诺卡胺在制备抗老年痴呆药物中的应用转让专利
申请号 : CN201210095447.2
文献号 : CN102657644B
文献日 : 2013-12-18
发明人 : 袁干军 , 苏秋玲 , 庞会忠 , 潘微薇 , 杨慧
申请人 : 江西农业大学
摘要 :
本发明公开了诺卡胺（Nocardamine）在制备抗老年痴呆药物中的应用，实验证明：诺卡胺对Aβ25～35所致老年痴呆模型小鼠的记忆和空间探索能力具有显著的改善作用，并能增强皮层、海马组织中胆碱乙酰转移酶的活性测定；同时，对D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠的记忆和空间探索能力也具有显著的改善作用，且能增强SOD酶的活性，减轻自由基对脑组织的损伤。从而显示：诺卡胺具有显著的抗老年痴呆作用，可应用于制备抗老年痴呆药物，并显示其作为临床抗老年痴呆药物开发的良好市场前景。
权利要求 :
1.诺卡胺在制备抗老年痴呆药物中的应用。
说明书 :
诺卡胺在制备抗老年痴呆药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及诺卡胺（Nocardamine）的用途，尤其涉及在制备抗老年痴呆药物中的用途。
背景技术
[0002] 老年痴呆是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病。多起病于老年期，病程缓慢且不可逆，临床上以智能损害为主，表现为记忆、定向、语言、判断、认知和意欲等功能发生慢性和持续性障碍。随着全球人口老龄化的到来，其发病人数不断增加；我国人口多，且是老年痴呆发病率较高的国家，故抗老年痴呆药物的研发尤为迫切。
[0003] 诺卡胺（Nocardamine）为肽羟肟类化合物，是由3个丁二酸与3个N-羟基戊二胺以肽键的形式聚合而形成的33元环状化合物，并且分子中含有3个羟肟结构，分子式为C27H48N6O9。据报道该化合物具有抗菌活性，尤其是抗四环素耐药菌株的活性，另外还能诱导昆虫BM-N4细胞的形态发生改变等。
[0004] 该 化 合 物 可 由Streptomyces sp. 211726，Streptomyces hygroscopicus var.geldanus，Pseudomonas stutzeri 等多种放线菌发酵产生；同时也可按照文献Keller-Schierlein W, Prelog V. Helv Chim Acta, 1962, 45: 590-595. 或 专 利（US3118823）方法，通过化学合成制备，更可直接从市场上购买获得。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供诺卡胺（Nocardamine）在制备抗老年痴呆药物中的应用。
[0006] 本发明中诺卡胺（Nocardamine）的分子结构如下：
[0007]
[0008] ，化学名为，1,12,23-trihydroxy-1,6,12,17,23,28-hexaazacyclotritriacontane-2,5,13,16,24,27-hexone。
[0009] 本发明所述的诺卡胺（Nocardamine）可由商业购买获得，也可由多种放线菌菌株发酵制备获得，还可通过合成方法制备获得。
[0010] 本发明通过对Aβ25～35所致老年痴呆模型小鼠的Morris水迷宫训练测试及其皮层、海马组织中胆碱乙酰转移酶的活性测定，证明诺卡胺对老年痴呆小鼠记忆和空间探索能力具有显著的改善作用，故可用于制备抗老年痴呆药物，且剂量较大时，其效果优于阳性对照药脑复康。
[0011] 本发明通过对D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠的Morris水迷宫训练测试及其血清中SOD酶的活性测定，还证明诺卡胺对老年痴呆大鼠记忆和空间探索能力具有显著的改善作用，且能增强SOD酶的活性，减轻自由基对脑组织的损伤，剂量较大时，其效果也优于阳性对照药脑复康。
[0012] 本发明选用经典的老年痴呆动物造模方法，复制出老年痴呆模型小鼠和大鼠，并分别给予模型动物不同剂量的诺卡胺干预，均表明：诺卡胺具有显著的抗老年痴呆作用，可应用于制备抗老年痴呆药物。另外还显示：当诺卡胺的剂量为30 mg/kg以上时，其对模型小鼠、大鼠记忆的改善和SOD、ChAT酶活性的增强方面均优于阳性对照药脑复康组，显示其作为临床抗老年痴呆药物的良好市场开发前景。
具体实施方式
[0013] 实施例1：
[0014] 1.1 实验动物及试药
[0015] 实验动物：清洁级健康雄性昆明种小鼠60只，体重26～30 g，购于南方医科大学实验动物中心。
[0016] 试药：诺卡胺（Nocardamine）购于德国Genaxxon BioScience GmbH公司； Aβ25～35购于Sigma公司；ChAT酶测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；脑复康购于湖北华中药业有限公司。
[0017] 1.2 凝聚态Aβ25～35的制备
[0018] 将2 mg Aβ25～35溶于2 mL灭菌生理盐水中, 浓度为1 mmol/L。密封后置于37℃细胞培养箱中孵育96 h, 使其变为凝聚态的Aβ25～35，放在4 ℃冰箱中备用。
[0019] 1.3 小鼠AD模型的制备及给药
[0020] 小鼠用乙醚麻醉后，切除双侧卵巢。手术10 d后，将小鼠随机分为对照组、Aβ25～35组、Aβ25～35 +诺卡胺组Ⅰ和Aβ25～35 +诺卡胺组Ⅱ，每组10只。对照组小鼠侧脑室注射生理盐水。其它组小鼠侧脑室注射1 mmol/L Aβ25～35 5 μL制备AD小鼠模型。模型制备7 d后，对照组与Aβ25~35组小鼠腹腔注射生理盐水5 mL/kg；Aβ25～35 +诺卡胺组Ⅰ和Aβ25～
35 +诺卡胺组Ⅱ组小鼠腹腔分别注射诺卡胺 10 mg/kg、30 mg/kg，连续用药14 d。
35 +诺卡胺组Ⅱ组小鼠腹腔分别注射诺卡胺 10 mg/kg、30 mg/kg，连续用药14 d。
[0021] 1.4 Morris水迷宫训练及测试
[0022] 自给药第8天开始水迷宫训练，共7 d。将特制水迷宫平台放于第4 象限，每只小鼠每天检测2次，排除平台所在象限，在其他3个象限的中间贴壁放入小鼠。以小鼠上台10 s不再下水认为一次测试完成；不能上台的小鼠记录满90 s，并引导小鼠到平台，使其在平台上持续30 s，以强化记忆。摄下小鼠的游泳过程，共记录1周，此为小鼠的学习过程。学习过程结束后1周，撤去平台，测试小鼠的空间探索能力。
[0023] 1.5实验小鼠皮层和海马组织中胆碱乙酰转移酶（ChAT酶）活性的测定[0024] 将小鼠断头取脑，在冰浴上剥离出皮层和海马组织，称重后迅速置于液氮中冷冻。之后加入预冷的磷酸钾缓冲液50 mmol/L，冰浴制成10%组织匀浆，采用ChAT酶测定试剂盒，按照说明书，测定实验小鼠皮层和海马组织中ChAT酶的活性。
[0025] 1.6 统计学分析
[0026] 实验结果以 ±s 表示，采用SPSS 11.0软件包进行方差分析，用t 检验进行各组间的比较。
[0027] 1.7 结果与结论
[0028] 以脑复康作为阳性对照，测定诺卡胺对实验小鼠空间探索能力的影响，其结果（表1）表明：腹腔注射10 mg/kg、30 mg/kg的诺卡胺均能缩短Aβ25～35所致老年痴呆模型小鼠的潜伏期、增加过台次数，且在第一象限逗留时间延长。与模型组比较，均具有显著性差异；与阳性对照脑复康组比较，腹腔注射30 mg/kg 诺卡胺具有显著性差异。显示诺卡胺对Aβ25～35所致老年痴呆模型小鼠的记忆及行为具有明显的改善效果，其中腹腔注射30 mg/kg 诺卡胺的改善效果优于阳性对照药脑复康。
[0029] 表1诺卡胺对实验小鼠空间探索能力的影响（n = 15）
[0030]组 别 剂量/mg·kg-1 潜伏期/s 过台次数/次 t1占t总百分比/t1/t总
对照组 - 22.65±3.72 3.68±0.86 32.56±1.31
Aβ25～35组 - 68.17±13.39 0.49±0.51 14.92±1.96
Aβ25～35+脑复康组 400 29.23±3.25 2.97±0.92 27.85±1.17
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅰ 10 26.58±3.32** 3.12±0.57** 26.95±1.83**
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅱ 30 21.76±3.77**## 4.78±0.86**## 35.48±1.32**##* ** #
对照组 - 22.65±3.72 3.68±0.86 32.56±1.31
Aβ25～35组 - 68.17±13.39 0.49±0.51 14.92±1.96
Aβ25～35+脑复康组 400 29.23±3.25 2.97±0.92 27.85±1.17
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅰ 10 26.58±3.32** 3.12±0.57** 26.95±1.83**
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅱ 30 21.76±3.77**## 4.78±0.86**## 35.48±1.32**##* ** #
[0031] 注：与Aβ25~35组比较，P ＜0.05，P ＜0.01；与Aβ25~35 +脑复康组比较：P##＜0.05，P＜0.01。
[0032] 同时，测定上述实验小鼠皮层和海马组织中胆碱乙酰转移酶活性，其结果（表2）表明：与Aβ25～35组（模型组）和阳性对照脑复康组比较，腹腔注射10 mg/kg、30 mg/kg 诺卡胺均具有显著性差异，显示诺卡胺可显著增强Aβ25～35所致老年痴呆模型小鼠皮层和海马组织中胆碱乙酰转移酶的活性，从而改善老年痴呆的学习记忆功能。
[0033] 表2诺卡胺对小鼠皮层和海马组织中胆碱乙酰转移酶活性的影响（n = 15）[0034]-1 -1
组 别 剂量/mg·kg 胆碱乙酰转移酶活力/U·g
对照组 - 108.39±0.91
Aβ25～35组 - 55.26±0.83
Aβ25～35+脑复康组 400 105.69±0.85
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅰ 10 101.27±0.91**##
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅱ 30 121.32±1.24**##
组 别 剂量/mg·kg 胆碱乙酰转移酶活力/U·g
对照组 - 108.39±0.91
Aβ25～35组 - 55.26±0.83
Aβ25～35+脑复康组 400 105.69±0.85
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅰ 10 101.27±0.91**##
Aβ25～35+诺卡胺组Ⅱ 30 121.32±1.24**##
[0035] 注：与Aβ25~35组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与Aβ25~35 +脑复康组比较：#P##＜0.05，P＜0.01。
[0036] 综上所述和分析均表明：诺卡胺对Aβ25～35所致老年痴呆模型小鼠的具有显著的抗老年痴呆作用和改善记忆功能，故可用于制备抗老年痴呆药物，并显示其在制备抗老年痴呆药物方面具有良好应用和开发前景。
[0037] 实施例 2
[0038] 2.1 实验动物及试药
[0039] 实验动物：老龄健康雄性Wistar大鼠，体重350～390 g，共60只，购于南方医科大学实验动物中心。
[0040] 试药：诺卡胺（Nocardamine）购于德国Genaxxon BioScience GmbH公司；D-半乳糖、AlCl3购于国药集团化学试剂有限公司；SOD酶试剂盒购于南京建成生物工程研究所；脑复康购于湖北华中药业有限公司。
[0041] 复合型老年痴呆动物模型的制备及给药
[0042] 将实验Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、诺卡胺组Ⅰ、诺卡胺组Ⅱ，每组15只。模型组腹腔给予D-半乳糖60 mg/kg（生理盐水配制）和口服给予AlCl3 5mg/kg(双蒸水配制)；诺卡胺组Ⅰ和组Ⅱ，除采用相同的给药途径给予与模型组相同剂量的D-半乳糖和AlCl3外，同时还分别腹腔注射给予诺卡胺 20 mg/kg、40 mg/kg（生理盐水配制）。连续给药90 d。
[0043] 2.3 Morris水迷宫训练及测试
[0044] 自给药第83 d开始按照实例1方法，进行实验大鼠的水迷宫训练，共7 d。学习过程结束后1周，撤去平台，测试大鼠的空间探索能力。
[0045] 2.4 实验大鼠血清中SOD酶活性的测定
[0046] 在完成水迷宫测试后，每组取10只大鼠，用水合氯醛麻醉后，快速开胸，于心脏采血，3500 r.p.m离心10 min后取血清，置-70℃低温保藏。按试剂盒说明书，采用紫外分光光度法测定各组实验大鼠血清中SOD酶的活性。
[0047] 2.5 统计学分析
[0048] 实验结果以 ±s表示，采用SPSS 11.0软件包进行方差分析，用t 检验进行各组间的比较。
[0049] 2.6 结果与结论
[0050] 以脑复康作为阳性对照，测定诺卡胺对实验大鼠空间探索能力的影响，其结果（表3）表明：腹腔注射20 mg/kg、40 mg/kg的诺卡胺均能缩短D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠的潜伏期、增加过台次数，且在第一象限逗留时间延长。与模型组比较，均具有显著性差异；与阳性对照脑复康组比较，腹腔注射40 mg/kg 诺卡胺具有显著性差异。显示诺卡胺对D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠的记忆及行为具有明显的改善效果，其中腹腔注射40 mg/kg 诺卡胺的改善效果优于阳性对照药脑复康。
[0051] 表3诺卡胺对实验大鼠空间探索能力的影响（n = 15）
[0052]组 别 剂量/g·kg-1 潜伏期/s 过台次数/次 t1占t总百分比/t1/t总
对照组 - 22.95±3.32 3.45±0.51 32.59±1.27
模型组 - 63.17±2.71 0.79±0.41 15.96±1.83
脑复康组 400 27.72±3.79 3.05±0.35 27.92±1.25
诺卡胺组Ⅰ 20 27.19±3.28** 3.01±0.42** 26.05±1.35**
诺卡胺组Ⅱ 40 20.17±3.26**## 4.92±0.88**## 37.18±1.12**##
对照组 - 22.95±3.32 3.45±0.51 32.59±1.27
模型组 - 63.17±2.71 0.79±0.41 15.96±1.83
脑复康组 400 27.72±3.79 3.05±0.35 27.92±1.25
诺卡胺组Ⅰ 20 27.19±3.28** 3.01±0.42** 26.05±1.35**
诺卡胺组Ⅱ 40 20.17±3.26**## 4.92±0.88**## 37.18±1.12**##
[0053] 注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与脑复康组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。
[0054] 同时，测定上述实验大鼠血清中SOD酶的活性，其结果（表4）表明：与模型组和阳性对照脑复康组比较，腹腔注射20 mg/kg、40 mg/kg 诺卡胺均具有显著性差异，显示诺卡胺可显著增强D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠血清中SOD酶的活性，减轻自由基对脑组织的损伤，保护脑细胞和组织。