具有比率荧光信号的共轭聚电解质及其制备方法与应用

摘要

具有比率荧光信号的共轭聚电解质及其制备方法与应用，所述共轭聚电解质包含两种以上满足荧光共振能量转移供体和受体关系的生色团，所述生色团通过π－电子共轭相关联。本发明还包括所述具有比率荧光信号的共轭聚电解质的制备方法与应用。本发明之具有比率荧光信号的共轭聚电解质，具有比率荧光信号和共轭聚电解质的优点，抗干扰能力强，灵敏度高，选择性好，适用范围广。

权利要求

1.一种具有比率荧光信号的共轭聚电解质，其特征在于：包含两种以上满足荧光共振能量转移供体和受体关系的生色团，所述生色团通过π－电子共轭相关联，结构式为结构式Ⅰ或结构式Ⅱ：（Ⅰ）

式中: n为聚合度，为1～200的整数；A为荧光单体；B为共轭聚电解质主体，所述共轭聚电解质主体由荧光单体B1、荧光单体B2共聚合而成；

（Ⅱ）

式中: n为聚合度，为1～200的整数；A、 B1、 B2为荧光单体；

所述荧光单体B1为2,7-二碘-9,9-二（6’-（N,N,N,-三甲基铵基）-己基）芴、1,4-二碘-2,5-二丙氧基磺酸钠-苯、4,7-二溴苯并[c][1,2,5]噻二唑、4,7-双(2-溴-5-噻吩基)-2,1,3-苯并噻二唑中的一种或几种；所述荧光单体B2为1,4-二乙炔基苯、1,3-二乙炔基苯、2,6-二乙炔基吡啶、2,5-二乙炔基吡啶、2,7-二乙炔基-9,9-二（6’-（N,N,N,-三甲基铵基）-己基）芴、1,4-二乙炔基-2,5-二丙氧基磺酸钠-苯中的一种或几种；所述式（Ⅰ）中荧光单体A为1-溴芘、1-溴萘、1-溴蒽或8-溴-2-(2-(乙二胺)乙基)-1H-苯并[2,1,9-DEF]异喹啉-1,3(2H)-二酮；所述式（Ⅱ）中荧光单体A为1，6-二溴芘、9，10-二溴蒽或2，6-二溴萘。

2.根据权利要求1所述的具有比率荧光信号的共轭聚电解质在化学生物传感方面的应用。

说明书

具有比率荧光信号的共轭聚电解质及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属分析化学、高分子合成和化学生物传感技术领域，尤其是涉及一种具有比率荧光信号的共轭聚电解质及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 共轭聚合物也称“离域电子聚合物”，其主要结构特征是存在长程π电子共轭体系。共轭聚合物的特殊结构，使其具有许多特异的光电性能。

[0003] 相对于传统的脂溶性共轭聚合物，共轭聚电解质一方面把传统共轭聚合物的光电性质优势（如摩尔吸光系数大、荧光量子产率高以及荧光信号放大效应等）和电解质的水溶性特点结合起来，具有检测简便、灵敏度高、响应快和适用范围广等特点，可用于水等环境友好溶剂以及生命体系中的传感研究；另一方面，正、负电荷的存在也为传感器的设计提供了一种有效的作用手段，可以进一步提高带有相反电荷猝灭剂检测的灵敏度。近年来，共轭聚电解质已被广泛用于蛋白质、DNA、糖类等生物分子以及水环境中金属离子的检测。但由于单波长的荧光信号除了对被检测物有响应外，还可能同时受到激发光的强度、光漂白、探针的浓度、微环境和检测效率等众多可变或难以定量的因素的干扰，这就大大降低了检测的灵敏度和准确度，限制了它们在生物体等复杂环境中应用。

[0004] 比率荧光传感技术是利用两个不同波长的荧光强度比率来进行测定的，可以有效地消除单波长荧光干扰因素的影响，提高检测的灵敏度和准确度，也有效地提高了动态响应的范围。比率型荧光探针的传感机理主要是：分子内电荷转移（ICT）和荧光共振能量转移（FRET)等。FRET探针是以供体生色团的激发波长激发时诱发受体生色团发出荧光。供体和受体的发射光谱能够很好地区分，还可以有效地消除ICT荧光探针中多重激发及光谱重叠对准确性的影响，具有灵敏度高、适用范围广、受环境因素干扰少等特点，因此，在复杂体系中低含量组分的分析检测方面得到了广泛应用。但实现FRET，供体和受体不仅需要满足一定的距离、方向、光谱重叠等要求，而且供-受体之间的相互作用也会受外界条件及微环境的干扰，影响其稳定性和荧光共振能量转移的效率。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种抗干扰能力强，灵敏度高，选择性好，适用范围广的具有比率荧光信号的共轭聚电解质及其制备方法与应用。

[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0007] 本发明之具有比率荧光信号的共轭聚电解质，其特征在于：包含两种以上满足荧光共振能量转移供体和受体关系的生色团，所述生色团通过π－电子共轭相关联，结构式为结构式Ⅰ或结构式Ⅱ：

[0008]

[0009] （Ⅰ）

[0010] 式中: n为聚合度，为1～200的整数；A为荧光单体；B为共轭聚电解质主体，所述共轭聚电解质主体由荧光单体B1、荧光单体B2共聚合而成；

[0011]

[0012] （Ⅱ）

[0013] 式中: n为聚合度，为1～200的整数；A、B1、B2为荧光单体。

[0014] 进一步，所述荧光单体B1可为2,7-二碘-9,9-二（6’-（N,N,N,-三甲基铵基）-己基）芴、1,4-二碘-2,5-二丙氧基磺酸钠-苯、4,7-二溴苯并[c][1,2,5]噻二唑、4,7-双(2-溴-5-噻吩基)-2,1,3-苯并噻二唑等二卤代荧光单体的一种或几种；所述荧光单体B2可为1,4-二乙炔基苯、1,3-二乙炔基苯、2,6-二乙炔基吡啶、2,5-二乙炔基吡啶、
2,7-二乙炔-9,9-二（6’-（N,N,N,-三甲基铵基）-己基）芴、1,4-二乙炔基-2,5-二丙氧基磺酸钠-苯等荧光单体（端基为二乙炔基）的一种或几种；所述式（Ⅰ）中荧光单体A可为1-溴芘、1-溴萘、1-溴蒽或8-溴-2-(2-(乙二胺)乙基)-1H-苯并[2,1,9-DEF]异喹啉-1,3(2H)-二酮等单卤代荧光单体；所述式（Ⅱ）中荧光单体A可为1，6-二溴芘、9，10-二溴蒽或2，6-二溴萘等二卤代荧光单体。

[0015] 本发明之具有比率荧光信号的共轭聚电解质的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：

[0016] （1）混合溶剂的配制及处理：按水的体积:N，N-二甲基甲酰胺的体积:二异丙胺的体积=（1.8～2.2）:（2.8～3.2）:1（优选2:3:1）的比例配制混合溶剂，然后向混合溶剂中通氮气5～15分钟，以除去混合溶剂中的氧；

[0017] （2）在三口烧瓶中，先加入等物质的量的荧光单体B1、荧光单体B2，再加入四三苯基磷钯与碘化亚铜复合催化剂，在氮气氛围下，按混合溶剂的体积: 荧光单体B1的物质的量=（10～20）:0.1的比例向三口烧瓶中加入混合溶剂；在45～65℃反应1～10小时，生成共轭聚电解质B；再向反应液中加入式（Ⅰ）中的荧光单体A，所述荧光单体A加入的量相当于共轭聚电解质B物质的量的2/n~10/n，n为共轭聚电解质B的聚合度；继续反应10～30小时，得到由结构式（Ⅰ）表示的共轭聚电解质；

[0018] 由结构式（Ⅱ）表示的共轭聚电解质的制备方法与由结构式（Ⅰ）表示的共轭聚电解质的制备方法，区别在于：在三口烧瓶中，同时加入等物质的量的荧光单体B1、荧光单体B2和式（Ⅱ）中的荧光单体A，然后加入四三苯基磷钯与碘化亚铜复合催化剂，在氮气氛围下，按混合溶剂的体积:荧光单体B1的物质的量=（10～20）:0.1的比例向三口烧瓶中加入混合溶剂，在45～65℃反应10～30小时；

[0019] （3）离心：待步骤（2）的反应液冷却至室温后，在转速7000～8000 r/min下离心5～10 min；

[0020] （4）沉淀：取离心后的上层溶液，按上层溶液的体积: 丙酮与乙醚的混合溶液的体积=1:（8～14）的比例，将上层溶液加入丙酮与乙醚的混合溶液中，在转速800～1000r/min下搅拌20-40分钟（优选30分钟），至出现暗棕色沉淀物，静置0.5-1.5小时（优选1小时），去除上层清液，取下层浊液在转速7000～8000 r/min下离心5～10min；

[0021] （5）纯化：按步骤（4）所得固体的质量:甲醇的体积=1:（10～15）的比例将固体重新溶解，然后重复步骤（4），得暗棕色沉淀物。

[0022] 进一步，步骤（2），所述复合催化剂，四三苯基磷钯的物质的量:碘化亚铜物质的量=1:（0.9-1.1）（优选1:1），所述复合催化剂用量相当于荧光单体B1的物质的量的5～10%（优选8%）。

[0023] 进一步，步骤(4)，所述丙酮与乙醚的混合溶液，丙酮的体积:乙醚的体积=（70～80）:50（优选75:50）。

[0024] 式（Ⅰ）中所述荧光单体A为1-溴芘、1-溴萘、1-溴蒽时，以其相应的芘、萘、蒽荧光基团作为供体，以共轭聚电解质主体中相应的荧光基团为受体，发生“供体到受体”能量转移；式（Ⅰ）中所述荧光单体A为8-溴-2-(2-(乙二胺)乙基)-1H-苯并[2,1,9-DEF]异喹啉-1,3(2H)-二酮时，以其相应的荧光基团作为受体，以共轭聚电解质主体中相应的荧光基团为供体，发生“供体到受体”能量转移。

[0025] 本发明之具有比率荧光信号的共轭聚电解质，将供体和受体化学交联于同一分子内，可消除被测体系中不确定因素对检测准确性的影响。由于供体和受体能满足荧光共振能量转移，且在分子内发生能量转移，使得该类共轭聚电解质具有比率荧光信号变化，可作为比率荧光探针。

[0026] 本发明之具有比率荧光信号的共轭聚电解质在化学生物传感方面的应用，包括以下3个方面：

[0027] （1）离子的检测：通过在共轭主链和侧链引入识别载体（如联吡啶和单吡啶识别基团等），可实现对金属离子的选择性识别；或通过在侧链引入咪唑基团，可对重金属离子（如2+
Cu ）表现出很好的选择性；

[0028] （2）核酸、蛋白质（抗体和酶）等生物分子的检测：可以利用核酸、蛋白质与某些金属离子之间的特异性作用设计基于对金属离子有选择性识别的比率荧光共轭聚电解质用于这些生物分子的检测；比率荧光共轭聚电解质的电荷可以与相反电荷的DNA等生物分子相互作用引起这类共轭聚电解质的聚集，从而影响比率荧光信号的变化；功能化的胺基、巯基侧链可以很方便的连接单链DNA片段或抗原，实现对互补DNA或抗体的选择性响应；

[0029] （3）在上述共轭聚电解质侧链引入巯基官能团和靶向基团生物素等，可以在细胞成像、癌细胞的定位示踪分析及医疗诊断方面具有潜在的应用价值。

[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下优点:

[0031] （1）灵敏度高：通过共轭聚电解质的荧光信号放大特性与比率荧光检测技术相结合，可有效提高检测的灵敏度；（2）选择性好，抗干扰能力强：在功能化共轭聚电解质识别基团的特异性识别作用下，可提高对目标物的选择性；供体与受体共轭连接于同一分子中，产生的比率荧光信号不易受激发光的强度、光漂白、探针的浓度、微环境和检测效率等众多可变或难以定量的因素的干扰，从而可实现在复杂体系（如生物体）中高灵敏地准确获取化学与生物定量信息；(3)可实现多功能检测：既可通过共轭链主体结构的功能化设计多种识别基团，也可以通过采用不同荧光发射波长的功能荧光基团作为能量转移的供体或受体形成多重FRET的共轭聚电解质，实现多种目标物的检测；（4）实现双通道信号检测：与目标物识别会影响共轭链内的能量转移效率，引起比率荧光信号的变化，与此同时还会产生体系颜色的变化，使这一技术具有溶液颜色变化和荧光比率信号变化的双通道功能；（5）降低成本，扩大应用范围：这种方法不需要对目标物进行荧光标记，可以在一定程度上降低成本，扩大其应用范围。

[0032] 综上所述，基于本发明之具有比率荧光信号的共轭聚电解质的比率荧光探针的构建及化学生物传感技术有望突破现有的共轭聚电解质的传感模式，使复杂体系中的检测方法朝着高灵敏、高选择性、多通道、多功能、准确定量的方向发展。此外，利用本发明，可在医疗诊断、基因突变观测、环境检测以及国家安全防御等方面提供新的物质基础和传感方法。

附图说明

[0033] 图1 是本发明实施例1之阳离子型芘封端聚芴苯乙炔比率荧光共轭聚电解质-对牛血清白蛋白检测的荧光光谱图；

[0034] 图2 是本发明实施例2之阴离子型芘封端聚苯撑乙炔比率荧光共轭聚电解质-对胰蛋白酶检测的荧光光谱图。

具体实施方式

[0035] 以下结合实施例对本发明作进一步说明。

[0036] 实施例1：阳离子型芘封端聚芴苯乙炔比率荧光共轭聚电解质及其制备方法与应用

[0037] 本实施例之阳离子型芘封端聚芴苯乙炔比率荧光共轭聚电解质，结构式如下：

[0038] ，n=36。

[0039] 其制备方法, 包括以下步骤：

[0040] （1）混合溶剂的配制及处理：按水的体积:N，N-二甲基甲酰胺的体积:二异丙胺的体积=2:3:1的比例配制混合溶剂，然后向混合溶剂中通氮气10分钟，以除去混合溶剂中的氧；

[0041] （2）在100mL 三 口 烧 瓶 中 ,先 加 入 0.15 mmol的 2,7-二 碘-9,9- 二（6’-（N,N,N,-三甲基铵基）-己基）芴和0.15 mmol 的1,4-二乙炔基苯,再加入0.012mmol四三苯基磷钯与碘化亚铜复合催化剂，在氮气氛围下，加入25mL的混合溶剂，在55℃反应2小时，生成阳离子型聚芴苯乙炔共轭聚电解质；再向反应液中加入0.02 mmol1-溴芘，继续反应20小时；

[0042] 所述复合催化剂，四三苯基磷钯的物质的量:碘化亚铜的物质的量=1:1；

[0043] （3）离心：待步骤（2）的反应液冷却至室温后，在转速7000r/min下离心5分钟；

[0044] （4）沉淀：取离心后的上层溶液，按上层溶液的体积: 丙酮与乙醚的混合溶液的体积=1:10的比例将上层溶液加入丙酮与乙醚的混合溶液中，在转速900r/min下搅拌30分钟，至出现暗棕色沉淀物，静置1h，去除上层清液，取下层浊液在转速7000r/min下离心5min；

[0045] 所述丙酮与乙醚的混合溶液，丙酮的体积:乙醚的体积=75:50；

[0046] （5）纯化：按步骤（4）所得固体的质量:甲醇的体积=1:15的比例将固体重新溶解，然后重复步骤（4），得最终暗棕色沉淀物。

[0047] 本实施例之阳离子型芘封端聚芴苯乙炔比率荧光共轭聚电解质的应用-对牛血清白蛋白（BSA）的比率荧光检测：

[0048] （1）用甲醇将阳离子型芘封端聚芴苯乙炔比率荧光共轭聚电解质配制成浓度为-3 -61×10 M的储备液，再用二次蒸馏水将所述储备液稀释成浓度5×10 M的稀释溶液；

[0049] （2）将不同浓度的BSA工作液（5ppm，10ppm，15ppm）加入到所述稀释溶液中，测定其荧光发射光谱；通过所述共轭聚电解质的阳离子侧链与BSA的相互作用产生比率荧光信号变化，见附图1。降低了背景干扰，提高了检测的灵敏度。

[0050] 实施例2：阴离子型芘封端聚苯撑乙炔比率荧光共轭聚电解质及其制备方法与应用

[0051] 本实施例之阴离子型芘封端聚苯撑乙炔比率荧光共轭聚电解质，结构式如下：

[0052] ，n=105。

[0053] 其制备方法，包括以下步骤：

[0054] （1）混合溶剂的配制及处理：按水的体积:二甲基甲酰胺的体积:二异丙胺的体积=2:3:1的比例配制混合溶剂，然后向混合溶剂中通氮气10分钟，以除去混合溶剂中的氧；

[0055] （2）在100mL三口烧瓶中，先加入0.15 mmol 的1,4-二碘-2,5-二丙氧基磺酸钠-苯和0.15 mmol 的1,4-二乙炔基苯，再加入0.012 mmol四三苯基磷钯与碘化亚铜复合催化剂；在氮气氛围下，加入25mL的混合溶剂，在60℃反应3小时，生成阴离子型聚苯撑乙炔撑共轭聚电解质；再向反应液中加入0.02mmol1-溴芘，继续反应25小时；

[0056] 所述复合催化剂，四三苯基磷钯的物质的量:碘化亚铜的物质的量=1:1；

[0057] （3）离心：待步骤（2）的反应液冷却至室温后，在7000r/min转速下离心5分钟；

[0058] （4）沉淀：取离心后的上层溶液，按上层溶液的体积: 丙酮与乙醚的混合溶液的体积=1:10的比例将上层溶液加入丙酮与乙醚的混合溶液中，在转速1000r/min下搅拌0.5h，至出现暗棕色沉淀物，静置1h，去除上层清液，取下层浊液在转速7000r/min下离心
5min；

[0059] 所述丙酮与乙醚的混合溶液中，丙酮的体积:乙醚的体积=75:50；

[0060] （5）纯化：按步骤（4）所得固体的质量:甲醇的体积=1:12的比例将固体重新溶解，然后重复步骤（4），得最终暗棕色沉淀物。

[0061] 本实施例之阴离子型芘封端聚苯撑乙炔比率荧光共轭聚电解质的应用-对胰蛋白酶的比率荧光检测：

[0062] （1）用甲醇将阴离子型芘封端聚苯撑乙炔比率荧光共轭聚电解质配制成浓度为-31×10 M的储备液，再用PH=8.38的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液将所述储备液稀释-6
成浓度1×10 M的稀释溶液；

[0063] （2）将不同浓度的胰蛋白酶工作液（10ppm，20ppm，30ppm）加入到所述稀释溶液中，测定其荧光发射光谱；通过所述共轭聚电解质的阴离子侧链与胰蛋白酶的相互作用引起其比率荧光信号的变化，400nm处的发射峰随胰蛋白酶浓度的增大逐渐升高，480nm的发射峰逐渐降低，见附图2。

[0064] 利用阴离子型芘封端聚苯撑乙炔比率荧光共轭聚电解质比率荧光信号变化用于胰蛋白酶的检测，降低了背景干扰，提高了检测的灵敏度。

[0065] 实施例3阴离子型芘封端聚苯撑乙炔-吡啶比率荧光共轭聚电解质及其制备方法与应用

[0066] 本实施例之阴离子型芘封端聚苯撑乙炔-吡啶比率荧光共轭聚电解质，结构式如下：

[0067] ，n=102。

[0068] 其制备方法，包括以下步骤：

[0069] （1）混合溶剂的配制及处理：按水的体积:二甲基甲酰胺的体积:二异丙胺的体积=2:3:1的比例配制混合溶剂，然后向混合溶剂中通氮气10分钟，以除去混合溶剂中的氧；

[0070] （2）在100mL三口烧瓶中，先加入0.15 mmol 的1,4-二碘-2,5-二丙氧基磺酸钠-苯，0.15 mmol 的2,6-二乙炔基吡啶，再加入0.012 mmol四三苯基磷钯与碘化亚铜复合催化剂，在氮气氛围下，加入25mL的混合溶剂，在55℃反应3小时，生成阴离子型聚苯撑乙炔撑-吡啶共轭聚电解质；再向反应液中加入0.02 mmol1-溴芘，继续反应25小时；

[0071] 所述复合催化剂，四三苯基磷钯的物质的量:碘化亚铜的物质的量=1:1；

[0072] （3）离心：待步骤（2）的反应液冷却至室温后，在7000r/min转速下离心5分钟；

[0073] （4）沉淀：取离心后的上层溶液，按上层溶液的体积: 丙酮与乙醚的混合溶液的体积=1:10的比例将上层溶液加入丙酮与乙醚的混合溶液中，在转速800r/min下搅拌0.5h，至出现暗棕色沉淀物，静置1h，去除上层清液，取下层浊液在转速7000r/min下离心
5min；

[0074] 所述丙酮与乙醚的混合溶液，丙酮的体积:乙醚的体积=75:50；

[0075] （5）纯化：按步骤（4）所得固体的质量:甲醇的体积=1:12的比例将固体重新溶解，然后重复步骤（4），得最终暗棕色沉淀物。

[0076] 其应用同实施例2，在此不再赘述。

[0077] 实施例4：阳离子型含蒽聚芴苯乙炔-苯并噻二唑比率荧光共轭聚电解质及其制备方法

[0078] 本实施例之阳离子型含蒽聚芴苯乙炔-苯并噻二唑比率荧光共轭聚电解质，结构式如下：

[0079] ，n=106。

[0080] 其制备方法，包括以下步骤：

[0081] （1）混合溶剂的配制及处理：按水的体积:二甲基甲酰胺的体积:二异丙胺的体积=2:3:1的比例配制混合溶剂，然后向混合溶剂中通氮气10分钟，以除去混合溶剂中的氧；

[0082] （2）在100ml三颈烧瓶中，先加入0.15 mmol 的2,7-二乙炔基-9,9-二（6’-（N,N,N,-三甲基铵基）-己基）芴、0.15 mmol 4,7-二溴苯并[c][1,2,5]噻二唑和0.15 mmol 的1，6-二溴蒽，再加入0.012 mmol四三苯基磷钯与碘化亚铜复合催化剂，氮气保护下再用注射器加入25mL步骤（1）所述混合溶剂，在55℃反应25小时；

[0083] 所述复合催化剂，四三苯基磷钯的物质的量:碘化亚铜的物质的量=1:1；

[0084] （3）离心：待步骤（2）的反应液冷却至室温后，在7000r/min转速下离心5分钟；

[0085] （4）沉淀：取离心后的上层溶液，按上层溶液的体积: 丙酮与乙醚的混合溶液的体积=1:10的比例将上层溶液加入丙酮与乙醚的混合溶液中，在转速800r/min下搅拌0.5h，至出现暗棕色沉淀物，静置1h，去除上层清液，取下层浊液在转速7000r/min下离心
5min；

[0086] 所述丙酮与乙醚的混合溶液，丙酮的体积:乙醚的体积=75:50；

[0087] （5）纯化：按步骤（4）所得固体的质量:甲醇的体积=1:12的比例将固体重新溶解，然后重复步骤（4），得最终暗棕色沉淀物。