述2倍以上扩增而得的aRNA，与实施例1同样地进行荧光标记、断裂。标记、纯化后的aRNA的收量示于表4。

[0098] (微阵列分析)

[0099] 将包含各1000ng左右的RNA的溶液用无核酸酶水调制成16μL，加入“3D-Gene(注册商标)Hybridization Buffer”(東レ株式会社)的“Hybridization Buffer A”2μL，在95℃热处理5分钟。用碎冰骤冷3分钟，然后加入“Hybridization Buffer B plus”232μL，平稳地通过抽吸搅拌，调制250μL的样本溶液。将样本溶液在减压下脱气，然后在“3D-Gene(注册商标)小鼠全基因型DNA芯片”(東レ株式会社)中加样210μL。将盖子的4个孔用封条密封，放置在固定于振荡培养箱(东京理化器械株式会社、MMS-210)的桌面的杂交盒(タカラバイオ株式会社、TX711)中。盒库内的温度为37℃，一边以250转/分钟旋转进行搅拌，一边使其反应16小时。

[0100] (荧光信号值的测定)

[0101] 反应后，使分析用芯片的盖子脱离，将基板洗涤、干燥。将上述基板放置在DNA芯片用的扫描仪(Axon Instruments社、“GenePix(注册商标)4000B”)上，在激光器输出33％、光电倍增管的电压设定为500的状态下，测定进行了杂交反应的荧光标记RNA的信号值(荧光强度)、背景噪音。所有点中，1750个为背景荧光值测定用的阴性对照点，从各个信号值扣除背景信号值而计算出各点的真的信号值。这里，将真的信号值为正的情况作为“有效点”。其结果如表4的(a)和(b)所示，有效点数在各样品之间大致是同等的。

[0102] 表4

[0103] (a)

[0104]

[0105] (b)

[0106]

[0107] 参考例2

[0108] 对于将从小鼠小脑、肝脏、肾脏和大鼠小脑、肝脏的FFPE中与实施例1同样地分别提取出的RNA用Bioanalyzer在电泳后计算出的RIN、和由各RNA样品1μg进行扩增时的收量的关系，归纳于图2以及表5的(a)～(c)中。其结果是RIN与收量的关系中未见相关关系。而且，也有一部分样品不能计算出RIN(在表5中表示为“N/A”)。由此显示，在从以FFPE为代表的固定组织和/或固定细胞中提取出的RNA的情况下，通过RIN判定这些RNA是否是适于RNA的分析的样品是困难的。

[0109]

[0110] 实施例3

[0111] (从固定组织的RNA提取)

[0112] 对于制成条件、保存时间不同小鼠(7周龄、雄、Slc：ICR)，用10％中性缓冲福尔马林如表6准备肝脏的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块(样品(A)～(D))。从各块使用切片机分别采集10μm厚的薄切片各2片，放入1.5mL的管中。加入二甲苯1mL搅拌，使石蜡溶解。以16,000×g离心5分钟，然后使用移液器避免吸入组织地除去二甲苯。接着，加入乙醇1mL搅拌，以16,000×g离心2分钟，然后用移液器避免吸入组织地充分除去乙醇，将该操作进行2次。在打开管的盖的状态下风干约10分钟，除去组织中所含的乙醇。添加蛋白酶K溶液(500μg/mL)100μL使组织悬浮，在37℃静置16小时。以16,000×g离心2分钟除去残渣，然后使用二氧化硅柱纯化RNA。用分光光度计(サ一モサイエンテイフイツク社、“Nano Drop”(注册商标))测定RNA的收量和纯度(260nm与280nm之比)的结果，以及用Bioanalyzer计算000～4000核苷酸的范围的RNA的重量比率A(％)和超过4000核苷酸的范围的RNA的重量比率B(％)的结果，以及B/A，A＋B的值示于表7。此外，作为对照，使用从小鼠(7周龄、雄、Slc：ICR)肝脏的新鲜冻结组织中提取出的RNA。

[0113] (RNA的荧光标记)

[0114] 对于从与实施例1同样的小鼠肝脏FFPE中用同样的方法提取出的RNA，使用“miRCURY LNA microRNA Array Power Labeling kit”(EXIQON公司)，按照试剂盒的方案，将各RNA 500ng进行CIP处理，然后通过酶反应标记Hy5色素。

[0115] (微阵列分析)

[0116] 在包含各500ng左右的标记RNA的溶液中加入无核酸酶水，调制成15.4μL，分别加入“3D-Gene(注册商标)miRNA Hybridization Buffer”(東レ株式会社)的Block Reagent 0.6μL、miRNA Hybridization Buffer 105μL混合，在减压下脱气，然后在“3D-Gene(注册商标)小鼠miRNA芯片”(東レ株式会社)中加样110μL。将盖子的4个孔用封条密封，放置在固定于振荡培养箱(东京理化器械株式会社、MMS-210)的桌面上的杂交盒(タカラバイオ株式会社、TX711)中。盒库内的温度为32℃，一边以250转/分钟旋转搅拌，一边反应16小时。

[0117] 反应后，使芯片的盖子脱离，将基板洗涤、干燥。在DNA芯片用的扫描仪(Axon Instruments、“GenePix(注册商标)4000B”)上放置上述基板，在激光器输出33％、光电倍增管的电压设定为500的状态下测定进行了杂交反应的荧光标记RNA的信号值(荧光强度)、背景噪音。在所有点中，24个为背景(BG)信号值测定用的阴性对照点，从各个点的信号值中扣除BG信号值而计算出各点的真的信号值。这里，将真的信号值为正的情况作为“有效点”。其结果如表7所示，在B/A≤1的样本中，有效点数与对照几乎同等或略多。另一方面，在B/A＞1的样本中，有效点数比对照少，启示存在不能检测的miRNA。因此显示，通过B/A的值可以判定可否分析。

[0118] (与从冻结组织中提取出的RNA的数据比较)

[0119] 进而，对于从同一组织的冻结样品中提取出的RNA进行同样的实验，对于与来源于各FFPE标本的RNA共同的有效点计算相关系数，将结果示于表7。B/A≤1时，确认了与来源于冻结组织的RNA的高的正相关关系。进而，B/A≤1且A为25％以上的样品(C)，与同一组织的新鲜冻结样品的相关为0.9以上，显示相关非常高。因此显示，通过B/A的值，可以事先判断可否分析。

[0120] 表6

[0121]样品 (A) (B) (C) (D)
固定时间(天) 2 2 2 14
保存温度 室温(20～25℃) 室温(20～25℃) 室温(20～25℃) 冷藏(4℃)
保存时间(月) 36 12 6 3

[0122] 表7

[0123]

[0124] 实施例4

[0125] (微阵列的制作)

[0126] 使用作为公知的方法的LIGA(光刻电镀成型，Lithographie Galvanoformung Abformung)工艺，制作注射成型用的模具，通过注射成型法来获得具有如后所述的形状的PMMA制的基板。此外，该实施例中使用的PMMA的平均分子量为5万，PMMA中以1重量％的比例含有炭黑(三菱化学株式会社、＃3050B)，因而基板是黑色的。测定该黑色基板的分光反射率和分光透射率，结果分光反射率在可见光区(波长为400nm～800nm)的任一波长下均为5％以下，另外，在同范围的波长下透射率为0.5％以下。分光反射率、分光透射率在可见光区均无特定的光谱图案(峰等)，光谱是一样地平坦。此外，分光反射率使用担载了适合JIS Z 8722的条件C的照明-受光光学系统的装置(ミノルタカメラ、CM-2002)，测定接受从基板的正反射光时的分光反射率。

[0127] 作为基板，使用外形为纵76mm、横26mm、厚1mm，基板的中央部设有纵39.4mm、横19.0mm、深0.15mm的凹部，该凹部中设有9248个直径0.1mm、高0.15mm的凸部的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)树脂制基板(以下作为“基板A”)。在该基板A中，凸部上面与平坦部上面的高的差(凸部为高的平均值)为3μm以下。另外，凸部上面的高的偏差(最高的凸部上面的高与最低的凸部上面的高的差)为3μm以下。另外，凸部的间距(从凸部中央部至相邻的凸部中央部的距离)为0.5mm。

[0128] 将上述基板A在10N的氢氧化钠水溶液中在70℃的温度下浸渍12小时。将该基板A依次用纯水、0.1N的HCl水溶液、纯水洗涤，使基板表面生成羧基。

[0129] 对如上所述准备的基板A，在以下条件下作为选择结合性物质(探针DNA)固定化正义链寡核苷酸。作为寡核苷酸，使用オペロン社制DNA微阵列用寡核苷酸组“Homo sapiens(Human)AROS V4.0(各60碱基)”。将该寡核苷酸以0.3nmol/μL的浓度溶解在纯水中制成储备溶液。将该储备溶液点(点样)于基板时，用PBS(将8g的NaCl、2.9g的Na2HPO4·12H2O、0.2g的KCl、和0.2g的KH2PO4合并溶于纯水中，稀释至1L，加入盐酸调节至pH值5.5)稀释10倍，使探针DNA的终浓度为0.03nmol/μL，且为了使PMMA制基板表面所生成的羧基与探针DNA的末端氨基缩合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，使其终浓度为50mg/mL。将该溶液使用微阵列点样仪(点样仪)(日本激光器电子、Gene Stamp-II)点样在基板A的全部凸部上面。接着，将点有溶液的基板放入密闭的塑料容器，在温度37℃、湿度100％的条件下保温20小时左右。最后，用纯水洗涤基板，用旋干机离心干燥。

[0130] 对固定化有选择结合性物质的上述基板A，如下贴合盖子。作为盖子，将纵41.4mm、横21mm、厚1mm的PMMA平板通过切削加工制作成盖子。所制作的盖子上设有贯通孔和液面停止用腔。贯通孔的直径为0.8mm，液面停止用腔的直径为2.0mm，设置在盖子的四角。将作为粘贴部件的纵41.4mm、横21mm、宽1mm、厚25μm的双面胶带裁成镶盖子的边缘的尺寸，叠层成厚(空气间隙)为50μm并贴合，然后将该盖子贴合于基板A。

[0131] 对如上所述贴合了盖子的基板A，将直径180μm的氧化锆制微粒120mg封入由基板A与盖子形成的空间部(基板A表面的凹凸结构的凹部)。微粒的封入从盖子的贯通孔进行。将如上获得的分析用芯片用于以下的研究。

[0132] (从固定组织的RNA提取)

[0133] 与实施例3同样地，从制成条件、保存时间不同的小鼠(7周龄、雄、Slc：ICR)肝脏的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块制作薄切片，提取RNA。用分光光度计(サ一モサイエンテイフイツク社、“Nano Drop”(注册商标))测定收量和纯度(260nm与280nm之比)的结果，以及用Bioanalyzer计算1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量比率A(％)和超过4000核苷酸的范围的RNA的重量比率B(％)的结果，以及B/A、A＋B的值示于表8。此外，作为对照，使用从小鼠(7周龄、雄、Slc：ICR)肝脏的新鲜冻结组织中提取出的RNA。

[0134] (RNA的荧光标记)

[0135] 将与实施例3同样地提取出的RNA使用“PlatinumBright(注册商标)Nucleic Acid Labeling Kit”(KREATECH)进行荧光标记。将各RNA 1μg用Nuclease Free Water稀释至16μL，加入ULS试剂和10×labeling solution各2μL，在85℃反应30分钟，对mRNA标记PlatinmBright647色素。使用附带的“KREApure columns”除去未反应的色素。

[0136] (微阵列分析)

[0137] 对于各固定组织所含的mRNA通过以下步骤用微阵列进行分析。在包含各1μg左右的标记RNA的溶液中加入无核酸酶水调制成16μL，分别加入“3D-Gene(注册商标)Hybridization Buffer”(東レ株式会社)的Hybridization Buffer A 2μL、Hybridization Buffer B 232μL混合，在减压下脱气，然后在上述制作的分析用芯片中加样210μL。将盖子的4个孔用封条密封，放置于固定在振荡培养箱(东京理化器械株式会社；MMS-210)的桌面上的杂交盒(タカラバイオ株式会社；TX711)中。使盒库内的温度为
37℃，一边以250转/分钟旋转搅拌，一边反应16小时。

[0138] (荧光信号值的测定)

[0139] 反应后使芯片的盖子脱离，将基板洗涤、干燥。在DNA芯片用的扫描仪(Axon Instruments社、“GenePix(注册商标)4000B”)上放置上述基板，在激光器输出33％、光电倍增管的电压设定为500的状态下测定进行了杂交反应的荧光标记RNA的信号值(荧光强度)、背景噪音。所有点中的32个为背景荧光值测定用的阴性对照点，从各个信号值中扣除背景信号值而计算出各点的真的信号值。这里，将真的信号值为正的情况作为“有效点”。其结果如表8所示，在B/A≤1的样本中，确认了与从新鲜冻结小鼠肝脏组织中提取出的参考RNA相比有效点数的差异小、而且两者的共同有效点中的相关高的倾向。而且，A的值越大，该倾向越显著。另一方面，在B/A＞1的样本中，有效点数比参考RNA少，启示存在不能检测的mRNA。

[0140] (与从冻结组织中提取出的RNA的数据比较)

[0141] 进而，对于从同一组织的冻结样品中提取出的RNA进行同样的实验，对于与来源于各FFPE标本的RNA共同的mRNA有效点计算出相关系数。各样品中的相关系数如表8所示，当B/A≤1时，确认了与来源于冻结组织的RNA的高的正相关关系。而且，对于B/A≤1且A为25％以上的样品(C)，与同一组织的新鲜冻结样品的相关为0.9以上，显示相关非常高。因此显示，根据B/A的值可以判断可否分析。

[0142] 表8

[0143]

[0144] 实施例5

[0145] 从小鼠小脑和肝脏组织的FFPE标本分别制成10μm厚的切片，通过与实施例1同样的方法提取RNA。与实施例2同样地，与小鼠小脑和肝脏的冻结组织中提取出的RNA一起，从RNA1μg进行扩增反应，得到aRNA。RNA的收量、纯度、利用Bioanalyzer得出的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量比率A(％)和超过4000核苷酸的范围的RNA的重量比率B(％)、以及扩增倍率示于表9。将aRNA用Cy3(GEヘルスケア社)标记，与“Gene Expression Hybridization Kit”(Agilent Technologies公司)的杂交缓冲液混合，在“Whole Mouse Genome Oligo Microarray(4×44k)”(Agilent Technologies公司)上杂交40小时。洗涤后，用“Agilent Microarray Scanner”(Agilent Technologies公司)读取DNA微阵列的图像，用“Feature Extraction Software(v.9.5.3.1)”将各点的荧光信号数值化。其结果如表9所示，显示相关系数高达小脑：0.88、肝脏：0.85。

[0146] 表9

[0147]

[0148] 实施例6

[0149] 使用实施例5所提取的来源于小鼠小脑、肝脏的FFPE的RNA、来源于冻结组织的RNA，与实施例1同样地由各RNA 5μg进行扩增反应得到aRNA。此时，导入生物素基代替氨基烯丙基。扩增倍率示于表10。将生物素化aRNA与规定量的Control Oligonucleotide、20×Eukaryotic Hybridization Controls、2×Hybridization Mix、DMSO、Nuclease-free Water混合，在99℃处理5分钟，然后在45℃处理5分钟。进而，以16,000×g离心5分钟，然后上样到“Affymetrix(注册商标)Mouse Genome 430 2.0 Array”(アフイメトリクス社)中杂交反应16小时。用规定的方法洗涤、染色，然后用“GeneChip(注册商标)Scanner
3000 7G System”(アフイメトリクス社)将各点的荧光信号数值化。其结果如表10所示，与冻结组织相比，FFPE的有效点数倾向于较少，但两者的相关系数为小脑：0.84、肝脏：
0.82，确认了高的相关关系。

[0150] 表10

[0151]

[0152] 实施例7

[0153] (从固定组织的RNA提取)

[0154] 摘取小鼠(7周龄、雄、Slc：ICR)小脑和肝脏，在10％磷酸缓冲福尔马林溶液(甲醛4％)中在室温浸渍2天进行固定后，进行石蜡包埋而制作FFPE块。从各FFPE块使用切片机分别采集10μm厚的薄切片，与实施例1同样地提取RNA。用分光光度计(サ一モサイエンテイフイツク社、“Nano Drop”(注册商标))测定收量和纯度(260nmと280nm之比)的结果、以及用Bioanalyzer计算1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量比率A(％)和超过4000核苷酸的范围的RNA的重量比率B(％)的结果、以及B/A的值示于表11。在全部样品中B/A≤1。

[0155] (RNA的扩增)

[0156] 由提取出的小鼠小脑、肝脏的RNA 1μg与实施例1同样地进行扩增，获得了导入有氨基烯丙基的aRNA。用分光光度计(サ一モサイエンテイフイツク社、“Nano Drop”(注册商标))求出收量，计算出扩增倍率，将结果示于表11。在全部样品中扩增倍率在2～20倍的范围内。

[0157] (扩增RNA的荧光标记、断裂、微阵列分析)

[0158] 对于扩增的各aRNA，与实施例1同样地进行荧光标记、断裂，然后通过以下操作进行微阵列分析。将包含各1000ng左右的RNA的溶液用无核酸酶水调制成16μL，加入“3D-Gene”(注册商标)Hybridization Buffer(東 レ株式会社)的“Hybridization Buffer A”2μL，在95℃热处理5分钟。用碎冰骤冷3分钟，然后加入“Hybridization Buffer B”232μL，平稳地通过抽吸搅拌，调制250μL的样本溶液。将样本溶液在减压下脱气，然后在“3D-Gene(注册商标)小鼠全基因型DNA芯片”(東レ株式会社)中加样210μL。将盖子的4个孔用封条密封，放置于固定在振荡培养箱(东京理化器械株式会社、MMS-210)的桌面上的杂交盒(タカラバイオ株式会社、TX711)中。使盒库内的温度为37℃，一边以
250转/分钟旋转搅拌，一边反应16小时。

[0159] (荧光信号值的测定)

[0160] 反应后，使分析用芯片的盖子脱离，将基板洗涤、干燥。在DNA芯片用的扫描仪(Axon Instruments社、“GenePix(注册商标)4000B”)上安装上述基板，在激光器输出33％、光电倍增管的电压设定为500的状态下测定进行了杂交反应的荧光标记RNA的信号值(荧光强度)、背景噪音。在全部点中，1750个为背景荧光值测定用的阴性对照点，由各个信号值扣除背景信号值而计算出各点的真的信号值。这里，将真的信号值为正的情况作为“有效点”。有效点数示于表11。显示同一组织中的有效点数的方差较小。进一步将由小脑、肝脏的各基因的信号的比(小脑/肝脏)制成的散点图示于图3。由该结果显示，2次实验的相关较高。

[0161] 表11

[0162]

[0163] 产业可利用性

[0164] 通过使用本发明的RNA的分析方法，可以获得关于福尔马林固定石蜡包埋组织等、在医院和/或研究机构以极大数量保存的固定组织或细胞的基因的表达增减和/或表达有无的正确的信息，这些信息可以在医药品开发和/或基因检查、基因诊断技术等中广泛地灵活运用。而且，可以事先预见分析困难的样品，从分析对象中排除，从而还可以实现试剂等的成本削减，因此在产业上非常有用。