一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡及其制备方法

摘要

本发明涉及生物技术制药领域，特别涉及一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡及其制备方法。本发明的制备方法包括：将聚乙二醇溶液和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖溶液进行混悬，之后加入三嵌段高分子乳化，之后再加入蛋白大分子药物乳化，然后在交联剂的催化下形成稳定的内水相，最后透析除去连续相聚乙二醇，冻干后收集得到稳定的纳米囊泡。与现有技术相比，本发明的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法选择了内水相交联的方法，可避免囊泡在体内输送时渗透压改变后容易破裂和药物漏出的情况出现。

权利要求

1.一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将重量百分比浓度为1-20%的甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖溶液1-50份与重量百分比浓度为1-30%的聚乙二醇溶液50-90份混合均匀，形成混悬液；

2）向混悬液中加入三嵌段高分子0.01-10份，乳化1-4小时，之后加入蛋白大分子药物0.1-50份，乳化1-4小时，形成分散在聚乙二醇和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖两相中的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡；所述三嵌段高分子结构式为：其中，n≥3，m≥3；

3）向步骤2）的纳米囊泡乳化液中加入交联剂，交联1-2小时，之后经透析袋透析1-24小时，冻干后除去水分即可得到包裹蛋白大分子药物高分子纳米囊泡，以上各组分均以重量份计。

2.如权利要求1所述的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖的分子量为1000-10000道尔顿。

3.如权利要求1所述的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为2000-35000道尔顿。

4.如权利要求1所述的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述蛋白大分子药物可选自β-半乳糖苷酶、FITC-BSA、小牛血清蛋白、干扰素或促红细胞生成素的一种或几种。

5.如权利要求1所述的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述交联剂包括重量百分比浓度为1-4%的四甲基乙二胺溶液1-10份和浓度为1-18mg/mL的过硫酸铵溶液1-10份。

6.如权利要求1所述的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述透析袋分子量为10000-1000000道尔顿。

7.如权利要求1所述的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述包裹蛋白大分子药物高分子的纳米囊泡的粒径为10-5000nm。

8.一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡，其特征在于，包括以重量份计的以下组分：三嵌段高分子 0.01-10份；

包裹蛋白大分子药物的甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖颗粒组合物90-99.99份；

其中，所述三嵌段高分子结构式为：

其中，n≥3，m≥3。

9.如权利要求8所述的一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡，其特征在于，所述包裹蛋白大分子药物的甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖颗粒组合物包括以重量份计的以下组分：蛋白大分子药物 0.1-50份；

甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖颗粒组合物 50-99.9份。

说明书

一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术制药领域，特别涉及一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡及其制备方法。

背景技术

[0002] 研究发现，大部分蛋白质在体内的半衰期平均约为10分钟，进入体内的蛋白质会快速的被体内各种蛋白酶所清除。特别是蛋白药物复杂的三、四级结构，在制备和体内给药过程中很容易变性失活，半衰期非常短。面临胃肠道的酶的降解、肝的首过效应等障碍，蛋白构像极易受到体内酸碱、电荷等微环境影响而发生变化，并且构像变化后，不仅丧失原有的活性，而且完全改变蛋白的性质，甚至诱导有害免疫反应，使之从良药变为毒药，如促红细胞生成素（EPO），聚集后引起免疫原性。因此，蛋白药物中蛋白质稳定性问题决定了蛋白药物成败。

[0003] 在过去的几十年里，文献中见到过各种关于提高蛋白质在纳米包封过程中稳定性的方法的报道。但是，这些方法只能解决单个问题，而对于此类的其他问题却不能兼顾，甚至会带来新的问题。目前成功用于临床的主要有脂质体和纳米粒。传统的脂质体虽然组织相容性比较好，但是脂质体膜很薄，机械强度相对较弱，对微环境比较敏感而产生不稳定，尤其是某些水溶性药物包封率较低，并且药物极易从脂质体中渗漏，因此稳定性差亦是脂质体商品化过程亟待解决的问题。

[0004] 而以高分子为构成框架的纳米粒，虽然机械强度满足体内的输送要求，但其通常为疏水的内核，在运输亲水性的蛋白时容易导致蛋白分子的变性失活。具有代表性的生物可降解微/纳米载体有：（1）PLGA、PLA等微/纳米粒载体类，其优点是生物相容和生物可降解；缺点是包封率低、在微囊包蛋白药物时难以保持它的自然构象（由于制备过程用到有机溶剂存在油水界面，而导致蛋白变性失活）、及它的降解速率慢难以实现在内吞体内逃逸到细胞浆里[Waeckerle-Men Y.,Groettrup M.PLGA microspheres for improved antigen delivery to dendritic cells as cellular vaccines.Adv.Drug Delivery Rev.,2005,57:475-482.]。（2）聚γ-谷氨酸类纳米粒子载体，γ-PGA本身是溶于水的，故很难直接用来微囊包蛋白等药物，故需要修饰成两亲性或疏水性的高分子化合物如聚γ-谷氨酸与聚L-苯丙氨酸乙酯共聚物（γ-PGA-L-PAE）。优点是具有生物相容性和生物降解性；缺点是包封率低于50%，制备过程中存在油水界面，难以保持亚单位蛋白疫苗的自然构象，生物降解慢[Yoshikawa T.,Okada N.,Oda A.,et al.Nanoparticles built by self-assembly of amphiphilic gamma-PGA can deliver antigens to antigen-presenting cells with high efficiency:a new tumor-vaccine carrier for eliciting effector T cells.Vaccine,2008,26:1303-1313.]。

[0005] 结构脆弱的蛋白大分子药物体内输送剂型开发需要一个能够全面解决上述所有问题而且简便易行的技术方案。经过对现有技术文献的检索发现，[CHEN,Li;ZHU,Hua;JIN,Tuo;THE PREPARATION METHOD OF A STABLE PLOYMER AQUEOUS PHASE-PHASE EMULSION AND ITS USE,Publication Number International:WO/202/000778,Application No.:PCT/CN2001/001033](陈励；朱华；金拓；稳定的高分子水相-水相乳液的制备及其应用，公开号为，WO/2002/000778，国际申请号为PCT/CN2001/001033),该专利公开了一种新型的稳定的乳液（高分子水相-水相乳液）及其制备方法和在制药及其生物技术中的应用。该乳液与常规乳液的根本区别在于其分散相和连续相均为水溶液，因此对亲水性的蛋白大分子有个良好的内水相微环境。但是，该乳液在体内输送时外水相聚乙二醇被稀释会造成渗透压改变，内水相破裂，蛋白大分子溶液释放出来。蛋白药物在体内输送仍然是亟待解决的问题。

发明内容

[0006] 本发明的第一目的在于提供一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，以解决现有技术中的蛋白药物囊泡在体内输送时容易破裂和药物漏出的技术性问题。

[0007] 本发明的第二目的在于提供一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡，以解决现有技术中的蛋白药物囊泡在体内输送时容易破裂和药物漏出的技术性问题。

[0008] 本发明目的通过以下技术方案实现：

[0009] 一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

[0010] 1）将重量百分比浓度为1-20%的甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖溶液1-50份与重量百分比浓度为1-30%的聚乙二醇溶液50-90份混合均匀，形成混悬液；

[0011] 2）向混悬液中加入三嵌段高分子0.01-10份，乳化1-4小时，之后加入蛋白大分子药物0.1-50份，乳化1-4小时，形成分散在聚乙二醇和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖两相中的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡；

[0012] 3）向步骤2）的纳米囊泡乳化液中加入交联剂，交联1-2小时，之后经透析袋透析1-24小时，冻干后除去水分即可得到包裹蛋白大分子药物高分子纳米囊泡，以上各组分均以重量份计。

[0013] 优选地，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖的分子量为1000-10000道尔顿。

[0014] 优选地，所述聚乙二醇的分子量为2000-35000道尔顿。

[0015] 优选地，所述三嵌段高分子结构式为：

[0016]

[0017] 其中，n≥3，m≥3。

[0018] 优选地，所述蛋白大分子药物可选自β-半乳糖苷酶、FITC-BSA、小牛血清蛋白、干扰素或促红细胞生成素的一种或几种。

[0019] 优选地，所述交联剂包括重量百分比浓度为1-4%的四甲基乙二胺溶液1-10份和浓度为1-18mg/mL的过硫酸铵溶液1-10份。

[0020] 优选地，所述透析袋分子量为10000-1000000道尔顿。

[0021] 优选地，所述包裹蛋白大分子药物高分子的纳米囊泡的粒径为10-5000nm。

[0022] 一种包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡，包括以重量份计的以下组分：

[0023] 三嵌段高分子 0.01-10份；

[0024] 包裹蛋白大分子药物的甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖颗粒组合物90-99.99份。

[0025] 优选地，所述包裹蛋白大分子药物的甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖颗粒组合物包括以重量份计的以下组分：

[0026] 蛋白大分子药物 0.1-50份；

[0027] 甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖颗粒组合物 50-99.9份。

[0028] 与现有技术相比，本发明有以下优点：

[0029] 1、本发明的包裹蛋白大分子药物的纳米囊泡的制备方法选择了内水相交联的方法，可避免囊泡在体内输送时渗透压改变后容易破裂和药物漏出的情况出现；

[0030] 2、本发明的纳米囊泡可以保持蛋白大分子药物的活性，囊泡组合物的表面光滑圆整，颗粒规整无粘连，粒径可以根据需要进行调控，其冻干粉微白色细腻，均匀度好，疏松，不会塌陷，分散性良好；

[0031] 3、本发明选择了浓度和比例合适的聚乙二醇溶液和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖溶液，蛋白有了主动包封机制更容易进入内水相，提高了囊泡包封率，避免了用常规的W/O和W/O/W的包封率不高的缺点；

[0032] 4、本发明的包裹蛋白的方法，可以避免制备方法对药物的治疗作用的影响，尤其是物理化学性质不稳定，对油水界面敏感的药物，如生物大分子药物；

[0033] 5、在本发明中，将三嵌段高分子根据相导向分布在内水相的表面，形成囊泡，不仅在制剂中降低表面张力（可以调节囊泡粒径大小），而且为靶向基团提供了连接的平台；

[0034] 6、在本发明的制备方法中，交联剂可使得囊泡在体内输送不会因为渗透压而破裂，改善了囊泡的机械强度。

附图说明

[0035] 图1为包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡的扫描电镜图；

[0036] 图2为包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡的MTT毒性检测示意图；

[0037] 图3为包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡的稳定性检测示意图，

[0038] 图中：

[0039] A)为未加入交联剂的囊泡在显微镜中明场的图像；B）为未加入交联剂的囊泡相同视野下在绿色荧光视野下图像;C）为未加入交联剂的囊泡10倍稀释后在绿色荧光视野下图像；D)为加入交联剂的囊泡在显微镜中明场的图像；E）为加入交联剂的囊泡相同视野下在绿色荧光视野下图像；F）为加入交联剂的囊泡10倍稀释后在绿色荧光视野下图像；Bar=100μm；

[0040] 图4为不同剂型β-半乳糖苷酶活性的比较示意图，

[0041] 图中：

[0042] A表示原液；B表示囊泡中释放出的蛋白；C表示油水界面的蛋白；

[0043] 图5为包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡的平均粒径图。

具体实施方式

[0044] 以下结合实施例对本发明做详细说明。以下实施例以本发明的技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但该些实施例不用于限定本发明的保护范围。

[0045] 实施例1 包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡的制备

[0046] 用超纯水分别配置聚乙二醇水溶液和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖水溶液，步骤如下：精确称取20克聚乙二醇和1克甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖放在100毫升的烧杯中分别加水30、49克，磁力搅拌30分钟，待聚乙二醇和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖全部溶解取下待用。用电子天平精确称取80毫克FITC-BSA蛋白溶于720微升水中待用。按以下步骤制备：

[0047] 1）将上述的聚乙二醇水溶液和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖水溶液按照体积比例分别为1∶1、1∶5、1∶8、1∶10在四个不同的西林瓶中先磁力搅拌混匀，使之形成水相-水相乳液。

[0048] 2）向各个西林瓶中分别加入三嵌段高分子1mg，磁力搅拌4小时。

[0049] 3）分别向四个西林瓶加入相同的上述蛋白溶液，磁力搅拌4小时，使蛋白主动分配到内水相中。

[0050] 4）向各个西林瓶中分别加入浓度为20%的四甲基乙二胺40微升和浓度为50mg/mL的过硫酸铵72微升交联2小时。

[0051] 5）将步骤4）中的溶液分别用分子量为100000道尔顿的透析袋透析12小时。

[0052] 6）将透析后的溶液分别于-80℃冷冻过夜，在真空冷冻干燥机中冻干，即可得到包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡，囊泡的粒径在100-5000nm，表面光滑圆整，粒径分布均匀。

[0053] 实施例2 包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡的毒性检测

[0054] 采用MTT法测定纳米囊泡的毒性，以PEI25kDa作为阳性对照组，不做任何处理的细胞为阴性对照组。首先，接种细胞，将COS-7细胞消化，稀释成密度为1.0-5.0*104/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL，培养过夜。第二步将2mg/mL的囊泡溶液稀释成不同的浓度梯度，终体积为100μL，阳性对照组PEI25kDa稀释为与待测样品组一致的浓度梯度。取出细胞，移除有血清的培养基，用100μL的PBS洗一遍，再加入无酚红无血清的培养基。然后加入聚阳离子溶液和阳性对照组PEI25kDa，阴性对照组中加入100μL的水。4小时之后，除去培养液和聚阳离子溶液，每孔加入100μL的无酚红无血清培养基，避光条件下再加入25μL的MTT溶液，置于细胞培养箱中培养6小时。显微镜下观察活细胞的结晶情况，完全结晶后，则加入100μLDMSO放置10min酶标仪570nm处测定结果，630nm处做对照，结果如图2所示。结果显示：在COS-7细胞当中，纳米囊泡的毒性远小于对照组PEI25kDa。即使在浓度150μg/mL时，细胞存活率仍然达到95%。

[0055] 实施例3 包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡的稳定性检测

[0056] 用10倍体积纯水稀释由实施例1得到的包裹FITC-BSA蛋白的纳米囊泡，在荧光显微镜下观察到纳米囊泡没有破裂，仍能观察到绿色的FITC-BSA蛋白被交联的内水相包封。而对照组中没有交联的囊泡出现破裂，蛋白从囊泡中渗漏出，溶液中弥散着绿色的FITC-BSA蛋白，如图3所示。由此可见，本发明的制备方法的交联方法可以解决纳米囊泡稳定性的问题，更有利于包裹蛋白的纳米囊泡在体内的输送。

[0057] 实施例4 包裹β-半乳糖苷酶的纳米囊泡的制备

[0058] 用超纯水分别配置不同分子量的聚乙二醇（分子量分别为4000、8000、20000、35000）水溶液和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖水溶液，步骤如下：精确称取20克聚乙二醇和1克甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖放在100毫升的烧杯中分别加水30、49克，磁力搅拌
30分钟，待聚乙二醇和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖全部溶解取下待用。用电子天平精确称取80毫克FITC-BSA蛋白溶于720微升水中待用。按以下步骤制备：

[0059] 1）将上述的聚乙二醇水溶液和甲基丙烯酸缩水甘油酯葡聚糖水溶液按照1∶10的体积比例在西林瓶中先混匀，使之形成水相-水相乳液。

[0060] 2）加入三嵌段高分子1mg，磁力搅拌4小时。

[0061] 3）加入上述蛋白溶液，磁力搅拌4小时，使蛋白主动分配到内水相中。

[0062] 4）加入浓度为20%的四甲基乙二胺40微升和浓度为50mg/mL过硫酸铵72微升交联2小时。

[0063] 5）将步骤4）中的溶液用分子量为100000道尔顿的透析袋透析12小时。

[0064] 6）将透析后的溶液于-80℃冷冻过夜，在真空冷冻干燥机中冻干，即可得到包裹β-半乳糖苷酶的纳米囊泡，纳米囊泡的粒径随着聚乙二醇分子量的增大而变小。

[0065] 实施例5 包裹β-半乳糖苷酶的纳米囊泡中的β-半乳糖苷酶活性的检测[0066] 称取KCl粉末0.075g、MgSO4粉末0.012g，并量取磷酸钠缓冲液10ml，以及β－巯基乙醇0.27ml，加水至100ml，得到Z－Buffer溶液。另取0.008g邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）粉末，加入1.92g上述Z－Buffer溶液，配置成4mg/ml ONPG溶液。取β－半乳糖苷酶适量，以Z－Buffer缓冲液稀释，配制成20μg/ml的蛋白质溶液。分别取蛋白溶液0，2.5，5，10，20，40，60μl，以Z－Buffer缓冲液精密稀释至100μl，再分别加入1ml Z－Buffer溶液，精密加入200μl ONPG溶液，37℃水浴摇床中孵育，精确控制时间与温度，第八分钟时以1M的碳酸钠溶液500μl终止反应。紫外－可见分光光度仪于λ＝420nm处测定可见光吸光度，建立标准曲线。同时，将实施例4制备的包裹β-半乳糖苷酶的纳米囊泡的释放液与ONPG溶液反应，按上述方法测量可见光吸收度，代入标准曲线来考察包裹β-半乳糖苷酶的纳米囊泡中的β-半乳糖苷酶活性，如图4所示，发现囊泡使得蛋白质的结构得到很好的保护，避免了β-半乳糖苷酶在剂型制备过程中失活。

[0067] 实施例6 纳米囊泡的粒径检测

[0068] 将实施例1制备的纳米粒囊泡溶于1mL纯水中，在室温条件下，采用动态光散射技术测定溶液中复合物的水化半径，所用仪器为英国马尔文公司的Nano-S激光粒度仪，入射光为He-Ne离子激光（λ=633nm），光散射角度为90°，折射介质设置为水，折射率为1.33，粘度为0.8872cP，每个样品测定3次，取平均值作图，请参考图5。结果显示，纳米囊泡的粒径在100-5000nm范围内。

[0069] 以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。