杜仲叶提取物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种杜仲叶水和/或低级醇提取物及其制备方法和应用，包括杜仲叶用水或者低级醇提取，或者用水和低级醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲叶提取物。该提取物在制备促进骨折愈合药物中的应用效果显著。本发明提供杜仲叶水和/或低级醇提取物可以显著增加碱性磷酸酶，降低血钙，增加血磷，增加骨密度，能明显促进骨折后骨的愈合。另外，研究杜仲叶的提取物的应用，可增加杜仲植物的药用部位，扩大其应用范围，并由于杜仲叶与杜仲皮相比，更易获得，可降低杜仲的成本。

权利要求

1.一种杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物采用如下方法制备：杜仲叶药材干燥粉碎后，用体积百分浓度为45%~55%的乙醇溶液提取三次，各次所用乙醇溶液质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流时间依次为2h、1.5 h和1h，将三次提取液过滤后合并，回收乙醇，得醇提液；乙醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得水提液；

先将水提液浓缩后用体积百分浓度不低于90%的乙醇沉淀后与所述的醇提液合并，然后依次经HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化得到精制杜仲叶提取物；

所述的HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化过程为：将乙醇沉淀后的水提液与所述的醇提液合并后加水调节浓度为0.01 g药材/ml，同时调节pH=4，得到上样液，上HPD100大孔树脂吸附柱，经体积百分浓度为50~60%的乙醇洗脱，减压回收洗脱液中的乙醇至无醇味，得HPD100大孔树脂洗脱液； 将HPD100大孔树脂洗脱液调节至浓度为0.01 g药材/ml，上30-60目聚酰胺树脂柱经体积百分浓度为40%~50%的乙醇洗脱得洗脱液，然后减压回收洗脱液中的乙醇后，继续减压蒸出水溶液，至小体积，为洗脱浓缩液；将洗脱浓缩液经65~70℃，在负压0.08MPa 条件下进行干燥，得精制杜仲叶提取物。

2.根据权利要求1所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的精制后杜仲叶提取物中包含4种黄酮类化合物和绿原酸，所述的4种黄酮类化合物为：芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1 → 2)-β-D-葡萄糖基苷，所述的精制后杜仲叶提取物中4种黄酮类化合物和绿原酸的质量百分含量不低于50%。

3.一种促进骨折愈合的药物，其特征在于由治疗有效量的权利要求1~2中任意一项所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物加上药学上可接受的辅料制成制剂，所述的制剂选自丸剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂。

4.权利要求1~2中所述的任意一项杜仲叶水和/或低级醇提取物在制备促进骨折愈合的药物中的应用。

说明书

杜仲叶提取物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及一种杜仲叶提取物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 杜仲为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥树皮，是中国名贵滋补药材。具补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等诸多功效。《神农本草经》列为上品。谓其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余沥。久服，轻身耐老。”杜仲是中国特有药材，其药用历史悠久，在临床有着广泛的应用。迄今已在地球上发现杜仲属植物多达14种，后来它们在大陆和欧洲相继灭绝。存在于中国的杜仲是杜仲科杜仲属仅存的孑遗植物，它不仅有很高的经济价值。

[0003] 近年来，国内外专家对杜仲成分进行了反复细致的研究，发现杜仲中含有对人体所必须的苏氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，赖氨酸等17种游离氨基酸，以及锌，铜，镁，铁，钙，磷，钾等15种微量元素。杜仲具有补肝肾，强筋骨，清除体内垃圾，加强人体细胞物质代谢，防止肌肉骨骼老化，平衡人体血压，分解体内胆固醇，降低体内脂肪，恢复血管弹性，利尿清热，广谱抗菌，兴奋中枢神经，提高白血球数量，增强人体免疫力等显著功效。

[0004] 现有的杜仲入药部位为杜仲皮，杜仲皮的采集方法为：将栽培10年以上的杜仲，用半环剥法剥取树皮后进行加工。由于杜仲树数量稀少，且为保证药材的质量需要杜仲生长至10年或以上的树龄才能采集杜仲皮，同时由于杜仲的药用价值巨大，所以致使其价格昂贵。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种杜仲叶水和/或低级醇提取物，包括杜仲叶粗提物和杜仲叶精提物。

[0006] 本发明的又一目的在于提供杜仲叶水和/或低级醇提取物在制备抗骨折药物中的应用。

[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

[0008] 一种杜仲叶水和/或低级醇提取物，其在于所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物包括杜仲叶用水或者低级醇提取，或者用水和低级醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲叶提取物。

[0009] 水提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物的方法：杜仲叶药材干燥粉碎后，用水提取三次，各次所用水的质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流时间依次为2h、1.5h和1h，将三次提取液过滤后，合并滤液并浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。

[0010] 乙醇提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物的方法：杜仲叶药材干燥粉碎后，用体积百分浓度为45％～55％的乙醇溶液提取三次，各次所用乙醇溶液质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流时间依次为2h、1.5h和1h，将三次提取液过滤后合并，回收乙醇，得醇提液；将醇提液浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。

[0011] 水和乙醇混合提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物的方法：杜仲叶药材干燥粉碎后，用体积百分浓度为45％～55％的乙醇溶液提取三次，各次所用乙醇溶液质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流时间依次为2h、1.5h和1h，将三次提取液过滤后合并，回收乙醇，得醇提液；乙醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得水提液；将水提液和醇提液合并后浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。

[0012] 水和乙醇混合提取杜仲叶时，对粗提物进行精制的方法为：先将水提液浓缩后用体积百分浓度不低于90％的乙醇沉淀后与所述的醇提液合并，然后依次经HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化得到精制杜仲叶提取物。

[0013] 所述的HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化过程为：将乙醇沉淀后的水提液与所述的醇提液合并后加水调节浓度为0.01g药材/ml，同时调节pH＝4，得到上样液，上HPD100大孔树脂吸附柱，经体积百分浓度为50～60％的乙醇洗脱，减压回收洗脱液中的乙醇至无醇味，得HPD100大孔树脂洗脱液；

[0014] 将HPD100大孔树脂洗脱液调节至浓度为0.01g药材/ml，上30-60目聚酰胺树脂柱经体积百分浓度为40％～50％的乙醇洗脱得洗脱液，然后减压回收洗脱液中的乙醇后，继续减压蒸出水溶液，至小体积，为洗脱浓缩液；将洗脱浓缩液经65～70℃，在负压0.08Mpa条件下进行干燥，得精制杜仲叶提取物。

[0015] 精制的杜仲叶提取物中包含4种黄酮类化合物和绿原酸，所述的4种黄酮类化合物为：芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖基苷，所述的精制后杜仲叶提取物中4种黄酮类化合物和绿原酸的质量百分含量不低于50％。

[0016] 一种促进骨折愈合的药物，其在于由治疗有效量的杜仲叶水和/或低级醇提取物加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成制剂，所述的制剂包括丸剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射或复方制剂。

[0017] 上杜仲叶水和/或低级醇提取物在制备促进骨折愈合的药物中的应用。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 本发明提供杜仲叶提取物可以显著增加碱性磷酸酶，降低血钙，增加血磷，增加骨密度，能明显促进骨折后骨的愈合。另外，研究杜仲叶的提取物的应用，可增加杜仲植物的药用部位，扩大其应用范围，并由于杜仲叶与杜仲皮相比，更易获得，可降低杜仲的成本。

具体实施方式

[0020] 实施例1杜仲叶提取物的制备

[0021] I.水提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物(即杜仲叶水提取液)

[0022] 杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度1～3mm2)，用水提取三次，各次所用水的质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流时间依次为2h、1.5h和1h，将三次提取液过滤后，合并滤液并浓缩至2.857g生药/ml，得到杜仲叶粗提物。

[0023] II.乙醇提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物(即杜仲叶醇提取液)

[0024] 杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度1～2
3mm)，按质量计，加入10倍量体积百分浓度为50％的乙醇浸泡2h，回流2h，过滤得到第一次提取液；加入8倍量体积百分浓度为50％乙醇回流1.5h，过滤得到第二次提取液；加入
6倍量体积百分浓度为50％乙醇回流1h，过滤得到第三次提取液；合并三次提取液，回收乙醇，并浓缩至2.857g生药/ml，得到杜仲叶粗提物。

[0025] III.水和乙醇混合提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物(即杜仲叶醇水混合提取液)[0026] 杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度1～2
3mm)，按质量计，加入10倍量体积百分浓度为50％乙醇浸泡2h，回流2h，过滤得到第一次提取液；加入8倍量体积百分浓度为50％乙醇回流1.5h，过滤得到第二次提取液；加入6倍量体积百分浓度为50％乙醇回流1h，过滤得到第三次提取液；合并三次提取液，回收乙醇，得醇提液。乙醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得水提液。合并醇提液与水提液，并浓缩至2.857g生药/ml，得到杜仲叶粗提物。

[0027] IV.制备精制杜仲叶提取物

[0028] 杜仲叶药材经醇、水混合提取后，水提液经乙沉淀后与醇提液合并，再经HPD100大孔树脂富集和聚酰胺纯化后可以制备得到精制杜仲叶提取物。

[0029] 1.药材提取方法

[0030] 杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度1～2
3mm)，按质量计加入10倍量体积百分浓度为50％的乙醇浸泡2h，回流2h，过滤得到第一次提取液；加入8倍量体积百分浓度为50％的乙醇回流1.5h，过滤得到第二次提取液；加入6倍量体积百分浓度为50％的乙醇回流1h，过滤得到第三次提取液。合并三次提取液，回收乙醇至无醇味，得醇提液。

[0031] 乙醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得提取液。水浴浓缩，以水定容至浓度为1g生药/ml的水提液。

[0032] 2.水提液的乙醇沉淀方法

[0033] 取浓度为1g生药/ml的水提液，加入体积百分浓度为95％的乙醇液，使体系中乙醇浓度达到70％，静置2h，过滤，得滤液。沉淀物用体积百分浓度为50％的乙醇液反复洗涤，合并洗涤液到滤液之中。回收乙醇至无醇味，得乙醇沉淀后的水提液。

[0034] 3.杜仲叶总提取液的制备方法

[0035] 合并杜仲叶的醇提液和乙醇沉淀后的水提液，得杜仲叶总提取液。

[0036] 4.HPD100大孔树脂富集方法

[0037] HPD100大孔树脂预处理方法：将HPD100大孔树脂适量，用1.5倍体积的95％乙醇浸泡12h，去掉悬浮物，装柱，用95％乙醇洗柱，至流出液加水无浑浊为止。换用蒸馏水冲洗，洗至无醇味。

[0038] 柱子的径高比：1∶9。

[0039] 上样液的制备：取杜仲叶总提取液，加水调节浓度为0.01g药材/ml，同时加入适量浓盐酸，使体系的pH＝4，该液体为HPD100大孔树脂上样液。

[0040] 上样量：1g药材/1g干树脂，1g干树脂＝湿树脂4.4ml。即100mlHPD100大孔树脂上样液需要4.4ml湿树脂。

[0041] 上样流速：6BV/h。

[0042] 除杂条件：使用2BV的pH＝4的盐酸水溶液除杂，以2BV/h流速冲洗。

[0043] 乙醇洗脱条件：用体积百分浓度为55％的乙醇洗脱，速度2BV/h，洗脱体积为6BV。

[0044] 洗脱液的回收：减压回收洗脱液中的乙醇至无醇味，得HPD100大孔树脂洗脱液。

[0045] 树脂再生方法：树脂经95％乙醇冲洗至无色，即可再次使用。

[0046] 4.聚酰胺树脂纯化方法

[0047] 30-60目聚酰胺树脂预处理方法：采用1.5倍量的95％乙醇浸泡12h，去掉悬浮物，装柱，95％乙醇洗柱，至流出液加水无浑浊。再换用蒸馏水冲洗，至无乙醇流出。

[0048] 柱子的径高比：径高比为1∶10。

[0049] 上样液的制备：取HPD100大孔树脂洗脱液，加水调节浓度为0.01g药材/ml，为30-60目聚酰胺树脂上样液。

[0050] 上样量：上样量为0.5g药材/1g干聚酰胺树脂，1g聚酰胺树脂干树脂＝湿树脂4.4ml。即100ml30-60目聚酰胺树脂上样液需要8.8ml湿的聚酰胺树脂。

[0051] 上样流速：上样流速为2BV/h。

[0052] 乙醇洗脱条件：用体积百分浓度为45％的乙醇洗脱，以4BV/h的流速进行，洗脱液的用量8BV。

[0053] 洗脱液的回收：减压回收洗脱液中的乙醇后，继续减压蒸出水溶液，至小体积，为洗脱浓缩液。

[0054] 干燥：经65～70℃，在负压0.08Mpa条件下进行干燥，得精制杜仲叶提取物。

[0055] 树脂再生方法：使用2-3％NaOH2BV浸泡过夜，水溶液洗至中性无色，再用95％乙醇洗至无色，即可再次使用。

[0056] 精制杜仲叶提取物的得率：约为3.5％。

[0057] 实施例2精制杜仲叶提取物中各成分含量检测方法

[0058] 采用HPLC法，同时检测杜仲叶提取物中的5种成分的含量，它们分别为：绿原酸，槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖基苷(以下简称为：DY-1)，芦丁，异槲皮苷，紫云英苷。使用外标一点法计算杜仲叶提取物样品中各成分含量。

[0059] 1.样品配制

[0060] 1.1混合对照品的配制

[0061] 精密称取绿原酸对照品4.89mg，体积百分浓度为50％的乙醇溶解，定容至10ml，得到浓度为489μg/ml的绿原酸对照品溶液；

[0062] 精密称取DY-1对照品6.43mg，体积百分浓度为50％的乙醇溶解，定容至10ml，得到浓度为643μg/ml的DY-1对照品溶液；

[0063] 精密称取芦丁对照品1.69mg，体积百分浓度为50％的乙醇溶解，定容至10ml，得到浓度为169μg/ml的芦丁对照品溶液；

[0064] 精密称取异槲皮苷对照品3.15mg，体积百分浓度为50％的乙醇溶解，定容至10ml，得到浓度为315μg/ml的异槲皮苷对照品溶液；

[0065] 精密称取紫云英苷对照品1.23mg，体积百分浓度为50％的乙醇溶解，定容至10ml，得到浓度为123μg/ml的紫云英苷对照品溶液；

[0066] 分别精密吸取绿原酸对照品溶液4.5ml、DY-1对照品溶液1ml、芦丁对照品溶液1ml、异槲皮苷对照品溶液1ml、紫云英苷对照品溶液1.5ml、槲皮素对照品溶液0.3ml、山奈酚对照品溶液0.2ml至10ml容量瓶，用体积百分浓度为50％的乙醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。各对照品浓度分别为：绿原酸220.05μg/ml，DY-164.3μg/ml，芦丁16.9μg/ml，异槲皮苷31.5μg/ml，紫云英苷18.45μg/ml。

[0067] 1.2样品的配制

[0068] 精密称取实施例1IV制备的精制杜仲叶提取物20.1mg，用体积百分浓度为50％的乙醇溶解，定容至50ml，得到浓度为0.402mg/ml的精制杜仲叶提取物溶液。

[0069] 2.HPLC色谱条件

[0070] 色谱柱：Hedera C18，流动相：溶剂A(0.1％甲酸乙腈，v/v)和溶剂B(0.1％甲酸水，v/v)梯度洗脱，检测波长270nm，进样体积20μL，柱温为30℃，流速1.0ml/min。流动相洗脱梯度变化见下表1。

[0071] 表1流动相洗脱梯度

[0072]

[0073] 3.计算公式

[0074] 检测结果按照公式进行计算：

[0075] 精制杜仲叶提取物样品中成分的浓度＝混合对照品中对应成分浓度×样品成分峰面积/混合对照品中对应成分峰面积。

[0076] 精制杜仲叶提取物样品中各成分的重量＝精制杜仲叶提取物样品中成分的浓度×杜仲叶提取物样品的体积(50ml)。

[0077] 精制杜仲叶提取物含量％＝样品中各成分含量之和/精制杜仲叶提取物的质量(0.0201g)×100％。

[0078] 精制杜仲叶提取物成分含量检测结果见表2：

[0079] 表2精制杜仲叶提取物成分含量检测结果

[0080]

[0081]

[0082] 杜仲叶提取物中各成分含量之和＝55.48％。

[0083] 实施例3杜仲叶提取物促进MC3T3-E1成骨细胞增殖率的影响实验研究[0084] 1.阳性药浓度筛选

[0085] 1.1阳性对照药的选择

[0086] 阳性药选用治疗骨折的临床常用药物接骨七厘片(湖南金沙药业股份有限公司生产)。

[0087] 1.2阳性对照药样品溶液的制备

[0088] 取接骨七厘片，研碎，称取0.3g，20ml体积百分浓度为50％的乙醇超声10min，3000r·min-1离心10min，得到浓度为15mg/ml的提取液。精密吸取0.5ml上清液，加75μl体积百分浓度为95％的乙醇助溶，加675μl DMEM高糖培养基，混匀，得到浓度为10mg/ml的接骨七厘片的培养基溶液，经0.25μm微孔滤膜过滤，即得浓度为10mg/ml的阳性对照药溶液。吸取100μl浓度为10mg/ml的阳性对照药溶液，加900μl DMEM高糖培养基，即得到浓度为1mg/ml的阳性对照药溶液。吸取100μl浓度为1mg/ml的阳性对照药溶液，加
900μl DMEM高糖培养基，即得到浓度为0.1mg/ml的阳性对照药溶液。

[0089] 2.细胞种板

[0090] 取培养瓶中的成骨细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％FBS的DMEM培养液4
反复吹打，制成细胞悬液，血球计数板计数，加培养液稀释至1×10cell/ml的细胞浓度，
3
200μl/孔接种于96孔板，每孔接种2×10cell。置37℃，5％CO2培养箱培养24h。

[0091] 3.对细胞增殖率的影响

[0092] 公式一：最终体积＝加药体积+培养液体积＝22μl+200μl＝222μl[0093] 公式二：最终浓度＝药液浓度×加药体积/最终体积

[0094] 注：由于培养液在培养箱中的挥发，最终浓度可能会有所增加，通过平行操作消除浓度变化。

[0095] 3.不同方法制备的杜仲叶提取物对成骨细胞增殖率的影响

[0096] 3.1药液的制备

[0097] 实施例1 IV制备的精制杜仲叶提取物使用100μl 95％乙醇和DMEM高糖培养基-1900μl溶解。得到浓度为1×10 mg/ml的样品溶液。样品溶液经0.22μm过滤除菌。

[0098] 3.2细胞接板

[0099] 取培养瓶中的成骨细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，加一定体积的含10％FBS的4
DMEM培养液，制成细胞悬液，血球计数板计数，加培养液稀释至2×10cell/ml的细胞浓度，
3
200μl/孔接种于96孔板，每孔接种4×10cell。置37℃，5％CO2培养箱中，培养24h细胞贴壁后，开始加药。

[0100] 表3杜仲叶的各种提取液、不同纯度的杜仲叶提取物对成骨细胞增殖率的影响[0101]

[0102] 注：精制杜仲叶提取物(纯度55.48％)即杜仲叶提取物中5种成分的百分含量总和为55.48％。

[0103] 杜仲叶提取物(纯度25％)为用醇、水混合提取后，经过乙醇沉淀，再经聚酰胺纯化后制备得到的杜仲叶提取物。该杜仲叶提取物在制备过程中，除未经HPD100大孔树脂富集外其他方法与实施例1IV的方法相同。提取物中各成分的百分含量检测方法与实施例2相同，检测结果显示杜仲叶提取物中5种成分的百分含量总和为25％。

[0104] 结论：杜仲叶的各种提取液、不同纯度的杜仲叶提取物均具有促进成骨细胞增殖的显著性活性。但纯度为56％的杜仲叶提取物作用最为显著。

[0105] 实施例4杜仲叶提取物抗炎、消血肿作用实验

[0106] 1实验目的：

[0107] 考察杜仲叶提取物是否具有抗炎、消血肿作用。

[0108] 2实验材料

[0109] 2.1实验试药

[0110] 实施例1 IV制备的精制杜仲叶提取物，二甲苯(AR，南京化学试剂有限公司)；冰乙酸(AR，南京化学试剂一厂)；注射用青霉素钠(山东鲁抗医药股份有限公司，批号B110931)；无水氯化钙(AR，广东西陇化工股份有限公司)；阿司匹林肠溶片(南京白敬宇制药有限责任公司，批号110503)；羧甲基纤维素钠(AR，天津市科密欧化学试剂开发中心)[0111] 2.2实验动物

[0112] 昆明种小鼠，雄性80只，体重18-22g。

[0113] 2.3实验仪器与器材

[0114] 分析天平(BSA124S型，sartorius公司)，打孔器，50μl移液器，1ml注射器。

[0115] 3实验方法

[0116] 3.1分组与给药剂量

[0117] 3.1.1模型组

[0118] 0.4％CMC-Na溶液，20ml/kg。

[0119] 3.1.2阳性对照组

[0120] 阿司匹林，小鼠给药剂量为0.27g/kg，小鼠给药体积为20ml/kg，则该溶液浓度为13.5mg/ml的0.4％CMC-Na溶液。

[0121] 3.1.3杜仲叶提取物高剂量组

[0122] 实施例1 IV制备的精制杜仲叶提取物给药剂量为1g/kg，小鼠给药体积为20ml/kg，则该溶液浓度为0.05g/ml的0.4％CMC-Na溶液。

[0123] 3.1.4杜仲叶提取物低剂量组

[0124] 实施例1 IV制备的精制杜仲叶提取物给药剂量为0.25g/kg，小鼠给药体积为20ml/kg，则该溶液浓度为0.0125g/ml的0.4％CMC-Na溶液。

[0125] 3.2样品液的配制

[0126] 3.2.1阳性药溶液的配制

[0127] 阿司匹林肠溶片中阿司匹林的含量为25mg/片，取54片(含阿司匹林1350mg)，研为细粉，加0.4％CMC-Na溶液研磨，定容至100ml，摇匀，即得13.5mg/ml阿司匹林混悬液。

[0128] 3.2.2杜仲叶提取物各剂量溶液的配制

[0129] 分别称取实施例1IV制备的精制杜仲叶提取物1.25g、5g，加0.4％CMC-Na溶液研磨，定容至100ml，摇匀，即得杜仲叶提取物低、高剂量混悬液。

[0130] 3.3给药、造模方法及检测指标

[0131] 3.3.1小鼠耳廓肿胀模型的抗炎实验

[0132] 取体重18-22g，雄性小鼠40只。随机分为4组，分别为模型组、阳性对照组、杜仲叶提取物低剂量组、杜仲叶提取物高剂量组，共为4个组。连续灌胃给药4天后，在末次给药1h后在每只小鼠的右耳涂以20μl二甲苯，1h后处死。用直径为8mm的打孔器在小鼠左右耳的同一部位，打下圆形耳片，在电子天平上称重，记录实验结果，计算肿胀率。

[0133] 肿胀率(％)＝(右耳重-左耳重)/左耳重×100％。

[0134] 2.3.2小鼠消血肿实验

[0135] 取体重为18～22g小鼠40只，雄性，随机分成4组，分别为模型组、阳性对照组、杜仲叶提取物低剂量组、杜仲叶提取物高剂量组，共为4个组。实验前先造成自身血肿模型：即用毛细玻璃管于小鼠眼底静脉丛定量采血0.05ml，加入含青霉素10万单位的0.1mol/LCaCl2溶液0.1ml混匀，立即注入小鼠自身颈背部皮下，造成血肿模型。造成模型后连续给药4天，第5天将小鼠颈椎脱位处死，将小鼠颈背处皮下的残留血肿块分离出来，用电子天平称重，通过比较不同组别的残留血肿块重量来判断药效。

[0136] 4实验结果

[0137] 4.1小鼠耳廓肿胀实验

[0138] 小鼠耳廓肿胀度实验结果经组间t检验统计分析，表明杜仲叶提取物各剂量组与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，显示杜仲叶提取物各剂量组均有很好的抗炎作用。小鼠耳廓肿胀实验结果见表4。

[0139] 表4小鼠耳廓肿胀实验结果

[0140]

[0141] 注：与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001。

[0142] 4.2小鼠消血肿实验

[0143] 小鼠消血肿实验结果经组间t检验统计分析，杜仲叶提取物低剂量组、高剂量组与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，显示杜仲叶提取物有很好的消血肿作用。小鼠消血肿实验结果见表5。

[0144] 表5小鼠消血肿实验结果

[0145]

[0146]

[0147] 注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

[0148] 4.3结论：

[0149] 本实验结果显示，杜仲叶提取物各剂量组均具有明显的抗炎及消血肿作用。

[0150] 实施例5杜仲叶提取物对大鼠胫骨骨折的影响

[0151] 观察杜仲叶提取物对大鼠胫骨骨折的影响。取40只SD大鼠，雌雄各半，按文献方法，制备大鼠胫骨骨折模型。随机分为5组：杜仲叶提取物高剂量组(360mg/kg)、杜仲叶提取物低剂量组(90mg/kg)、骨折挫伤胶囊组(470mg/kg)、模型组和假手术组(0.5％CMC-Na)。每组8只，灌胃给药，给药体积1mL/100g体重，连续30天。通过血清碱性磷酸酶、血钙和血磷，胫骨X片，骨密度及骨骼的生物力学实验观察各药物的疗效。结果显示，各组与模型组比较，20天和30天时，杜仲叶提取物高剂量组、杜仲叶提取物低剂量组的血清碱性磷酸酶、血钙、血磷升高，骨密度较模型组显著上升，与正常组无显著性差异，X片显示与模型组有显著性差异。但是各组的生物力学分析显示，各组抗折力实验与模型组均有显著性差异。试验结果说明：在所用剂量范围内，杜仲叶提取物有促进骨折愈合的显著性作用。

[0152] 1.药物试剂配制方法

[0153] 杜仲叶提取物高剂量配制：取3.6g实施例1IV制备的精制杜仲叶提取物溶解于100mL0.5％CMC-Na溶液中，即杜仲叶提取物高剂量浓度为36mg/mL。

[0154] 杜仲叶提取物低剂量配制：取20mL实施例1IV制备的精制杜仲叶提取物高剂量溶液用0.5％CMCNa溶液定容到80mL，即浓度为9mg/mL。

[0155] 2.实验方法

[0156] 2.1骨折模型的建立

[0157] 取SD大鼠，雌雄各半，共80只，体重180-220g。适应性喂养一周，标准鼠粮，饮水饲养。分为5组，分别为假手术组、模型组、阳性对照组、杜仲叶提取物高剂量组和低剂量组。假手术组动物的处理：用3％水合氯醛，腹腔注射麻醉，麻醉剂量为：10ml/kg。仰卧位固定，伤口周围消毒，用消过毒的手术器械切开皮肤，然后逐层缝合。缝合后，不做固定，肌注1mL
4万单位的庆大霉素，并在伤口处撒上左氧氟沙星防感染。隔日手术组每只肌注庆大霉素
1mL，连续两天。模型组、阳性对照组、杜仲叶提取物高剂量组和低剂量组的动物均需造模，胫骨标准骨折模型的制备方法：用3％水合氯醛，腹腔注射麻醉，麻醉剂量为：10ml/kg。仰卧位固定，伤口周围消毒，用消过毒的手术器械切开皮肤，找到胫骨，在下1/3处，用钢锯锯开3mm长，相当于胫骨直径的2/3被锯开，留下侧骨皮质和腓骨起固定支撑作用，用3％的双氧水冲洗伤口，逐层缝合。缝合后，不做固定，肌注1mL 4万单位的庆大霉素，并在伤口处撒上左氧氟沙星防感染。隔日手术组每只肌注庆大霉素1mL，连续两天。

[0158] 2.2给药剂量和方法

[0159] 各组实验动物于手术后第三天开始灌胃给药。给药体积1mL/100g体重。每天一次，连续30天。每周称一次体重，根据体重调整给药剂量。给药剂量为：阳性对照组给予骨折挫伤胶囊470mg/kg，杜仲叶提取物高剂量组给予360mg/kg、杜仲叶提取物低剂量组给予90mg/kg、模型组和假手术组给予等体积的0.5％CMC-Na水溶液。在给药后的第20天和第
30天，分别从实验动物眼眶取血，测定血清碱性磷酸酶、血钙和血磷。并于30天处死动物后，取下大鼠胫骨，测定胫骨的抗折力，骨密度，X片检测骨的愈合程度，通过与模型组比较得出各组药物对大鼠骨折愈合的影响。

[0160] 3.实验方法和结果

[0161] 3.1血清碱性磷酸酶的测定结果

[0162] 在20天和30天的时候分别眼眶取血约600uL左右，置于干净的1mL离心管中，3500rpm冷冻离心10min，吸取上层血清，-20℃存储，留待血清碱性磷酸酶，血钙、血磷的检测。检测结果见表6。

[0163] 结果显示：与模型组比较，20天及30天时，杜仲叶提取物低剂量(90mg/kg)组和高剂量(360mg/kg)组有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)，可以明显增加血清碱性磷酸酶。

[0164] 表620天及30天各组血清碱性磷酸酶(ALP)的比较( 单位：IU/L)

[0165]

[0166] 注：*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

[0167] 3.2血清血钙的测定结果

[0168] 与模型组比较，20天及30天时，杜仲叶提取物低剂量(90mg/kg)组和高剂量(360mg/kg)组有显著性差异(p＜0.05)，可以显著降低血钙。检测结果见表7。

[0169] 表720天及30天各组血钙的比较( 单位：mmol/L)

[0170]

[0171] 注：*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

[0172] 3.3血清血磷的测定结果

[0173] 与模型组比较，20天时，杜仲叶提取物低剂量(90mg/kg)组和高剂量(360mg/kg)组有显著性差异(p＜0.05)，可以显著增加血磷；30天时，杜仲叶提取物低剂量(90mg/kg)组和高剂量(360mg/kg)组有显著性差异(p＜0.05)，可以显著增加血磷。检测结果见表8。

[0174] 表820天及30天各组血磷的比较( 单位：mmol/L)

[0175]

[0176] 注：*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

[0177] 3.4胫骨X片检测

[0178] 于给药第30天，取血后处死动物，取下大鼠胫骨，在50KV，50mA，0.125S条件下拍摄X线片，通过X线片的变化，按下述标准评分：①错位：已缺损胫骨无错位(包括错位＜0.1cm)1分；有错位(包括骨折断端错位未超过其断端的1/2或骨折端轻度成角)0分。②骨折缝：已缺损胫骨骨折缝部分模糊或消失1分；有骨折缝0分。③连接：已缺损胫骨骨折断端连接为一整体1分；未连接0分。④腓骨：腓骨未断裂或断裂后连接1分；腓骨断裂
0分。⑤愈合：已缺损胫骨未愈合(无内外骨痂或骨折缝依旧)0分；骨折愈合(有内外轻度骨痂改变，同时骨折缝变浅或模糊)1分。检测结果见表9。

[0179] 结果显示，阳性组骨折线基本消失，骨折端有大量连接性骨痂阴影，有些可见髓腔再通，模型组骨折端边缘模糊，少量骨痂生长。与模型组比较，杜仲叶提取物低剂量(90mg/kg)组有显著性差异(p＜0.05)，高剂量(360mg/kg)有极显著性差异(p＜0.01)，骨折线趋于消失，骨痂生成增多。

[0180] 表9骨折30天各组中药对X片分值的影响

[0181]

[0182] 注：*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

[0183] 3.5骨密度检测

[0184] 取拍完X片后的大鼠胫骨，剔除表面软组织，检测愈合骨生物力学后，分别测定各组愈合骨的骨密度。与模型组比较，杜仲叶提取物低剂量(90mg/kg)组和高剂量(360mg/kg)组有显著性差异(p＜0.05)，可以显著增加骨密度。

[0185] 表10骨折30天后各组骨密度的比较(n＝4， )