本发明提供一粒小麦成熟胚的组织培养方法，包括种子消毒、剥离种胚、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤，其中愈伤组织诱导培养和分化培养步骤中使用的培养基分别为I和II。采用本发明方法，可显著促进一粒小麦成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生，并使出愈率和分化率得到了显著改善，进一步提高植株再生率。
1.一粒小麦成熟胚的组织培养方法，包括种子消毒、剥离种胚、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I为：在基础培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和/或6-糖氨基嘌呤（KT）后制成的pH值为5.8-6.0的培养基；所述分化培养步骤中使用的培养基II为：基础培养基+NAA 0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT
1.0-2.0mg/L+ZT 1.0-2.0mg/L，pH值5.8-6.0；
NH4NO3 1600-1670 mg/LKNO3 1800-2000 mg/LMgSO4•7H2O 370-380 mg/LKH2PO4 160-180 mg/LCaCl2·2H2O 420-440 mg/LKI 0.8-0.9 mg/LH3BO3 5-7 mg/LMnSO4·4H2O 20-23 mg/LZnSO4·7H2O 8-9mg/LNa2MoO4·2H2O 0.2-0.25 mg/LCuSO4·5H2O 0.02-0.025 mg/LCoCl2·6H2O 0.02-0.025 mg/LFeSO4·7H2O 27-28 mg/LNa2-EDTA·2H2O 37-38 mg/L肌醇 100-105 mg/L甘氨酸 1-2 mg/L盐酸硫胺素 0.05-0.1 mg/L盐酸吡哆醇 0.4-0.5 mg/L烟酸 0.4-0.5 mg/L脯氨酸 500-550 mg/L谷氨酰胺 500-550 mg/L天冬酰胺 150-200 mg/L水解酪蛋白 250-300 mg/L蔗糖 55-60 g/L植物凝胶 2.4-2.5g/L以水配制；
所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I中2，4-D与KT的添加比例为：2，
4-D 0.5-1mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D 1-2mg/L +KT 0-0.05mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT
0-0.05mg/L、2，4-D 5-6mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，
4-D 1-2mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D 5-6mg/L+KT
0.1-0.15mg/L、2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0.5-0.6mg/L、2，4-D 1-2mg/L+KT 0.5-0.6mg/L、2，
4-D 3-4mg/L+KT 0.5-0.6mg/L或2，4-D 5-6mg/L+KT 0.5-0.6mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子消毒的方法为：将一粒小麦成熟种子于水中浸泡16-18小时后，置于75-80%的酒精中处理0.5-1.5分钟，然后浸泡于0.1-0.15%的升汞中13-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养的方法为：将剥离得到的成熟胚，盾片朝上接种于培养基I上，置于24-25°C暗培养，得到成熟胚愈伤组织。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，分化培养的方法为：将成熟胚愈伤组织转移至培养基II中，置于25°C，光照16小时/天，光照强度为2000-3000 lux，培养至出苗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，生根培养的方法为：将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基中进行培养，待长至苗高达6-9cm时，炼苗3-5天，最后将植株移入大田中或进行温室培养；其中，所述生根培养基的配方为：NH4NO3 800-835 mg/LKNO3 900-1000 mg/LMgSO4·7H2O 185-190 mg/LKH2PO4 80-90 mg/LCaCl2·2H2O 210-220 mg/LKI 0.8-0.9 mg/LH3BO3 5-6 mg/LMnSO4·4H2O 20-23 mg/LZnSO4·7H2O 8-9 mg/LNa2MoO4·2H2O 0.2-0.25 mg/LCuSO4·5H2O 0.02-0.025 mg/LCoCl2·6H2O 0.02-0.025 mg/LFeSO4·7H2O 27-28 mg/LNa2-EDTA·2H2O 37-38 mg/L肌醇 100-105 mg/L甘氨酸 1-2 mg/L盐酸硫胺素 0.05-0.1 mg/L盐酸吡哆醇 0.4-0.5 mg/L烟酸 0.4-0.5 mg/L蔗糖 25-30 mg/L吲哚丁酸 0.5-1 mg/Lα-萘乙酸 0.5-1 mg/L多效唑 0.5-1 mg/L植物凝胶 2.4-2.5 g/L 以水配制。
一粒小麦成熟胚的组织培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一粒小麦成熟胚的组织培养方法。
背景技术
[0002] 一粒小麦(einkorn)是小麦属的二倍体种(2n=2x=14，AA)，是小麦的重要基础物种。一粒小麦具有耐寒、耐旱特性，适宜在山区栽培，对土壤要求不高，并发现其具有抗锈病的抗源。小麦为六倍体植物，具有基因组庞大、重复序列多、基因克隆困难等特点。二倍体一粒小麦较普通六倍体小麦基因组小，是进行插入诱变以分离、克隆小麦基因的良好材料。因此，建立高效稳定的一粒小麦成熟胚组织培养再生体系不仅能为二倍体小麦遗传转化提供参考，还能为小麦分子育种研究奠定基础。
[0003] 植物组织培养，特别是胚性细胞系的建立，作为植物遗传转化操作的主要基础，一直受到广泛关注。到目前为止，麦类组织培养成功的外植体包括幼胚、幼穗、花药、成熟胚、幼叶、子叶中层、种子、悬浮细胞、子房、茎尖、根尖分生组织和原生质体等。研究其愈伤组织分化情况，其中，幼胚被认为是最理想的外植体材料，愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高，获得转基因小麦植株的报道基本以幼胚为受体。而幼胚取材受时间、空间和季节的限制，合适的取材时期难以把握，所取材料生理状态、发育阶段的一致性也不能很好保障，在一定程度上制约了遗传转化的有效开展与应用。成熟胚取材方便，不受季节、植株发育阶段等因素限制，能保证不同个体间生理状态的一致性，是开展遗传转化最为方便实用的受体。目前，鲜有关于麦类二倍体物种组织培养体系建立的报道，且一粒小麦成熟胚组织培养再生体系的建立尚处于起步阶段。因此，亟待建立一种高效稳定的一粒小麦成熟胚组织培养再生体系，为研究其遗传转化提供基础。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种高效的一粒小麦成熟胚的组织培养方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一粒小麦成熟胚的组织培养方法，其包括种子消毒、剥离种胚、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤。
[0006] 其中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I为：在基础培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和/或6-糖氨基嘌呤(KT)后制成的pH值为5.8-6.0的培养基；
所述分化培养步骤中使用的培养基II为：在基础培养基中添加α-萘乙酸(NAA)、6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤(ZT)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、6-糖氨基嘌呤(KT)或
2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱(CC)中的一种或多种后制成的pH值为5.8-6.0的培养基。
[0007] 所述基础培养液配方为(以水配制)：
[0008]
[0009]
[0010] 所述基础培养液配方优选为(以水配制)：
[0011]
[0012] 前述方法中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I中2，4-D与KT的添加比例为：2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D1-2mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D5-6mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D1-2mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D5-6mg/L+KT
0.1-0.15mg/L、2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0.5-0.6mg/L、2，4-D 1-2mg/L+KT 0.5-0.6mg/L、2，
4-D 3-4mg/L+KT 0.5-0.6mg/L或2，4-D 5-6mg/L+KT 0.5-0.6mg/L等。
[0013] 前述方法中，所述分化培养步骤中使用的培养基II中NAA、ZT、6-BA、KT与CC的添加比例为：KT 0.5-1.0mg/L、KT 1.0-2.0mg/L、KT 2.0-3.0mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L+KT1.0-2.0mg/L、NAA0.5-1.0mg/L+ZT 1.0-2.0mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L、NAA0.5-1.0mg/L+6-BA
1.0-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L+ZT 1.0-2.0mg/L 或 NAA 0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L+ZT1.0-2.0mg/L+CC 1.0-2.0mg/L等。
[0014] 优选地，所述培养基I为基础培养基+2，4-D 1-2mg/L+KT0-0.05mg/L。所述培养基II为基础培养液+NAA 0.5-1.0mg/L+ZT1.0-2.0mg/L。
[0015] 前述方法中，种子消毒的方法为：将一粒小麦成熟种子于水中浸泡16-18小时后，置于75-80%的酒精中处理0.5-1.5分钟，然后浸泡于0.1-0.15%的升汞中13-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。
[0016] 前述方法中，愈伤组织诱导培养的方法为：将剥离得到的成熟胚，盾片朝上接种于培养基I上，置于24-25°C暗培养，得到成熟胚愈伤组织。
[0017] 前述方法中，分化培养的方法为：将成熟胚愈伤组织转移至培养基II中，置于25°C，光照16小时/天，光照强度为2000-3000lux，培养至出苗。
[0018] 前述方法中，生根培养的方法为：将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基中进行培养，待长至苗高达6-9cm(如苗高8cm,根系发育良好)时，进行炼苗(炼苗期间注意保湿，温度不能大于30℃)，3-5天后将植株移入大田中或进行温室培养。
[0019] 其中，所述生根培养基的配方为(以水配制)：
[0020]
[0021] 本发明的优点在于：本发明的一粒小麦成熟胚的组织培养方法，可显著促进一粒小麦成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生，并使岀愈率和分化率得到了显著改善，进一步提高植株再生率。
附图说明
[0022] 图1为一粒小麦AS 260成熟胚的愈伤诱导情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚愈伤诱导情况，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚愈伤诱导情况。
[0023] 图2为一粒小麦AS 262成熟胚的愈伤诱导情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚愈伤诱导情况，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚愈伤诱导情况。
[0024] 图3为一粒小麦AS 260成熟胚的分化情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚分化情况，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚分化情况。
[0025] 图4为一粒小麦AS 262成熟胚的分化情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚分化情况，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚分化情况。
[0026] 图5为本发明的一粒小麦成熟胚组织培养再生方法的工艺流程图。
具体实施方式
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0028] 实施例1 一粒小麦成熟胚的组织培养再生方法
[0029] 1.1 诱导培养基(I)和分化培养基(II)的配制
[0030] 基础培养液，其配方为(以蒸馏水配制)：
[0031]
[0032]
[0033] 愈伤组织诱导培养基I的配方为：基础培养液+2，4-D 2mg/L，pH值5.8。
[0034] 将上述配制的溶液置于高压灭菌锅中，103.4kPa(1.05kg/cm2)，121.3℃，15分钟灭菌，冷却后即得愈伤组织诱导培养基I。
[0035] 分化培养基II的配方为：基础培养液+NAA 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L，pH值5.8。
[0036] 将上述配制的溶液置于高压灭菌锅中，103.4kPa(1.05kg/cm2)，121.3℃，15分钟灭菌，冷却后即得分化培养基II。
[0037] 1.2 种子消毒处理
[0038] 从5种一粒小麦基因型(AS 260、AS 262、AS 263、AS 265和AS267，由四川农业大学小麦研究所提供)中，选取于2011年采集的籽粒饱满的一粒小麦成熟种子，用蒸馏水在室温下浸泡16-18小时后，用75%的酒精消毒1分钟，再用0.1%的升汞消毒15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。
[0039] 1.3 剥离种胚
[0040] 用消毒后的解剖刀剥取胚。
[0041] 1.4 愈伤组织诱导培养
[0042] 将浸泡处理后的种子，用解剖刀剥取胚，盾片朝上接种于愈伤组织诱导培养基I上，每皿接种40粒成熟胚，于25°C，黑暗培养2周，诱导愈伤组织的形成。一粒小麦AS 260的愈伤生长情况如图1所示(A和B分别于2011年和2010年采集)；一粒小麦AS 262的愈伤生长情况如图2所示(A和B分别于2011年和2010年采集)。
[0043] 1.5 分化培养
[0044] 将1.4中获得的成熟胚愈伤组织，转入分化培养基II中，光强2000-3000lux，光照时间16小时/天，温度25℃，培养3周。一粒小麦AS 260的绿苗分化情况如图3所示(A和B分别于2011年和2010年采集)；一粒小麦AS 262的绿苗分化情况如图4所示(A和B分别于2011年和2010年采集)。
[0045] 1.6 生根培养
[0046] 将长出2-3片叶子的分化苗转移到生根培养基中培养，光强2000-3000lux，光照时间16小时/天，温度25℃。待长至适宜大小(苗高8cm，根系发育良好)后打开试管进行炼苗(期间注意保湿，温度不能大于30℃)，3-5d后移栽入花盆，然后视外界温度高低决定移入温室或继续在人工气候箱24℃中生长。分别测定每个材料的成熟胚的再生率(成熟胚出苗率=生根植株数/接种愈伤数)。其中，5种一粒小麦基因型AS 260、AS 262、AS263、AS 265和AS 267的再生率分别是：AS 260 39.5%、AS 262 44.3%、AS 263 44.1%、AS
265 39.7%、AS 267 39.6%。
[0047] 所述生根培养基的配方为(以蒸馏水配制)：
[0048]
[0049]2
[0050] 将上述配制的溶液置于高压灭菌锅中，103.4kPa(1.05kg/cm)，121.3℃，15分钟灭菌，冷却后即得生根培养基。
[0051] 图5为本发明的一粒小麦成熟胚组织培养再生方法的工艺流程图。
[0052] 实施例2 2009年~2011年分别收获的一粒小麦在利用本发明成熟胚的组织培养再生方法后的比较
[0053] 1.1 按照实施例1中方法对2009年、2010年和2011年分别收获的5种基因型(AS260、AS 262、AS 263、AS 265和AS 267)的一粒小麦进行种子处理、诱导培养、分化培养及生根培养。
[0054] 1.2 不同时间收获的种子成熟胚组织培养的情况比较结果如表1所示：
[0055] 表1 不同时间收获的种子成熟胚组织培养的情况比较
[0056]
[0057] 从表1及图1-图4可以看出，不同时间收获的5种不同基因型的一粒小麦成熟胚接种在本发明的愈伤诱导培养基I上后，其胚性愈伤出愈率和出苗率均无明显差异，但不同基因型间有轻微差异，其中以AS 262和AS 263出愈率最高，达到了70%以上，使得二者的出苗率也表现最好，达到44%以上。同时发现，利用本发明所获得的愈伤组织，结构致密，颜色鲜亮，表面干爽，为进一步的分化奠定了基础。
[0058] 实施例3 本发明的一粒小麦成熟胚的组织培养方法与常规组培方法的对比[0059] 1.1 利用本发明方法进行节节麦成熟胚的组织培养再生
[0060] 1.1.1 按照实施例1中方法对2011年收获的5种基因型(AS 260、AS 262、AS263、AS 265和AS 267)的一粒小麦进行种子处理、诱导培养、分化培养及生根培养。
[0061] 1.2 利用常规麦类成熟胚组织培养再生方法进行一粒小麦成熟胚组织培养再生[0062] 1.2.1 种子消毒处理
[0063] 同样选取上述2011年收获的5种基因型的一粒小麦成熟种子，用蒸馏水在室温下浸泡16-18小时后，用75%的酒精消毒1分钟，再用0.1%的升汞消毒15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。
[0064] 1.2.2 剥离种胚
[0065] 用消毒后的解剖刀剥取胚。
[0066] 1.2.3 愈伤组织诱导培养
[0067] 将浸泡处理后的种子，用解剖刀剥取胚，盾片朝上接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿接种40粒成熟胚，于25°C，黑暗培养2周，诱导愈伤组织的形成。其中，诱导培养基的配方为：基础培养基+KT 1.0mg/L+2,4-D 3mg/L，pH 6.0。一粒小麦AS 260的愈伤生长情况如图1C所示；一粒小麦AS 262的愈伤生长情况如图2C所示。
[0068] 1.2.4 分化培养
[0069] 将1.2.3中获得的成熟胚愈伤组织，转入分化培养基中，光强2000-3000lux，光照时间16小时/天，温度25℃，培养3周。分化培养基的组成为：基础培养基+KT 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+IAA(吲哚丁酸)1.0mg/L，pH 6.0。一粒小麦AS 260的绿苗分化情况如图3C所示；一粒小麦AS 262的绿苗分化情况如图4C所示。
[0070] 1.2.5 生根培养
[0071] 将长出2-3片叶子的分化苗转移到生根培养基(配方同实施1中的生根培养基)中培养，光强2000-3000lux，光照时间16小时/天，温度25℃。待长至适宜大小(苗高8cm，根系发育良好)后打开试管进行炼苗(期间注意保湿，温度不能大于30℃)，3-5d后移栽入花盆，然后视外界温度高低决定移入温室或继续在人工气候箱24℃中生长。分别测定每个材料的成熟胚的再生率(成熟胚再生率=再生植株数/接种愈伤数)。
[0072] 1.2.6 两种方法对一粒小麦成熟胚组织进行培养的结果如表2所示：
[0073] 表2 两种方法对一粒小麦成熟胚组织进行培养的结果
[0074]
[0075] 由表2可以看出，5种不同基因型的一粒小麦成熟胚接种在不同的愈伤诱导和分化培养基上，胚性愈伤出愈率和最终的再生率大部分存在很大差异。应用本发明的方法，一粒小麦的成熟胚愈伤出愈率比常规方法平均提高11.5%，进一步促使应用本发明方法的再生率比常规方法平均提高11.8%。同时，由图1和图2可见，利用本发明方法所获得的愈伤组织，结构致密，颜色鲜亮，表面干爽，分化表现突出，为进一步分化奠定了基础。
[0076] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
