来自辣椒疫霉菌的肉碱脂酰转移酶PCCAT2及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了来自辣椒疫霉菌的肉碱脂酰转移酶PCCAT2及其编码基因与应用。本发明所提供的肉碱脂酰转移酶PCCAT2，是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列2第所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与辣椒疫霉菌致病性相关的由a）衍生的蛋白质。本发明为进一步研制辣椒疫霉病菌分子检测技术、辣椒疫霉菌所导致的多种植物病害的防治与研究提供了技术基础。

权利要求

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的编码序列是序列表中序列1的DNA分子。

4.下述1）-3）中的任一种生物材料：

1）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；

2）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组表达载体；

3）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物。

5.制备权利要求1所述蛋白质的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求1所述蛋白质的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

6.制备表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的步骤。

7.权利要求1所述的蛋白质在作为肉碱脂酰转移酶中的应用。

8.权利要求1所述的蛋白质在调控辣椒疫霉菌致病性中的应用。

9.权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在制备肉碱脂酰转移酶中的应用。

10.扩增权利要求2或3所述的核酸分子的全长的引物对；其中一条引物为：ATGGCTCTGATTCCGCACGGCAGTTT；另一条引物为：TTAAAGCTTCGCTCCAACTTCCGTGGAC。

说明书

来自辣椒疫霉菌的肉碱脂酰转移酶PCCAT2及其编码基因

与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种肉碱脂酰转移酶及其编码基因与应用，特别涉及来自辣椒疫霉菌的肉碱脂酰转移酶及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）属真菌门、鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目。辣椒疫霉菌是一种寄主范围广的致病菌，除侵染辣椒外，还侵染其它作物。周启明等报道侵染9科21种栽培植物和杂草；任光驰等试验结果认为该菌可危害茄子、黄瓜、番茄、豇豆、菜豆、白菜、甘蓝、萝卜、胡萝卜、桃、杏、苹果等。对葱、蒜侵染力弱，对柑桔及马铃薯茎、叶不侵染。对辣椒的致病力最强。

[0003] 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）所引起的一种土传病害，可经雨水、土壤、气流等多种途径传播，除了引起大面积死秧外，还可造成叶片枯萎、果实腐烂、茎杆出现坏死斑，以及萎蔫死亡等多种症状。中国首次于20世纪40年代在江苏报道此病的发生，此后陆续有相关报道,且表现为逐年加重的趋势。80年代以来，辣椒疫病在全国各地普遍发生，新疆、北京、黑龙江、贵州、上海、青海、云南、陕西、甘肃、广东以及长江流域尤为严重。辣椒疫病是辣椒栽培及生产上一种世界性分布较广的毁灭性病害，该病发病周期短，流行速度快，给生产上带来严重的经济损失。深入开展辣椒疫霉菌致病基因的分离及鉴定对辣椒疫霉菌所导致的多种植物病害的防治与研究具有重要的实践意义。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种肉碱脂酰转移酶。

[0005] 本发明所提供的肉碱脂酰转移酶，名称为PCCAT2，来源于辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici)SD33，是如下a）或b）的蛋白质：

[0006] a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0007] b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与辣椒疫霉菌致病性相关的由a）衍生的蛋白质。

[0008] 其中，序列表中序列2由633个氨基酸残基组成。

[0009] 为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0010] 表1标签的序列

[0011]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0012] 上述（b）中的PCCAT2可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的PCCAT2的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至1902位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0013] 编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子也属于本发明的保护范围。

[0014] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0015] 所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）所示的基因：

[0016] 1）其编码序列是序列表中序列1的DNA分子；

[0017] 2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

[0018] 3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

[0019] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

[0020] 其中，序列表中的序列1由1902个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。

[0021] 下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

[0022] 1）含有编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子的表达盒；

[0023] 2）含有编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子的重组表达载体；

[0024] 3）含有编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子的重组微生物；

[0025] 4）含有编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子的转基因细胞系。

[0026] 上述生物材料中，1）所述的含有编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达肉碱脂酰转移酶PCCAT2的DNA，该DNA不但可包括启动肉碱脂酰转移酶PCCAT2基因转录的启动子，还可包括终止肉碱脂酰转移酶PCCAT2转录的终止子。进一步，所述含有肉碱脂酰转移酶PCCAT2表达盒还可包括增强子序列。2）所述的含有编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pGR106-Sma Ⅰ的多克隆位点插入肉碱脂酰转移酶PCCAT2编码基因得到的重组表达载体。3）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

[0027] 本发明的又一个目的是提供一种制备肉碱脂酰转移酶PCCAT2的方法。

[0028] 本发明所提供的制备肉碱脂酰转移酶PCCAT2的方法，包括将肉碱脂酰转移酶PCCAT2编码基因在生物细胞中进行表达得到肉碱脂酰转移酶的步骤；所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

[0029] 本发明的再一个目的是提供一种制备表达肉碱脂酰转移酶PCCAT2的重组微生物的方法。

[0030] 本发明所提供的制备表达肉碱脂酰转移酶PCCAT2的重组微生物的方法，包括将肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达肉碱脂酰转移酶PCCAT2的重组微生物的步骤。

[0031] 其中，所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

[0032] 扩增编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0033] 肉碱脂酰转移酶PCCAT2在作为肉碱脂酰转移酶中的应用，以及编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子或含有编码肉碱脂酰转移酶PCCAT2的核酸分子的生物材料在制备肉碱脂酰转移酶中的应用也属于本发明的保护范围。

[0034] 肉碱脂酰转移酶PCCAT2在调控辣椒疫霉菌致病性中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述调控辣椒疫霉菌致病性包括如下步骤：调控肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达，或调控肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录。所述调控肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达具体可为提高肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达水平以提高辣椒疫霉菌致病性，或降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达水平以降低辣椒疫霉菌致病性。

[0035] 如下以肉碱脂酰转移酶PCCAT2或其编码基因为靶点的鉴定辣椒疫霉菌杀菌剂的方法也属于本发明的保护范围。

[0036] 该鉴定辣椒疫霉菌杀菌剂的方法，包括如下a）-e）中的任一步骤：

[0037] a）鉴定所述待检测物质是否抑制肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达，如所述待测物质能抑制肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制权肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

[0038] b）鉴定所述待检测物质是否降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达水平，如所述待测物质能降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达水平，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达水平，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

[0039] c）鉴定所述待检测物质是否抑制肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录，如所述待测物质能抑制肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

[0040] d）鉴定所述待检测物质是否降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录水平，如所述待测物质能降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录水平，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录水平，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

[0041] e）鉴定所述待检测物质是否使肉碱脂酰转移酶PCCAT2失活，如所述待测物质能使肉碱脂酰转移酶PCCAT2失活，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能使肉碱脂酰转移酶PCCAT2失活，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂。

[0042] 具有如下1）-5）中至少一种功能的物质在制备辣椒疫霉菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围：

[0043] 1）抑制肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达；

[0044] 2）抑制肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录；

[0045] 3）降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的表达水平；

[0046] 4）降低肉碱脂酰转移酶PCCAT2的编码基因的转录水平；

[0047] 5）使肉碱脂酰转移酶PCCAT2失活。

[0048] 实验证明，肉碱脂酰转移酶PCCAT2基因有效的参与了辣椒疫霉菌侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，是辣椒疫霉菌的一个重要致病基因，本发明为进一步研制辣椒疫霉病菌分子检测技术、辣椒疫霉菌所导致的多种植物病害的防治与研究提供了技术基础。

附图说明

[0049] 图1为PCCAT2在辣椒叶片中瞬时表达照片。

[0050] 图中，A：重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101；B：重组农杆菌pGR106/GV3101；C：双蒸水。

[0051] 图2为PCCAT2在烟草叶片中瞬时表达照片。

[0052] 图中，A：重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101；B：重组农杆菌pGR106/GV3101；C：双蒸水。

[0053] 图3为pHAMT34H-antiPCCAT2转化子中PCCAT2的相对表达量。

[0054] 图中，2-S16为pHAMT34H-antiPCCAT2转化子,WT为SD33，CK为pHAMT34H转化子。

[0055] 图4为pHAMT34H-antiPCCAT2转化子对辣椒叶片的致病效果。

[0056] 图中，A为pHAMT34H-antiPCCAT2转化子;B为SD33;C为pHAMT34H转化子;D为无菌水。

具体实施方式

[0057] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0058] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0059] 实施例1、肉碱脂酰转移酶PCCAT2基因的克隆及PCCAT2的致病性

[0060] 1.PCCAT2基因克隆

[0061] 设计克隆辣椒疫霉肉碱脂酰转移酶PCCAT2基因的引物：

[0062] CAT-3 F ：ATGGC TCTGA TTCCG CACGG CAGTT T ；C AT-3R ：TTAAAGCTTCGCTCCAACTTCCGTGGAC。

[0063] 以辣椒疫霉菌株SD33（山东农业大学）（J.Phytopathol 157:585-591,2009)基因组DNA作为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物回收后分别与pGEM-T Easy Vector（Promega）连接，并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该PCR产物的核苷酸序列是序列表中的序列1，编码序列表中序列2的蛋白质辣椒疫霉肉碱脂酰转移酶PCCAT2。其中，序列表中序列1由1902个脱氧核苷酸组成，序列表中序列2由633个氨基酸残基组成。

[0064] 2．辣椒疫霉肉碱脂酰转移酶PCCAT2的致病性

[0065] 2.1辣椒疫霉肉碱脂酰转移酶PCCAT2基因瞬时表达致病性

[0066] 2.1.1辣椒疫霉肉碱脂酰转移酶PCCAT2瞬时表达载体构建

[0067] 为将克隆的PCCAT2基因在农杆菌中瞬时表达，根据PVX载体pGR106-Sma Ⅰ，选择Cla Ι和SmaⅠ两个酶切位点，将PCCAT2的编码序列（扩增的序列是序列1的第1-1902位，）连入载体pGR106-Sma Ⅰ。其中，pGR106-Sma Ⅰ是将pGR106（山东农业大学）（Trudy A.Torto,Shuang Li,Allison Styer,Edgar Huitema,Antonino Testa,Neil A.R.Gow,Pieter van West,and Sophien Kamoun。（2003）EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.Genome Res.2003 13:1675-1685；doi:10.1101/gr.910003）中的克隆位点由ClaI-AscI-NotI-SalI替换为ClaI-Sma Ⅰ-NotI-SalI得到的重组载体。

[0068] 构建PVX载体所需引物序列为：

[0069] PCAT3PVX-F：CCATCGATATGGCTCTGATTCCGCACGGC

[0070] ClaⅠ

[0071] PCAT3PVX-R：TCCCCCGGGTTAAAGCTTCGCTCCAACTTC

[0072] Sma Ⅰ

[0073] 以辣椒疫霉菌株SD33基因组DNA作为模板，用上述引物进行PCR扩增，用ClaⅠ和Sma Ⅰ双酶切PCR产物，然后将其插入pGR106-Sma Ⅰ的ClaⅠ和Sma Ⅰ位点间，将经过测序验证在pGR106-Sma Ⅰ的Cla Ⅰ和Sma Ⅰ位点间插入序列1的第1-1902位核苷酸的重组载体命名为pGR106-PCCAT2。利用冻融法将pGR106-PCCAT2转入根癌农杆菌GV3101得到重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101。同时按照相同方法将pGR106-Sma Ⅰ转入根癌农杆菌GV3101得到重组农杆菌pGR106/GV3101作为空载体对照菌株。

[0074] 2.1.2转化烟草和辣椒

[0075] 将重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101和重组农杆菌pGR106/GV3101分别在液体培养基(向LB液体培养基中添加卡那霉素和利福平至二者的终浓度均为50mg/ml得到的培养基)，28℃下，200rpm震荡培养24h;然后离心收集菌体在等体积MMA(10mmol/L MgCl2、10mmol/L MES（2-N-吗啉基乙磺酸）和100mmol/L AS（乙酰丁香酮）中继续诱导培养3h。
诱导后的菌体接种5-6叶期的中椒6号辣椒苗和本生烟草幼苗，用无针头5ml无菌注射器将重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101和重组农杆菌pGR106/GV3101悬浮液分别压入叶片中，接种除子叶外的所有叶片。以双蒸水（ddH2O）处理作为对照。每个处理重复3次，接种后植物在培养箱中(22℃,75%空气湿度，黑暗)培养2天，转入人工气候室培养，接种后每天观察记录症状变化直到第14天。

[0076] 结果表明重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101在辣椒体内瞬时表达，在第3天接种叶片开始出现变化，重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101接种的辣椒叶片接种部位开始出现黄化，这些黄化部分逐渐加重，在第7天形成点状褐色斑点；随着时间变化这些叶片褐色斑点逐渐变大连片，叶片皱缩变形，叶片颜色由鲜绿色变得黑暗无光，直至最后逐渐脱落。作为阴性对照的双蒸水和重组农杆菌pGR106/GV3101接种叶片直到观察期结束接种部位稍有发黄，但叶片生长没有受到影响（图1）。说明PCCAT2基因具有致病性。

[0077] 重组农杆菌pGR106-PCCAT2/GV3101在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片体内瞬时表达症状出现较晚，在接种7天以后出现变色褪绿现象，随时间变化，接种部位叶片组织颜色变淡，叶片稍有皱缩，后期叶片接种面不再平坦，发生变形。作为阴性对照的ddH2O和重组农杆菌pGR106/GV3101接种叶片稍有症状，未影响叶片生长（图2）。说明PCCAT2基因具有致病性。

[0078] 2.2辣椒疫霉肉碱脂酰转移酶PCCAT2基因稳定沉默表达的致病性

[0079] 2.2.1PCCAT2稳定沉默表达载体构建

[0080] 根据沉默载体pHAMT34H（山东农业大学）（Judelson HS,Tyler BM,and Michelmore RW.1991.Transformation of the oomycete pathogen,Phytophthora infestans.Mol Plant Microbe Interact 4(6):602-607）及酶切位点，选择Sma Ⅰ酶切位点设计引物：

[0081] PCAT3R i-F：TCC CCCGG ATGGCTCTGATTCCGCACGG

[0082] Sma Ⅰ

[0083] PCAT3Ri-R：TCC CCCGGG TTAAAGCTTCGCTCCAACTTCCG

[0084] Sma Ⅰ

[0085] 以辣椒疫霉菌株SD33基因组DNA作为模板，用上述引物进行PCR扩增，用Sma Ⅰ酶切PCR产物，然后与Sma Ⅰ酶切的pHAMT34H连接，将连接产物克隆至大肠杆菌JM109感受态细胞。经菌落PCR及酶切验证后送公司测序，将经过测序验证在pHAMT34H的Sma Ⅰ位点插入序列1的第1-1902位的反向互补序列所示DNA片段的重组载体命名为
pHAMT34H-antiPCCAT2（沉默转化载体）。

[0086] 2.2.2转化辣椒疫霉菌制备沉默转化子

[0087] 将 pHAMT34H-antiPCCAT2 和 辅 助 质 粒 pHspNpt（Yonglin Wang,Daolong Dou,Xiaoli Wang,Aining Li,Yuting Sheng,Chenlei Hua,Binyan Cheng,XiaorenChen,Xiaobo Zheng,Yuanchao Wang.The PsCZF1 gene encoding a C2H2 zinc finger protein is required for growth,development and pathogenesis in Phytophthora sojae.Microbial Pathogenesis.2009,47:78–86）转化辣椒疫霉菌株SD33，同时以pHAMT34H和辅助质粒pHspNpt转化辣椒疫霉菌株SD33作为对照，挑取转化子，放在含有G418抗性的V8蔬菜汁培养基中再次筛选培养。将生长出的转化子转入液体V8蔬菜汁
培养基中28℃静置培养3天，得到转入pHAMT34H-antiPCCAT2的重组辣椒疫霉菌（命名为pHAMT34H-antiPCCAT2/SD33）和转入pHAMT34H的重组辣椒疫霉菌（命名为pHAMT34H/SD33），收集菌丝，提取转化子RNA。反转录后，进行荧光定量PCR分子验证。

[0088] PCR反应使用引物为：

[0089] PCCAT2 基 因 引 物：CAT3-QF ：CGAGTTTGCGCGTTCTAAGG；CAT3-QR：GTGTTCCACCATTCCGACAG。actin基因引物：actin RT sp：ACTGCACGTTCCAGACGATC；actinRT asp：CCACCACCTTGATCTTCATG

[0090] 荧光定量PCR反应体系：2.5×SuperRealPreMix 12.5μL，正向引物（10μM）0.75μL，反向引物（10μM）0.75μL，cDNA模板2.5μL，RNase-free dd H2O至25μL。

[0091] 荧光定量PCR反应条件：95℃变性10sec，59℃退火20sec，68℃延伸30sec，共进行45个循环，最后65-95℃制备溶解曲线。

[0092] 以辣椒疫霉β-actin基因为内参，每个样品做三个重复，用2-△△Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析。△△Ct=(CTtarget–CTactin)待测样本–(CTtarget–CTactin)校准样本，在本研究中选择每个基因在野生型SD33中的表达为校准样本，pHAMT34H转化子（pHAMT34H/SD33）、pHAMT34H-antiPCCAT2转化子（pHAMT34H-antiPCCAT2/SD33）分别为待测样本。

[0093] 结果表明，pHAMT34H-antiPCCAT2转化子中，PCCAT2的表达量是野生型SD33的1/5倍，pHAMT34H转化子中，PCCAT2的表达量与野生型SD33的相同（图3）。

[0094] 2.2.3辣椒疫霉PCCAT2基因沉默转化子筛选及其生物学性状分析

[0095] 对得到的沉默转化子进行生物学性状分析，包括致病性，孢子囊形态及数量，游动孢子产量，菌株的生长速率变化等。

[0096] 2.2.3.1游动孢子诱导

[0097] (1)将辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAMT34H/SD33以及重组辣椒疫霉菌pHAMT34H-antiPCCAT2/SD33分别转移到10% V8蔬菜汁培养基上培养4天，从菌落边缘挑取菌丝块移至新的10% V8蔬菜汁培养基上继续培养4天备用；

[0098] (2)挑取菌落边缘菌丝块至10% V8蔬菜汁培养基上培养，25℃黑暗培养5-6天；

[0099] (3)加入灭菌水（以刚好浸没菌丝为宜），每隔1天换水直到产生游动孢子；收集游5
动孢子调节游动孢子浓度至1×10 个/ml，得到的游动孢子悬浮液可用于致病性分析。

[0100] 2.2.3.2转化子表型分析

[0101] (1)菌落形态观察及生长速率测定：将辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAMT34H/SD33以及重组辣椒疫霉菌pHAMT34H-antiPCCAT2/SD33用打孔器取0.5mm大小的菌块于10% V8培养基上培养，连续转接两次，然后再将上述菌株的同样大小菌丝块接到10%V8固体平板上待第四天测量菌落半径。每次实验每个菌株三次重复，共3次重复实验，然后求其平均值计算菌丝生长速率。

[0102] (2)菌丝及孢子囊测定：各菌株在10% V8蔬菜汁培养基上，28℃培养5-7d，挑取菌丝于载玻片上，孢子囊产量、孢子萌发以及菌丝形态观察。同时将诱导的游动孢子在显微镜下观察形态并做记录。

[0103] (3)游动孢子的获得和萌发：将各参试菌株在10% V8蔬菜汁液体培养基中培养三天，然后再用20ml灭菌水冲洗刺激产生孢子囊，再冷刺激产生游动孢子。吸取2μl培养皿中的液体在显微镜下镜检游动孢子的数目。将游动孢子液蜗旋振荡30s，与等体积灭菌水混合。吸取50μl滴于载玻片上25℃保湿培养2h，观察休止胞的萌发情况，计算萌发的休止孢占休止孢和萌发休止孢总和的比率。在显微镜下测量萌发后形成芽管的长度。所有实验每个菌株三次重复，然后求其平均值。

[0104] 实验结果表明PCCAT2对菌落形态、菌丝生长速率、孢子囊形态及数量、游动孢子产量和休止孢的萌发率等这些生物学性状没有产生影响。由于PCCAT2在寄主病原互作阶段表达变化显著，这可能暗示着该基因在侵染发过程中发挥着重要作用。游动孢子在10%的V8液体培养基中25℃孵育，静止2小时后，辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAMT34H/SD33萌发率在46-52%之间，而重组辣椒疫霉菌pHAMT34H-antiPCCAT2/SD33休止孢的平均萌发率为49.4%。

[0105] 2.2.5.3致病性测定

[0106] 将诱导的重组辣椒疫霉菌pHAMT34H-antiPCCAT2/SD33游动孢子接种培育的中椒5
6号（5-6叶期）叶片。游动孢子浓度调节至1×10 个/ml。首先将选取叶片消毒：70%乙醇处理30s,0.1%升汞处理7min,在灭菌水中冲洗3次，晾干备用。晾干后将叶片平铺在事先准备的水琼脂平板上，每个平板放3片，每个叶片接种2μl游动孢子悬浮液。每个样品接
12个叶片。用辣椒疫霉野生型菌株SD33游动孢子悬浮液，重组辣椒疫霉菌pHAMT34H/SD33游动孢子悬浮液和无菌水接种作为对照。做3次重复实验。每天观察症状，拍照记录。

[0107] 结果表明：接种辣椒疫霉野生型菌株SD33游动孢子（图4中B）的叶片很快（接种后第2天）在接种位点出现坏死腐烂斑，并且病斑有扩大趋势。接种重组辣椒疫霉菌pHAMT34H/SD33游动孢子（图4中C）的叶片出现相同症状。无菌水接种的辣椒叶片没有出现病斑（图4中D），而用PCCAT2基因沉默转化子pHAMT34H-antiPCCAT2/SD33游动孢子（图4中A）处理后的叶片在接种后第2天在接种位点出现坏死腐烂斑，强度减弱（病斑颜色比对照浅，面积比对照小），发病面积小于接种辣椒疫霉野生型菌株SD33叶片，发病面积是接种辣椒疫霉野生型菌株SD33叶片的1/8。

[0108] 上述实验说明PCCAT2基因参与了辣椒疫霉菌侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，是重要的致病因子。