一种口蹄疫疫苗的免疫佐剂及其应用转让专利
申请号 : CN201210131845.5
文献号 : CN102657864B
文献日 : 2014-01-01
发明人 : 邵军军 , 常惠芸 , 丛国正 , 林彤 , 高闪电 , 独军政
申请人 : 中国农业科学院兰州兽医研究所
摘要 :
本发明公开了一种口蹄疫疫苗的免疫佐剂及其应用，属于生物疫苗领域。本发明的一种免疫佐剂为口蹄疫病毒3D蛋白片段。实验证明，表达的3D蛋白片段与抗原配伍后免疫动物，能够加强多表位抗原的免疫原性，产生高水平的保护性中和抗体。体外刺激实验显示，口蹄疫病毒3D蛋白片段单独或与多表位抗原配伍后能够发生淋巴细胞增殖反应，说明本发明的免疫佐剂不仅能够增强免疫反应，并且可用于区分感染和免疫动物，是一种很好的免疫刺激剂和疫苗分子标记。
权利要求 :
1.一种口蹄疫疫苗免疫佐剂，其特征在于所述的免疫佐剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：
12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示。
2.编码权利要求1所述的免疫佐剂的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一种宿主菌，其特征在于含有权利要求4所述的重组表达载体。
6.权利要求1所述的免疫佐剂在制备口蹄疫疫苗中的应用。
7.权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备口蹄疫疫苗中的应用。
8.一种口蹄疫疫苗，其特征在于含有权利要求1所述的免疫佐剂。
说明书 :
一种口蹄疫疫苗的免疫佐剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种疫苗佐剂及其应用，特别涉及一种用于制备口蹄疫疫苗的免疫佐剂及其应用。属于生物疫苗领域。
背景技术
[0002] 口蹄疫作为重大动物疫病严重威胁畜牧业的健康可持续发展，同时也影响动物食品安全以及外贸出口。一旦发病损失重大，影响恶劣。灭活疫苗作为主要防控物质在控制FMD疫情中发挥十分重要的作用，但由于生产此类疫苗需要建设防止病原体逃逸的高级别生物安全生产车间，区分疫苗免疫和自然感染动物。更为严重的是病毒灭活不完全有引起疫苗毒株流行的危险。为此，1991年后欧盟成员国禁止使用灭活疫苗进行疫情防控，美国也禁止在其本国生产和使用灭活疫苗。2001年英国口蹄疫大流行造成的经济损失和影响引起了全世界对口蹄疫防控策略的新讨论。研发安全高效的新型FMD疫苗成为热点问题，而免疫效力低下及免疫持续期短仍然是制约新型疫苗发展的技术瓶颈。因此，如何提升新型疫苗的免疫效力也是当前要解决的主要问题。目前包括水溶性佐剂(氢氧化铝)和油佐剂(ISA206)在内的多种佐剂被用于改善疫苗的免疫效果，但是用于多表位小分子疫苗的效果并不是十分理想。
[0003] 目前对于表位疫苗等小分子疫苗采用增加抗原表位，T细胞表位和引入蛋白载体等多种措施提高疫苗的免疫原性，增强免疫应答能力、提升外周血循环抗体的水平和持续时间，虽然在某种程度上明显提高了抗原的免疫原性，但还是达不到期望的效果。最近研究结果显示，在FMDV进化中高度保守的FMD病毒非结构蛋白3D不仅能与所有血清型的FMDV感染血清发生免疫反应，而且富集大量能被不同猪牛MHC分子等位基因识别的T细胞表位。还发现重组3D蛋白能够诱导细胞免疫应答，提供部分保护性免疫应答反应，即免疫猪经强毒攻击后免疫动物的症状明显减轻，发病时间延迟，但免疫动物血清中检测不到FMDV中和性抗体。
[0004] 本发明研究结果显示，3D蛋白片段与重组表位蛋白联合免疫动物不仅能够改善FMDV特异性抗体滴度，而且能够诱发细胞免疫应答反应。值得一提的是，经本发明表达的3D蛋白N-端蛋白片段不仅发挥了免疫增强作用，而且不与FMDV感染血清发生免疫反应，是一种十分理想的免疫佐剂，添加疫苗后不仅能够增强免疫反应，而且有利于区分感染和免疫动物，是一种很好的免疫刺激剂和疫苗分子标记。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种可用于制备口蹄疫疫苗，增强免疫反应的免疫佐剂；
[0006] 本发明的目的之二在于提供所述的免疫佐剂在制备口蹄疫疫苗中的应用；
[0007] 本发明的目的之三在于提供一种含有本发明所述的免疫佐剂的疫苗。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案达到的：
[0009] 本发明的一种口蹄疫疫苗免疫佐剂，其特征在于所述的免疫佐剂具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列：
[0010] (a)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；或[0011] (b)将SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有口蹄疫病毒非结构蛋白3D功能的蛋白衍生物。
[0012] 在本发明的一个具体实施例中，所述的免疫佐剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示。
[0013] 编码所述的免疫佐剂的核苷酸序列，其特征在于具有以下(a)、(b)或(c)所示的核苷酸序列：
[0014] (a)SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；或[0015] (b)编码SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或
[0016] (c)编码具有口蹄疫病毒非结构蛋白3D功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。
[0017] 在本发明的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示。
[0018] 进一步的，本发明还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。
[0019] 更进一步的，本发明还提供了一种宿主菌，其特征在于含有以上所述的重组表达载体。
[0020] 再进一步的，本发明还提供了所述的免疫佐剂在制备口蹄疫疫苗中的应用。及[0021] 所述的核苷酸序列在制备口蹄疫疫苗中的应用。
[0022] 最后，本发明提供了一种口蹄疫疫苗，其特征在于含本发明所述的免疫佐剂。
[0023] 本发明采用Asia 1型FMD病毒JS/China/05毒株的3D序列作为参考序列设计引物扩增目的基因片段，并表达蛋白。实验证明，表达的3D蛋白片段与抗原配伍后免疫动物，能够加强多表位抗原的免疫原性，产生高水平的保护性中和抗体。体外刺激实验显示，口蹄疫病毒3D蛋白片段单独或与多表位抗原配伍后能够发生淋巴细胞增殖反应，说明本发明的免疫佐剂能够增强免疫反应，并且可用于区分感染和免疫动物，是一种很好的免疫刺激剂和疫苗分子标记。
附图说明
[0024] 图1为3D蛋白不同片段单独或与抗原联合免疫小鼠血清抗体效价测定；
[0025] 图2为淋巴细胞增殖试验结果；
[0026] 图3为体外培养淋巴细胞经FMDV灭活抗原刺激后上清IL-4水平检测结果；
[0027] 图4为体外培养淋巴细胞经FMDV灭活抗原刺激后培养上清中IFN-γ水平；
[0028] 图5为表位疫苗免疫猪体效力试验结果。具体实施方案
[0029] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0030] 实施例1口蹄疫病毒3D蛋白不同片段的制备
[0031] 1、口蹄疫病毒3D蛋白基因的生物信息学分析：
[0032] 口蹄疫病毒非结构蛋白3D是病毒RNA聚合酶，在口蹄疫病毒七个血清型中高度保守，蛋白能与七个血清型病毒感染血清发生免疫反应。3D基因全长为1410个核苷酸，编码一条长为470个氨基酸的蛋白，用DNAStar生物软件对获得的七个血清型46个代表毒株序列分析及GenBank数据库比对，结果显示核苷酸同源性高于90％，氨基酸同源性高于97％，高度保守。本研究采用Asia 1型FMD病毒JS/China/05毒株的3D序列作为参考序列设计引物扩增目的基因片段，并表达蛋白。
[0033] 2、基因克隆及其蛋白表达，纯化
[0034] 用3D蛋白特异性引物扩增3D蛋白基因全长及其3个片段，口蹄疫病毒3D蛋白基因全长核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，扩增3D蛋白基因全长引物，正链引物为5-GGATTGATAGTTGACACCAGAGA-3，负链引物为5-TGCGTCACCGCACACGGCGTTC-3。编码N端片段(以3D1表示)的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，用于扩增N端片段的引物：正链引物3D-1U/BamHI 5′-CCCGGATCC GGATTGATAGTTGACACCAG-3′，负链引物3D-1L/HindIII
5′-CCCAAGCTTTCA TTTCTCCATGAGCTCTAAGGC-3′；编码中间片段(以3D2表示)的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，用于扩增中间片段的引物：3D-2U/EcoRI 5′-CCCGAATTCGCCTTAGAGCTCATGGAGAAA-3′，3D-2L/HindIII
5′-CCCAAGCTTTCAGATGCTTGTTGCGGAACAACCA-3′；编码C端片段(以3D3表示)的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，用于扩增C端片段的引物：3D-3U/BamHI 5′-CCCGGATCCGGTTGTTCCGCAACAAGCATC-3′，3D-3L/1HindIII
5′-CCCAAGCTTTCATGCGTCACCGCAC ACGGCGTT-3′。将获得的目的基因分别插入用相应酶HindIII及BamHI线性化的表达质粒pET-30a(+)(Novagen)中，分别构建相应的重组表达质粒p3DN(含有编码N端片段的核苷酸序列)、p3DM(含有编码中间片段的核苷酸序列)和p3DC(含有编码C端片段的核苷酸序列)。重组表达质粒经测序鉴定后转化BL21(DE3)(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液(kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模化表达重组蛋白，即从LAB平板上挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rpm过夜培养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于37℃培养箱220rpm培养至OD600≈0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG诱导表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g离心20min收集沉淀(4℃)，弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，结果显示表达得到的N端片段(3D1)、中间片段(3D2)、C端片段(3D3)大小均与预期相符。除了3D蛋白N端蛋白片段外，其余蛋白均能与FMDV感染性血清发生免疫反应；所有蛋白均能与抗组氨酸单抗发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性。其中，表达得到的N端片段(3D1)的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，中间片段(3D2)的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，C端片段(3D3)的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
5′-CCCAAGCTTTCA TTTCTCCATGAGCTCTAAGGC-3′；编码中间片段(以3D2表示)的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，用于扩增中间片段的引物：3D-2U/EcoRI 5′-CCCGAATTCGCCTTAGAGCTCATGGAGAAA-3′，3D-2L/HindIII
5′-CCCAAGCTTTCAGATGCTTGTTGCGGAACAACCA-3′；编码C端片段(以3D3表示)的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，用于扩增C端片段的引物：3D-3U/BamHI 5′-CCCGGATCCGGTTGTTCCGCAACAAGCATC-3′，3D-3L/1HindIII
5′-CCCAAGCTTTCATGCGTCACCGCAC ACGGCGTT-3′。将获得的目的基因分别插入用相应酶HindIII及BamHI线性化的表达质粒pET-30a(+)(Novagen)中，分别构建相应的重组表达质粒p3DN(含有编码N端片段的核苷酸序列)、p3DM(含有编码中间片段的核苷酸序列)和p3DC(含有编码C端片段的核苷酸序列)。重组表达质粒经测序鉴定后转化BL21(DE3)(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液(kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模化表达重组蛋白，即从LAB平板上挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rpm过夜培养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于37℃培养箱220rpm培养至OD600≈0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG诱导表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g离心20min收集沉淀(4℃)，弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，结果显示表达得到的N端片段(3D1)、中间片段(3D2)、C端片段(3D3)大小均与预期相符。除了3D蛋白N端蛋白片段外，其余蛋白均能与FMDV感染性血清发生免疫反应；所有蛋白均能与抗组氨酸单抗发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性。其中，表达得到的N端片段(3D1)的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，中间片段(3D2)的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，C端片段(3D3)的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
[0035] 实施例2重组抗原(EoIgG)的制备
[0036] 1、O型口蹄疫病毒VP1基因的生物信息学分析：
[0037] 口蹄疫病毒结构蛋白VP1是病毒的优势抗原，无论是分离纯化的天然VP1蛋白还是重组表达产物都能诱导机体产生保护性中和抗体，具有型特异性。口蹄疫病毒VP1基因全长由639个核苷酸组成，编码一条具有213个氨基酸的蛋白，其主要抗原表位集中在第140-160位的氨基酸和第200-213位的氨基酸区段。本发明用DNAStar生物软件对我国分离的三株猪口蹄疫病毒O型代表毒株(O/China/99，O/Miandian/98，O/ZK/93)进行序列分析，确定了优势抗原表位为O/China/99，O/Miandian/98及O/ZK/93的第135-160位的氨基酸区段，并确定以O/China/99的第200-213位的氨基酸区段为另外一个B抗原表位。
[0038] 2、基因克隆及其蛋白表达，纯化
[0039] 多表位基因的设计及其合成：
[0040] 为了防止在构建基因时出现新表位，在相邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确展示的间隔子序列GGSSGG，多表位基因的串联顺序为O/China/99(135-160)-O/Miandian/98(135-160)-O/ZK/93(135-160)-O/China/99(200-213)，并在基因的5′-端和3′-端分别引入特异性酶切位点如EcoRI和HindIII，多表位基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，多表位基因的核苷酸序列委托大连宝生物公司合成。同时针对多表位基因设计了一条特异性引物扩增合成以进行重复串联，引物为：3PU-BamHI5-cccggatccAAGTATGACGAGAGCCCCGT-3，3PL-EcoRI5-cccgaattcggtggctctagcggcggtCAAAAGCTGTTTCACAGGCG-3。将合成的多表位基因和原核表达载体分别用EcoRI和HindIII酶切，纯化回收后插入用相应酶线性化pET-30a(+)载体(Novagen)，构建重组表达质粒p3FOEN，转化JM109感受态进行阳性筛选，通过序列测定确定阳性重组子。用上述特异性引物以重组表达质粒p3FOEN为模板经PCR扩增多表位基因，扩增的目的基因经BamHI/EcoRI双酶切，纯化回收后插入用相应酶线性化的p3FOEN重组质粒，构建所有表位2次重复的多表位重复表达质粒p3FOEN2，其中两次串联重复多表位基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，。
[0041] 猪IgG重链恒定区基因(PIgG)的PCR扩增：
[0042] 用primer5.0引物软件设计扩增猪IgG重链恒定区基因全长的特异性引物，正链引物：5-AAGACGGCCCCATCGGT-3，负链引物：5-TTTACCCGGAGTCTTGGA-3，获得全长为987kb的目的基因，然后用带有酶切位点的特异性引物pIgGHindIII5-gct ggtggctctagcggcggtGGGCCCTCGGTCTTCATC-3，pIgGxhoI5-cc tcaTTTACCCGGAGTCTTGG A-3对目的基因进行扩增、纯化、回收，其中猪IgG重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，用HindIII/xhoI双酶切后，插入相应酶切线性化的重组表达质粒p3FOEN2构建重组表达质粒p3FOEN2-PIgG，该质粒经酶切、PCR及序列测定为阳性后-20℃保存备用，两次串联重复多表位基因与猪IgG连接基因序列连接后的完整核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0043] 重组蛋白的表达及其生物活性鉴定：
[0044] 将阳性重组表达质粒转化BL21(DE3)(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液(Kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模化表达重组蛋白，即从LAB平板上挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rpm过夜培养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于37℃培养箱220rpm培养至OD600≈0.4～
0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG诱导表达4～6小时，2000rpm离心
30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g离心20min收集沉淀(4℃)，弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白3FOEN2-PIgG大小与预期相符，能与FMDV(O型)感染血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性，表达的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG诱导表达4～6小时，2000rpm离心
30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g离心20min收集沉淀(4℃)，弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白3FOEN2-PIgG大小与预期相符，能与FMDV(O型)感染血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性，表达的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0045] 实施例3、疫苗制备及免疫效力实验：
[0046] 1、疫苗的制备
[0047] 实施例2制备得到的纯化后的重组抗原以及实施例1制备得到的纯化后的3D蛋白的不同片段(3D1\3D2\3D3)分别经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，纯化的3D蛋白片段分别与重组抗原按1∶2(V/V)配置后，加入等体积的油佐剂ISA206(France)乳化成疫苗制剂，按lml/管分装，其中含重组抗原200μg，3D蛋白片段
100μg。
100μg。
[0048] 2、免疫效力试验：
[0049] 用制备的疫苗，按每头份0.5ml经肌肉途径接种豚鼠(100μg抗原+50μg的3D蛋白片段)和按每头份1ml经肌肉途径接种本动物猪(200μg抗原+100μg的3D蛋白片段)免疫实验结果显示，3D蛋白不同片段单独免疫小鼠后，检测不到病毒特异性抗体，重组抗原单独免疫或与3D蛋白不同片段联合免疫小鼠均能诱导FMDV特异性抗体，而且添加3D蛋白的3个片段后能显著增强抗体效价，结果如图1所示。体外刺激实验显示，除了对照样品外，所有的样品经FMDV灭活全病毒抗原刺激后均能发生淋巴细胞增殖反应，结果如图2所示，体外培养淋巴细胞经FMDV灭活抗原刺激后，检测上清中IL-4及IFN-γ的水平，结果分别如图3和图4所示。与单独使用重组抗原相比，加入了3D蛋白的3个片段中的任意一个片段(3D1\3D2\3D3)后，各组疫苗的血清抗体水平明显高于没有添加3D蛋白片段只注射表位抗原的抗体水平，结果如图5所示。
[0050] 3、攻毒试验
[0051] 按照我国口蹄疫疫苗免疫效力试验标准对免疫猪进行攻毒保护试验，即用1000ID50/2ml同源病毒(如O型毒株O/China/99)对加强免疫后14天的动物进行攻击，持续观察10天，结果显示，除了PBS对照动物出现典型的口蹄疫临床症状外(发烧，嘴唇，蹄踵以及鼻镜出现水泡)，所有的免疫动物均未观察到任何临床症状，获得100％保护。说明本发明研制的广谱疫苗具有良好的免疫效力，结果如表1所示。
[0052] 其中O型毒株O/China/99为现有技术中已公开的毒株，该毒株已记载在2009年第01期《病毒学报》题为口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定一文中，作者为吕建亮等。现由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。
[0053] 表1猪O型广谱多表位疫苗免疫猪体后攻毒保护试验结果
[0054]
[0055] 重要的是，免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，提示我们制备的3D蛋白三个片段不仅能起到免疫刺激剂的功效，而且对免疫动物来说是安全的，无害的。