一种蝉拟青霉发酵物饲料添加剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及蝉拟青霉发酵物饲料添加剂及其制备与应用。本发明的蝉拟青霉发酵物饲料添加剂为蝉拟青霉Paecilomycescicadae(Miquel)Samson的发酵产物。本发明还进一步公开了蝉拟青霉发酵物饲料添加剂为的制备与应用。本发明的饲料添加剂制备工艺流程简单，原料廉价易得，含有丰富的腺苷、虫草酸和多糖，虽然在配合饲料中添加量极微，但效果十分显著：它可以提高饲料的利用率；改善饲料的适口性；促进畜禽生长发育；改善饲料畜禽产品的品质；合理利用饲料资源，该饲料添加剂还能通过增强动物的免疫调节提高成活率，降低饲养成本。

权利要求

1.一种蝉拟青霉发酵物饲料添加剂，为蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson的发酵产物，所述蝉拟青霉的发酵产物为将蝉拟青霉菌株先斜面培养，再种子液培养，而后接种固体培养基发酵培养后采收获得，所述蝉拟青霉菌株为蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae（Miq.）Samson CGMCC No.3453，所述固体培养基包括下列重量份的原料：

2.如权利要求1所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂，其特征在于，所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂中，多糖总含量为130-250mg/g、虫草酸含量为11-20mg/g、腺苷含量为

0.14-0.19mg/g。

3.如权利要求1所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的制备方法，包括下列步骤：a.斜面菌种制备：将蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae（Miq.）Samson CGMCC No.3453接种到斜面培养基上，20～25℃下，培养3～5天；

b.摇瓶种子液的制备：从斜面上刮取菌丝接种到以PDB培养基或PSB培养基为基础的三角瓶液体培养基中，20～25℃下，140～160rpm，培养3～5天即得摇瓶蝉拟青霉种子液；

c.发酵罐种子液的制备：将摇瓶种子液按5%-10%体积比例接种到以PDB培养基或PSB发酵罐培养基中，20～25℃下，搅拌速率140～160rpm，通气25vvm，培养3～5天即得蝉拟青霉种子液；

d.将步骤c中制得的蝉拟青霉种子液按重量百分比为5%～10%接入灭菌后的固体培养基中，在温度为18～23℃，湿度为50～90%的条件下，静置封闭式培养10～15天；

e.采收培养物；

f.脱水干燥：40-45℃，烘干脱水；

g.粉碎后即得成品；

所述固体培养基包括下列重量份的原料：

4.如权利要求1-2任一权利要求所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂用于制备动物饲料的用途。

5.如权利要求4所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的用途，其特征在于，所述动物饲料为猪、兔、肉鸡、蛋鸡、肉鸭、鹅、山羊、奶牛、肉牛或水产动物的饲料。

6.如权利要求4所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的用途，其特征在于，所述蝉拟青霉发酵物饲料在动物饲料中的添加量至少为动物饲料总重量的0.2%。

7.如权利要求6所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的用途，其特征在于，所述蝉拟青霉发酵物饲料在动物饲料中的添加量为动物饲料总重量的2%-6%。

说明书

一种蝉拟青霉发酵物饲料添加剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及蝉拟青霉饲料添加剂及其制备与应用。

背景技术

[0002] 我国畜禽养殖生产中疫病较多，为了控制细菌感染，饲料添加剂中一般都加有大量抗菌药物；为了促进畜禽产品的生长育肥，饲养户在生产过程中经常添加激素类药物，违规滥用药物的现象极为普遍。畜禽产品中农药、兽药普遍严重超标，由此引发的一系列事件不胜枚举。另外兽药生产不规范现象也很严重，兽药制剂中不注明有效成分、随意扩大实用范围的现象极为普遍，容易导致错误用药、重复用药，增加药残量。

[0003] 当畜禽食入食物中某些有毒物质，就会抑制某些畜禽的生产性能，严重的还会导致畜禽的发病或者是死亡。长期使用抗菌药易引起耐药性及二重感染，并加重动物体内的药物残留量，不利于疾病的治疗，同时还会影响某些疫苗的接种效果，使畜禽的生产性能下降，经济效益减少。由于我国的畜禽产品的兽药添加剂残留比较严重，已经给我国的养殖业发展带来巨大的经济损失。

[0004] 同时为适应国际、国内市场对绿色食品的需求，充分利用我国丰富的植物与微生物资源，开发“绿色”饲料添加剂产业，促进安全动物生产系统的构建十分重要…。近年来，抗生素的应用已引起巨大的争议。鉴于抗生素的负面效应以及人们对食品安全的日益关注，一些有效克服抗生素弊端，具有促生长作用的替代品被开发出来，并在猪、禽、反刍动物饲料中得到了一定的应用。在饲料中添加酸化剂、益生素、寡糖、酶制剂、中草药等可提高动物日增重、降低料肉比，减少猪禽腹泻及应激的发生、增强机体免疫力等。

[0005] 绿色饲料添加剂应具备以下特征：①能提高饲料利用率，促进动物的生长；能增强机体免疫功能，预防动物疾病；能提高动物生产性能和产品质量。②长期使用不产生毒副作用，动物产品中无药物和有害物质残留，对人类健康无危害，动物的排泄物对环境不构成潜在污染危害。③理化性质和生物活性稳定，能有效地进入胃肠道发挥作用，不影响饲料适口性。④与其他饲料添加剂合用，不发生或很少发生配伍禁忌，细菌对其不易产生抗药性。研究和开发绿色饲料添加剂，是振兴我国饲料工业、发展绿色养殖的需要，也是突破“绿色壁垒”、占领国际市场的需要。

[0006] 蝉拟青霉是一种名贵的虫生真菌，具有很高的药用价值。科研人员发现从天然蝉花分离获得的真菌发酵得到的蝉拟青霉在有效成分、药理活性与临床作用等方面与冬虫夏草有很大的相似性。蝉拟青霉中除了含有虫草多糖之外，还有氨基酸、微量元素、虫草酸和麦角甾醇、核苷类、维生素类等物质，具有广泛的药理活性，其活性涉及到了免疫系统、心脑血管系统、神经系统、呼吸系统、肝脏和肾脏功能等各方面。

[0007] 在国内外市场上，尚未见到利用蝉拟青霉做饲料添加剂的相关产品。

发明内容

[0008] 为解决上述问题，本发明提供了一种蝉拟青霉发酵物饲料添加剂及其制备方法和应用。

[0009] 首先，本发明公开了一种蝉拟青霉发酵物饲料添加剂，为蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson)的发酵产物。

[0010] 进一步的，所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂中，多糖总含量为130-250mg/g、虫草酸含量为11-20mg/g、腺苷含量为0.14-0.19mg/g，

[0011] 所述蝉拟青霉的发酵产物为将蝉拟青霉菌株先斜面培养，再种子液培养，而后接种固体培养基发酵培养后采收获得。

[0012] 所述固体培养基包括下列重量份的原料：

[0013]

[0014] 进一步优选的，所述蝉拟青霉菌株为蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453。该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏。

[0015] 蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453为从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本后分离获得。该蝉拟青霉菌株属于半知菌亚门Deuteromycotina，丝孢纲Hyphomycetes，束梗孢目Stilbellales，束梗孢科Stilbellaceae，拟青霉属Paecilomyces。该蝉拟青霉菌株于2009年9月10日送交中国科学院生物研究所进行形态特征鉴定，鉴定结果为：蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]。

[0016] 以该菌株为原料，制得的饲料添加剂成品经检测多糖含量高达130-250mg/g、虫草酸为11-20mg/g、腺苷为0.14-0.19mg/g，尤其适用于作为促进生长的饲料添加剂。

[0017] 本发明还进一步公开了所述蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的制备方法，包括下列步骤：

[0018] a.斜面菌种制备：将蝉拟青霉菌株接种到斜面培养基上，20～25℃下，培养3～5天；所述斜面培养基为PSA培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)或PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)。

[0019] b.摇瓶种子液的制备：从斜面上刮取菌丝接种到PDB培养基或PSB培养基为基础的三角瓶液体培养基中，20～25℃下，140～160rpm，培养3～5天即可制得蝉拟青霉摇瓶种子液；

[0020] c.发酵罐种子液的制备：将摇瓶种子液按5％-10％体积比例接种到以PDB培养基或PSB发酵罐培养基中，20～25℃下，搅拌速率140～160rpm，通气25vvm，培养3～5天即得蝉拟青霉种子液；

[0021] d.将步骤c中制得的发酵液按重量百分比为5％～10％接入灭菌后的前述固相培养基中，在温度为18～23℃，湿度为50～90％的条件下，静置封闭式培养10～15天。

[0022] e.采收培养物。

[0023] f.脱水干燥。采收后的鲜培养物采用冷冻干燥法或烘烤法(40～45℃)脱水干燥。

[0024] g.粉碎。将冷冻干燥、烘干的培养物，粉碎，过筛后即得成品。

[0025] 本发明的蝉拟青霉发酵物饲料添加剂可用于制备动物饲料或其他多组分的动物饲料添加剂。所述动物可以是猪、兔、肉鸡、蛋鸡、肉鸭、鹅、山羊、奶牛、肉牛以及水产动物。本发明的蝉拟青霉发酵物饲料在动物饲料中的添加量最少可为动物饲料总重量的0.2％，一般情况下，添加剂在动物饲料中的添加量为动物饲料总重量的2％-6％。本发明的饲料添加剂的作用包括但不限于下述方面：增强食欲，加快饲料养分消化、吸收，消除畜禽挑食、厌食，明显提高日增重和饲料转化率。

[0026] 本发明的蝉拟青霉发酵物饲料添加剂生产方法适合工业化生产，不受时间地点的限制，可根据市场的需求增加或缩减生产规模。本发明工艺简单、工艺稳定、易调控、成功率高；采用本发明方法生产投资少，占地少、无三废问题，适合大中型企业采用。其产品是一种功能性饲料添加剂，可广泛应用于猪、兔、肉鸡、蛋鸡、肉鸭、鹅、山羊、奶牛、肉牛以及水产动物。作用有但不限于下述方面：增强食欲，加快饲料养分消化、吸收，消除畜禽挑食、厌食，明显提高日增重和饲料转化率。

[0027] 本发明方法生产的蝉拟青霉发酵物饲料添加剂具有独特的先进性：一、所用菌种为传统名贵中药材蝉花，属云南当地省级药品标准目录，符合绿色饲料添加剂安全、有效的特征。应用于饲料添加剂目前尚无产品面市。二、饲料添加剂成品所用培养物包括固体培养的菌丝体和少量孢子、培养基基质，资源利用率最大，生产过程无污染，达到生产效益和社会效益最佳。

附图说明

[0028] 图1葡糖糖标准曲线

[0029] 图2腺苷标准曲线

[0030] 图3 10μg/mL腺苷对照品HPLC色谱图

[0031] 图4蝉拟青霉培养物超声水提取液HPLC色谱图

具体实施方式

[0032] 以下结合具体实施例对本发明作进一步描述，应理解实例并非用于限制本发明的保护范围。

[0033] 实施例1：蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的生产

[0034] (1)斜面菌种制备：将土豆煮熟，过滤去渣后，加入蔗糖、定容，加入琼脂融化，分装进试管，在0.1Mpa压力下，121℃，灭菌0.5h，放气完毕，趁热摆放成斜面自然冷却。无菌条件下将蝉拟青霉接到斜面试管，放入20℃培养箱，培养15天。

[0035] (2)摇瓶种子液的制备：先将土豆煮熟，过滤去渣后，加入蔗糖、定容、封口灭菌的过程。灭菌条件：在0.1Mpa压力下，121℃，灭菌0.5h。灭菌完毕，将培养基冷却，无菌条件下将斜面种接进摇瓶培养基中，将接种的摇瓶置入摇床振荡培养。培养条件：140r/min，20℃培养5天。

[0036] (3)发酵罐种子液的制备：将摇瓶种子液按5％-10％体积比例接种到以PDB培养基或PSB发酵罐培养基中，20下，搅拌速率140rpm，通气25vvm，培养3天即得蝉拟青霉种子液；

[0037] (4)固体培养

[0038] a.固相培养基的制备(按重量份)：

[0039] 表1固体培养基配方

[0040]

[0041] 固体培养基的制备方法：按照1#配方，将蔗糖、KNO3、KH2PO4、MgSO4溶于少量水中，然后将玉米粉、蚕蛹粉等一块混入清洗、浸泡后的小麦中，拌匀，分装入固体发酵容器，110℃，灭菌1.5h。

[0042] b.栽培种的制作。装好固相培养基的培养容器灭菌后移置缓冲室内，冷却，移置接种箱内接种，接入灭菌后的所述固相培养基中。接种箱内用紫外光照射0.5h后，每个栽培容器按约接5％～10％菌种量接种。

[0043] c.发菌管理。将接了菌种的栽培容器移至培养室培养。培养室应经消毒，要求清洁、干燥、通风、培养室黑暗。采用立体培养架培养。发菌室温度控制为18℃～23℃，空气相对湿度50％～90％，菌丝体向固相培养基生长直至长满料面。

[0044] d.采收。静置封闭式培养10～15天，挖出培养物。

[0045] e.脱水干燥。采收后的鲜培养物采用烘烤法(45℃)脱水干燥。

[0046] f.粉碎。将冷冻干燥、烘干的培养物，粉碎，过筛后即得成品。

[0047] 实施例2：蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的生产

[0048] (1)斜面菌种制备：同实施例1。

[0049] (2)种子液的制备：同实施例1。

[0050] (3)固体培养

[0051] a.固相培养基的制备：

[0052] 按照表1中的2#配方采用同实施例1的方法制备固体培养基。

[0053] b.固相培养基分装、灭菌、栽培种的制作、发菌管理、采收、脱水干燥及粉碎均同实施例1。

[0054] 实施例3：蝉拟青霉发酵物饲料添加剂的生产

[0055] (1)斜面菌种制备：同实施例1。

[0056] (2)种子液的制备：同实施例1。

[0057] (3)固体培养

[0058] a.固相培养基的制备：

[0059] 按照表1中的3#配方采用同实施例1的方法制备固体培养基。

[0060] b.固相培养基分装、灭菌、栽培种的制作、发菌管理、采收、脱水干燥及粉碎均同实施例1。

[0061] 实施例4饲料添加剂成品的成分检测

[0062] 1多糖检测：采用紫外分光检测方法

[0063] 1.1实验原理

[0064] 采用苯酚硫酸比色法对样品粗多糖进行检测。其原理是：多糖类在浓硫酸作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，糖醛衍生物再与酚性物质如苯酚反应生成有色化合物，在波长490nm处有最大吸收，且满足朗伯-比尔定律，通过检测样品在该波长下的吸光值，即可算出样品中粗多糖的含量。

[0065] 1.2仪器与材料

[0066] 1.2.1主要仪器 紫外可见分光光度计；电子天平；可调式封闭电炉；离心机H-1650。

[0067] 1.2.2实验试剂 无水葡萄糖(AR)；苯酚(AR)；浓硫酸(AR)；屈臣氏蒸馏水。

[0068] 试剂配制 5％苯酚溶液：精确称取5g苯酚，用水定容至100ml。

[0069] 1.2.3材料 蝉拟青霉固体培养物。

[0070] 1.3粗多糖提取方法

[0071] 精确称取1g样品于500ml锥形瓶内，加入煮沸蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速冷却至室温，分装至离心管配平后于6000转/min离心5min，取上清，将残渣用蒸馏水清洗，同样条件下离心，取上清，合并上清后过滤，最终定容于100ml容量瓶，即得样品提取液。

[0072] 1.4样品测定

[0073] 1.4.1葡萄糖标准曲线制作

[0074] 吸取0.25mg/mL葡萄糖标准液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL，分别置于具塞试管中，各加蒸馏水补至2.0mL，再加5％苯酚1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，摇匀，室温放置5min后，置沸水浴加热15min，取出冷却至室温，于490nm处测定吸光度。以蒸馏水代替葡萄糖标准溶液，用同样的方法操作作为对照，测定其吸光度。以葡萄糖标准液浓度为横2
坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y＝0.6622X+0.0088，R ＝0.9997，说明标准品葡萄糖量在0～2.75mg/ml范围内，与Abs呈良好的线性关系。

[0075] 1.4.2样品中粗多糖含量的测定

[0076] 将样品提取液进行2倍稀释，精确吸取稀释后的样液0.1ml置于具塞试管中，加蒸馏水至2.0mL，再加5％苯酚1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，摇匀，室温放置5min后，置沸水浴加热15min，取出冷却至室温，于490nm处测定吸光度。每管样品测3次Abs，求出平均值。求出5管样品总Abs平均值，代入标准曲线，求出样品中多糖的含量。

[0077] 1.5实验数据处理

[0078]

[0079] M：粗多糖含量(mg/g)；a：稀释倍数；C：待测液粗多糖浓度(mg/mL)；

[0080] V：体积(mL)；W：样品质量(g)

[0081] 2虫草酸检测：采用紫外分光检测方法

[0082] 2.1实验原理

[0083] 利用多元醇化合物甘露醇成分与高碘酸钠及Nash试剂产生的显色反应，测定样品中甘露醇的含量。

[0084] 2.2 1仪器与材料

[0085] 2.2.1主要仪器 紫外可见分光光度计；电子天平；离心机H-1650；电热恒温水箱CU600型；可调式封闭电炉。

[0086] 2.2.2实验试剂 甘露醇标准品；醋酸铵、乙酰丙酮、冰醋酸、高碘酸钾、L-鼠李糖。

[0087] 2.2.3试剂配制

[0088] 高碘酸钾溶液：15mmol(即3.45g)高碘酸钾溶于1L 0.12mol/L盐酸溶液中。Nash试剂：150g醋酸铵+2mL冰醋酸+2mL乙酰丙酮，用蒸馏水稀释至1L(现用现配)。L-鼠李糖溶液：L-鼠李糖100mg，用蒸馏水定容至100mL。

[0089] 2.2.4材料 蝉拟青霉培养物。

[0090] 2.3样品提取

[0091] 精确称取1g样品于500ml锥形瓶内，加入煮沸蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速的冷却至室温，分装至离心管配平后于6000r/min离心5min，取上清，将残渣用蒸馏水清洗，同样条件下离心，取上清，合并上清后过滤，最终定容于100ml容量瓶，即得样品提取液。

[0092] 2.4样品检测

[0093] 2.4.1甘露醇标准曲线绘制

[0094] 精密称取D-甘露醇标准品0.1g于烧杯中，加少量蒸馏水溶解完全，转移置100mL容量瓶中定容，配制成1mg/mL的甘露醇溶液，进行稀释后，得到质量浓度分别为10、50、90、130、170mg/L的甘露醇标准溶液。精密量取各浓度的甘露醇标准溶液1ml于5个10mL刻度试管中，加1mL高碘酸钾溶液，混匀，室温反应10min，加2mL 0.1％的L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸钾，振荡混匀，加4mL新鲜配制的Nash试剂53℃水浴15min使其呈色，之后快速冷却至室温，用分光光度计在412nm波长处，测定其吸光度。以蒸馏水代替甘露醇标准溶液，用同样的方法操作作为对照，测定其吸光度。以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐
2
标，绘制标准曲线，得回归方程：Y＝0.0826X+0.0019，R ＝0.9998，说明标准品甘露醇量在
0～170mg/L范围内，与Abs呈良好的线性关系。

[0095] 2.4.2样品检测

[0096] 将样品提取液进行8倍稀释，精确移取1ml稀释后的样品提取液，置于具塞试管中，加1mL高碘酸钾溶液，混匀，室温反应10min，加2mL 0.1％的L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸钾，振荡混匀后，加4mL新鲜配制的Nash试剂53℃水浴15min使其呈色，之后快速冷却至室温，用分光光度计在412nm波长处，测定其吸光度。以蒸馏水代替甘露醇标准溶液，用同样的方法操作作为对照。每管样品测3次Abs，求出平均值。求出5管样品总Abs平均值，带入标准曲线，求出样品中甘露醇的含量。

[0097] 2.5实验数据处理

[0098]

[0099] M：虫草酸含量(mg/g)；a：稀释倍数；C：待测液虫草酸浓度(mg/mL)；

[0100] V：提取溶液体积(mL)；W：测试样品量(g)

[0101] 3腺苷含量检测：采用高效液相色谱法测定

[0102] 3.1仪器与试药

[0103] Waters高效液相色谱仪(1525 BINARY HPLC PUMP，2998 Photodiode Array Detector，美国Waters公司)；

[0104] SB25-12DT超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；

[0105] AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；

[0106] Millipore Simplicity超纯水仪(美国Millipore公司)；

[0107] 乙腈(HPLC级，Fisher)；

[0108] 磷酸二氢钾(AR级，国药集团化学试剂有限公司)；

[0109] 石油醚(AR级，60-90℃，国药集团化学试剂有限公司)；

[0110] 腺苷(A9251-1G，Sigma公司)；

[0111] 样品：蝉拟青霉培养物。

[0112] 3.2方法

[0113] 3.2.1色谱条件

[0114] 色谱柱：XBridge C18色谱柱(Waters，4.6mm×250mm，5μm)；

[0115] 流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5∶95)；

[0116] 流速：1.0mL/min；

[0117] 检测波长：260nm；

[0118] 柱温：35℃；

[0119] 进样量：20μL。

[0120] 3.2.2对照品溶液的制备

[0121] 精密称取50mg腺苷对照品，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度制成1mg/mL溶液。精密移取适量1mg/mL腺苷对照品溶液，分别配制成5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL腺苷对照品溶液，备用。

[0122] 3.2.3供试品溶液的制备

[0123] 取约1.0g样品粉末，精密称定，置具塞100mL茄形瓶中，加石油醚10mL，密塞，超声20分钟，滤过，弃去石油醚，取样渣挥干，连同滤纸一并置具塞茄形瓶中，加8mL超纯水超声提取30分钟，滤纸过滤得滤液，滤渣用少量超纯水清洗3次滤过，合并滤液置10mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀，过0.22μm微孔滤膜，备用。

[0124] 3.2.4标准曲线绘制

[0125] 将对照品5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL溶液进样，按2.1项下色谱条件测定，以样品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(微伏·秒)为纵坐2
标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝69728.78X+2633.007，R ＝0.999992，在5～50μg/mL与峰面积线性关系良好。

[0126] 3.2.5精密度试验

[0127] 取腺苷对照品溶液5μg/mL按前述色谱条件连续进样5次，平均保留时间为6.741min，保留时间RSD为0.4％，峰面积RSD为0.4％，结果表明方法精密度良好。

[0128] 3.2.6供试品腺苷含量测定

[0129] 取3.2.3项下制备的供试品溶液，加超纯水稀释10倍，混匀，制成待测液。取待测液按3.2.1项下色谱条件进样5次，分别由回归方程得待测液腺苷浓度，计算平均浓度A，根据下列公式得到供试品腺苷含量(mg/g)。

[0130] 计算公式：

[0131]

[0132] M：腺苷含量(mg/g)

[0133] C：待测液浓度(μg/mL)

[0134] W：样品质量(g)

[0135] 4试验结果

[0136] 表2饲料添加剂主要有效成分的检测结果

[0137]

[0138] 由上可见，采用本发明的生产工艺所得饲料添加剂成品经检测多糖含量高达130-250mg/g、虫草酸为11-20mg/g、腺苷为0.14-0.19mg/g，适用于作为促进生长饲料添加剂。

[0139] 实施例5蝉拟青霉饲料添加剂对肉鸡喂养试验

[0140] 1材料与方法

[0141] 1.1试验鸡选择及分组

[0142] 选择2日肉鸡600只，体重45～50克。经观察6小时无异常，然后将其随机分成2组，每组150只。1组为添加0.2wt％本发明实施例2的蝉拟青霉饲料添加剂样品的试验组，每组设3个重复，每个重复为50只；2组为空白对照组。

[0143] 1.2试验动物日粮组成与营养

[0144] 采用安徽牧仕达饲料科技有限公司生产的肉鸡全价配合颗粒饲料，将样品添加剂按照0.2wt％的比例添加到基础日粮(粉碎的颗粒料)中并搅拌混匀，经测定变异系数小于8％，空白试验组仅喂养颗粒料粉碎的粉料。

[0145] 1.3试验时间

[0146] 试验期为35天。

[0147] 1.4样品的采集时间、地点、部位及采集处理方法

[0148] 体重：3日龄在饲喂前称初生重。以后每周末称重一次，晨空腹时逐群称量每一组鸡的体重。

[0149] 采食量：每天回收剩料，计算每周各组饲料消耗。

[0150] 养殖期每组随机取肉鸡9只，每个重复3只，末羽下静脉采血，参照试剂盒方法分析血液生化指标。屠宰后，取肉样进行分析。

[0151] 1.5测试指标及测试方法

[0152] 日增重＝(期末重-期初重)/饲养周期

[0153] 料肉比＝期末耗料总量/期末增重总量

[0154] 2试验结果

[0155] 2.1各组全期增重效果及料肉比

[0156] 表3饲料添加剂对肉鸡生产性能的影响

[0157]

[0158] 表3结果可以看出，在整个养殖周期内试验组的肉鸡日增重明显。

[0159] 肉鸡样本期末重与对照组相比，肉鸡活体重提高了9.24％。

[0160] 从全期耗料量来看，试验组肉鸡的耗料量相对最低，料重比仅为1.81，与对照组相比，料重比降低了5.24％。

[0161] 2.2各组肉鸡血液生化指标

[0162] 表4各组肉鸡血液生化指标

[0163]

[0164] 注：相同指标，不同试验组后数据后不同小写字母，表示在95％的置信区间，差异性显著(P＜0.05)，下同。

[0165] 表4的试验结果表明，试验组肉鸡血液中总蛋白含量明显增加，降低碱性磷酸酶含量，经统计分析差异达显著水平(P＜0.05)。而对其它生化指标均未构成显著性影响。

[0166] 2.3各组肉鸡肌肉品质

[0167] 表5各组肉鸡肌肉品质指标

[0168]

[0169] 肉鸡肌肉品质分析结果如表5示，结果表明，与空白组相比，试验组能明显降低肉的系水损失，增加粗蛋白含量，提高肌间脂肪含量，经统计分析差异达显著水平(P＜0.05)。

[0170] 如采用实施例1和3的饲料添加剂替换实施2的饲料添加剂，其效果与采用实施例2的饲料添加剂相比无显著差异。

[0171] 结论：嫩度是满足人们口感的一个指标。嫩度主要跟肌肉脂肪含量及其化学状态有关。肌肉脂肪含量越高，肉就越嫩，而系水力和失水率跟肉的嫩度有很大的相关，在一定范围内，系水力越高，失水率越低，肉质越嫩。粗蛋白含量越高，肉质越鲜。以上研究表明，蝉拟青霉饲料添加剂可明显增加肉鸡体重，提高肌肉的蛋白含量，增加鸡肉的嫩度。