一种海洋源复合胶原敷料的制备方法

摘要

本发明公开了一种海洋源复合胶原敷料的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：利用酶法从海洋鱼类表皮中提取胶原蛋白；从海洋鱼类鱼骨中提取硫酸软骨素；将提取的胶原蛋白及硫酸软骨素与絮凝剂、生长因子、抗炎消毒剂、交联剂同时溶于醋酸溶液中混合均匀；将所得混合液注入模具中交联后迅速转至冷冻干燥机中真空冷冻干燥便得到复合胶原敷料粗品；将得到的复合胶原敷料粗品包装后，用60Co辐照灭菌后得到复合胶原敷料成品。本发明提供了一种从海洋鱼类中提取的胶原蛋白与硫酸软骨素来制备复合胶原敷料的方法，可以提高海洋鱼类的综合利用率，通过本发明制备的复合胶原敷料成本低，安全性好，韧性高，黏附性强，能促进伤口的愈合。

权利要求

1.一种海洋源复合胶原敷料的制备方法，其特征是，所述的制备方法包括以下步骤：一、利用酶法从海洋鱼类表皮中提取胶原蛋白

（1）将海洋鱼类表皮洗净后捣碎待用；

（2）在步骤（1）得到的海洋鱼类表皮中加入NaOH溶液浸泡24-30h，每隔5～6 h更换NaOH溶液1次，最后用蒸馏水洗至pH为中性；

（3）加入正丁醇溶液搅拌16-24h后用蒸馏水洗至pH为中性；

（4）按每克海洋鱼类表皮以10～15ml的加入量加入蒸馏水，再调节pH至6.5～7.5后按每克海洋鱼类表皮以0.01～0.02g的加入量加入木瓜蛋白酶，在45～60℃下保温并搅拌3～5h，再调节酶解溶液pH至7.5～9.0后按每克海洋鱼类表皮以0.01～0.02g的加入量加入胰蛋白酶，在45～60℃下保温并搅拌3～5h，最后加热至90～100℃灭酶5～

10min；

（5）将得到的酶解液在0～4℃离心，收取上层清夜进行盐析沉淀；

（6）将沉淀物以0.5～0.7mol/L醋酸溶液复溶后装入透析袋，用0.1～0.2 mol/L 醋酸溶液作为透析外液透析24～36 h，每4～5h更换透析外液，再用蒸馏水作为透析外液透析24～36 h，每4～5h更换透析外液，最后将透析液冷冻干燥后即得胶原蛋白；

二、 从海洋鱼类鱼骨中提取硫酸软骨素

a、将海洋鱼类鱼骨上的残肉剔净后在40～50℃热水中清洗干净；

b、处理后的海洋鱼类鱼骨中加入NaOH溶液与NaCl溶液，再将海洋鱼类鱼骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50～60℃下搅拌浸提6～8h后用150～200目滤布过滤；

c、将步骤b得到的滤渣按照步骤b再提取一次，合并步骤b与步骤c所得的两次滤液；

d、将步骤c所得滤液pH调至6.5～7.5，按每克海洋鱼类鱼骨以0.005～0.01g的加入量加入木瓜蛋白酶，在45～55℃下保温搅拌2～3 h后加热至90～100℃灭酶5～

10min；

e、在步骤d的酶解液中不断加水搅拌加无水乙醇直至溶液中乙醇的体积百分数为

60～65%，在0～4℃静置18～24 h后离心分离，沉淀物用无水乙醇洗涤两次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素；

三、 海洋源复合胶原敷料制备

将步骤一提取的胶原蛋白、步骤二提取的硫酸软骨素与絮凝剂、生长因子、抗炎消毒剂、交联剂同时溶于浓度为0.05-0.2 mol/L的醋酸溶液中混合均匀，混合液中，各组分的质量百分含量为：胶原蛋白为2.0～3.0%，硫酸软骨素为1.0～1.5%，絮凝剂为0.03～

0.05%，生长因子为0.001～0.005%，抗炎消毒剂为0.1～0.4%，交联剂为0.3～0.8%；将所得混合液注入模具中，在0～4℃下静置12～18 h后预冷5～8h，预冷温度为-30～-50℃，最后迅速转至冷冻干燥机中真空冷冻干燥24～36h后便得到复合胶原敷料粗品，冷冻干燥的降温范围为-25℃～-60℃，降温速度为3～4℃/min；将得到的复合胶原敷料粗品包装后，用60Co辐照灭菌30～60 min后得到复合胶原敷料成品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤三中所述的絮凝剂为硫酸肝素，所述的生长因子为成纤维生长因子、人表皮生长因子、血小板生成素或血管生成素中的一种或几种，所述的抗炎消毒剂为苯扎溴铵或苯扎氯铵，所述的交联剂为戊二醛。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤（2）中所述的NaOH溶液浓度为

0.1～0.5mol/L，并按每克海洋鱼类表皮以10～15ml的加入量加入。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤（3）中所述的正丁醇溶液中正丁醇的体积百分数为10～15%，并按每克海洋鱼类表皮以15～20ml的加入量加入。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤b中所述的NaOH溶液浓度为0.5～

1.0 mol/L，并按每克海洋鱼类鱼骨以10～20ml的加入量加入，所述的NaCl溶液中NaCl的质量百分数为10～15%，并按每克海洋鱼类鱼骨以200～300ml的加入量加入。

说明书

一种海洋源复合胶原敷料的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医用材料领域，尤其是涉及一种海洋源复合胶原敷料的制备方法。

背景技术

[0002] 皮肤是抵御外界细菌入侵、维护机体内环境稳定、防止水分蒸发的天然屏障，但在日常生活和工作中，意外皮肤创伤时有发生，而传统的敷料如纱布、药棉等植物纤维布止血速度慢，而且仅仅是起到隔绝的作用，其本身并没有抗菌、抑菌性，必须配合药物来进行止血或者消毒，而且这些敷料不能防水，天气或者环境因素会使伤口续发感染。

[0003] 胶原蛋白是一种天然的止血剂，具有良好的生物学特性和功能，能促进新细胞形成和促进上皮细胞、成纤维细胞生长，同时能诱导血小板附着，促进血小板聚焦，激活凝血因子的活动，且与人体组织与细胞具有良好的生物相容性，胶原敷料则能使伤口清洁，减缓细菌感染现象，减少伤口流脓，增加肉芽组织的形成，使得愈合的伤口不会产生收缩，而且胶原敷料降解后可形成细胞生长所需要的氨基酸，为创面修复提供营养物质，加速伤口愈合，另外，海绵型的胶原敷料的多孔结构可诱导修复细胞在敷料中浸润和繁殖，并长时间用于创面覆盖。

[0004] 中国专利公开号：CN1569244A，公开日2005年1月26日，公开了一种以生物胶原为原料生产的生物胶原止血绵及其生产工艺，其生产步骤如下：1）将生物胶原磨成200～800目的生物胶原干粉待用；2）将生物胶原干粉与生物吸收性止血绵以0.5～1.5∶9的重量比搅拌混合,然后灌装入模具中冲压；3）将冲压成型后的生物胶原止血绵置于120～
170摄氏度下烘干，得成品。

[0005] 但是，单纯用胶原蛋白制成的敷料机械性能较差，止血效果不理想，且黏附性较差，易脱落。

[0006] 硫酸软骨素是一种酸性粘多糖，由于分子中带有大量的负电荷，因此具有调脂、抗炎、加速伤口愈合等作用，还能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除，与胶原蛋白结合，可形成交联作用和静电作用，在羟基、胺基之间相互交联，提高胶原海绵敷料的韧性。

[0007] 但是，胶原蛋白和硫酸软骨素主要来源于陆生屠宰动物中的结缔组织与软骨，但是由于近年来疯牛病、口蹄疫等疾病的出现与蔓延，使得陆生动物来源的胶原蛋白和硫酸软骨素在应用方面受到了极大限制，中国是个海洋渔业大国，鱼类资源丰富，海洋鱼类的表皮及软骨中含有丰富的胶原蛋白与硫酸软骨素，具有很大的开发潜力和利用价值。

发明内容

[0008] 本发明的目的是为了杜绝在陆生动物中提取胶原蛋白与硫酸软骨素所不可避免的病毒隐患，以及克服单纯用胶原蛋白制成的敷料机械性能较差，止血效果不理想，且黏附性较差，易脱落的不足，提供了一种从海洋鱼类中提取的胶原蛋白与硫酸软骨素来制备复合胶原敷料的方法，本发明不仅可以提高海洋鱼类的综合利用率，而且通过本发明制备的复合胶原敷料成本较低，安全性好，韧性高，黏附性强，能促进伤口的愈合，可广泛用于皮肤创伤面的治疗。

[0009] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0010] 本发明的一种海洋源复合胶原敷料的制备方法，包括以下步骤：

[0011] 一.利用酶法从海洋鱼类表皮中提取胶原蛋白。由于胶原蛋白主要来源于陆生屠宰动物中的结缔组织，陆生动物来源的胶原蛋白存在一定的生物安全隐患，而从海洋鱼类中提取的胶原蛋白可避免这个安全隐患，同时，我国是个渔业大国，海洋鱼类加工中产生的废弃鱼皮用来提取胶原蛋白，减少对环境的污染的同时又提高了海洋鱼类的利用率。化学法水解以酸或碱断开蛋白质肽键，由于反应环境较极端，不利于活性的保持，而酶法相对于化学法水解，安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制。所述的海洋鱼类表皮包括鱿鱼皮、鳕鱼皮等各种海洋鱼类的表皮。

[0012] 二.从海洋鱼类鱼骨中提取硫酸软骨素。硫酸软骨素主要来源于陆生屠宰动物中的软骨，同样存在生物安全隐患，而从海洋鱼类鱼骨中提取的硫酸软骨素可避免这个安全隐患，从海洋鱼类鱼骨中提取硫酸软骨素，减少对环境的污染的同时也能提高海洋鱼类的利用率。所述的海洋鱼类鱼骨可为安康鱼、鳗鱼、鲨鱼等各种海洋鱼类的鱼骨。

[0013] 三.将步骤一提取的胶原蛋白、步骤二提取的硫酸软骨素与絮凝剂、生长因子、抗炎消毒剂、交联剂同时溶于浓度为0.05-0.2 mol/L的醋酸溶液中混合均匀，混合液中，各组分的质量百分含量为：胶原蛋白为2.0～3.0%，硫酸软骨素为1.0～1.5%，絮凝剂为0.03～0.05%，生长因子为0.001～0.005%，抗炎消毒剂为0.1～0.4%，交联剂为0.3～0.8%；将所得混合液注入模具中，在0～4℃下静置12～18 h后预冷5～8h，最后迅速转至冷冻干燥机中真空冷冻干燥24～36h后便得到复合胶原敷料粗品；将得到的复合胶原敷料粗品包装后，用60Co辐照灭菌30～60 min后得到复合胶原敷料成品。胶原蛋白是一种天然的止血剂，具有良好的生物学特性和功能，能促进新细胞形成和促进上皮细胞、成纤维细胞生长，同时能诱导血小板附着，促进血小板聚焦，激活凝血因子的活动，且与人体组织与细胞具有良好的生物相容性，胶原敷料则能使伤口清洁，减缓细菌感染现象，减少伤口流脓，增加肉芽组织的形成，使得愈合的伤口不会产生收缩，而且胶原敷料降解后可形成细胞生长所需要的氨基酸，为创面修复提供营养物质，以促进伤口的愈合。硫酸软骨素是一种酸性粘多糖，由于分子中带有大量的负电荷，因此具有调脂、抗炎、加速伤口愈合等作用，还能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除。絮凝剂可以使溶液中的胶原蛋白更容易形成絮体，使制备后的复合胶原敷料呈多孔结构的海绵状，海绵状的复合胶原敷料的多孔结构提高复合胶原敷料的机械强度的同时还提高了与皮肤黏附性，使其可以长时间覆盖在创面上，还可以诱导修复细胞在敷料中浸润和繁殖，生长因子为具有刺激细胞生长活性的细胞因子，可以促进创伤面皮肤组织的再生修复，从而增强伤口的愈合能力，而抗炎消毒剂可以在胶原复合敷料黏附在创伤面上时，可以缓慢释放，增强局部的抗菌能力，避免创伤面的感染，交联剂可以使溶液中的其他成分与胶原蛋白交联在一起形成网状结构，以此提高复合胶原敷料的力学强度。所述的模具可以根据临床使用的需要制成不同的形状，冷冻干燥是利用升华原理，将待干燥物料快速冻结后，再在高真空条件下将其中的冰升华为水蒸气而去除的干燥方法。在真空冷冻干燥过程中，由于冰的升华带走热量使冻干整个过程始终保持低温冻结状态，组织结构和外观形态被较好地保存，干燥后的胶原蛋白能保持原来的物理与化学性质，物理结构变化极小，因而可以最大限度地保持胶原蛋白的活性，而且物料不存在表面硬化问题，干燥的胶原蛋白呈多孔状，能长时间稳定贮存，并易重新复水而恢复活性。放射性同位素60Co衰变时可放射出γ射线，γ射线的穿透力很强，操作简便，速度快，经60Co辐射灭菌的物品温度升高很少，一般仅约5℃，辐射剂量适当，不会破坏生长因子及抗炎消毒剂的有效成分，亦不会对人产生伤害，且有灭菌后较长时间控制细菌的再增殖等优点。

[0014] 作为优选，步骤三中所述的絮凝剂为硫酸肝素，所述的生长因子为成纤维生长因子、人表皮生长因子、血小板生成素或血管生成素中的一种或几种，所述的抗炎消毒剂为苯扎溴铵或苯扎氯铵，所述的交联剂为戊二醛。硫酸肝素可以与胶原蛋白交联，改变支架材料空间结构，使其成交联成多孔结构的海绵状，海绵状的胶原敷料的多孔结构提高复合胶原敷料的机械强度的同时还提高了与皮肤黏附性，使其可以长时间覆盖在创面上，海绵状的胶原敷料的多孔结构还可诱导修复细胞在敷料中浸润和繁殖，更有利于组织修复和伤口愈合。生长因子为成纤维生长因子、人表皮生长因子、血小板生成素或血管生成素中一种或几种，均可以促进皮肤组织再生，从而加快创伤面的愈合速度，所述的抗炎消毒剂为苯扎溴铵或苯扎氯铵，苯扎溴铵或苯扎氯铵具有毒性小，无积累性毒性，无刺激性，不损坏物品，且性质稳定，耐光，耐热，无挥发性，可长期存放，使用方便、成本低等优点，并易溶于水，能与蛋白质迅速结合，能改变细菌胞浆膜通透性，使菌体物质外渗，阻碍其代谢而起杀菌作用。所述的交联剂为戊二醛，戊二醛渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好。

[0015] 作为优选，步骤三中所述的预冷温度为-30～-50℃。在预冷阶段，需要严格控制预冷温度，如果预冷温度不够低，则药品可能没有完全冻结，在抽真空升华时会膨胀起泡，引起物理结构的变化；若预冷温度太低，又会增加不必要的能量消耗。-30～-50℃为一个优选的预冷温度范围。

[0016] 作为优选，步骤三中所述的冷冻干燥的降温范围为-25℃～-60℃，降温速度为3～4℃/min。冷冻干燥的降温速率可影响复合胶原敷料内部孔径的大小，降温速度过快，会使孔径过小，不仅会使下层胶原蛋白的干燥程度，还会导致胶原复合敷料的通透性较差，而降温速率过大，又会使孔径过大，导致胶原复合敷料的力学性能较差，合适的降温速率，能使形成的胶原复合敷料中的内部孔径结构均匀，比表面积大。

[0017] 作为优选，步骤一中所述的利用酶法从海洋鱼类表皮中提取胶原蛋白包括以下步骤：

[0018] （1）将海洋鱼类表皮洗净后捣碎待用。捣碎能使海洋鱼类表皮在溶液中能够能均匀分散。

[0019] （2）在步骤（1）得到的海洋鱼类表皮中加入NaOH溶液浸泡24-30h，每隔5～6 h更换NaOH溶液1次，最后用蒸馏水洗至pH为中性。加入NaOH溶液用以去除杂蛋白。

[0020] （3）加入正丁醇溶液搅拌16-24h后用蒸馏水洗至pH为中性。丁醇溶液用于脱脂，正丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强，正丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活，另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广。

[0021] （4）按每克海洋鱼类表皮以10～15ml的加入量加入蒸馏水，再调节pH至6.5～7.5后按每克海洋鱼类表皮以0.01～0.02g的加入量加入木瓜蛋白酶，在45～60℃下保温并搅拌3～5h，再调节酶解溶液pH至7.5～9.0后按每克海洋鱼类表皮以0.01～0.02g的加入量加入胰蛋白酶，在45～60℃下保温并搅拌3～5h，最后加热至90～100℃灭酶5～
10min。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果相对较好，胶原蛋白提取率较高，用木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶先后酶解海洋鱼类表皮，可使海洋鱼类表皮充分水解，以提高胶原蛋白的提取率。pH为6.5～7.5，温度为45～60℃是木瓜蛋白酶进行酶解的优选条件范围，pH为
7.5～9.0，温度为45～60℃是胰蛋白酶进行酶解的优选条件范围，胶原蛋白的提取率在一定范围内会随着酶与海洋鱼类表皮的重量比的增加而提高，但到一定程度后，鱼皮中胶原蛋白得率降低，因此需要一个酶的最佳加入量范围，每克海洋鱼类表皮加0.01～0.02g木瓜蛋白酶与0.01～0.02g胰蛋白酶为本发明的一个优选范围，可以得到较高的提取率。

[0022] （5）将得到的酶解液在0～4℃离心，收取上层清夜进行盐析沉淀。0～4℃时，胶原蛋白的性质最为稳定。盐析沉淀即为普通的蛋白分离方法，加入固体氯化钠、氯化钾等中性盐使胶原蛋白完全沉淀下来即可，盐析沉淀可使各种胶原蛋白分段沉淀，不仅操作简单，且成本也较低。

[0023] （6）将沉淀物以0.5～0.7mol/L醋酸溶液复溶后装入透析袋，用0.1～0.2 mol/L 醋酸溶液作为透析外液透析24～36 h，每4～5h更换透析外液，再用蒸馏水作为透析外液透析24～36 h，每4～5h更换透析外液，最后将透析液冷冻干燥后即得胶原蛋白。透析以去除胶原蛋白中的杂离子，提高胶原蛋白的纯度，冷冻干燥既能防止胶原蛋白变质，又能保持胶原蛋白的天然结构和特性。

[0024] 作为优选，步骤（2）中所述的NaOH溶液浓度为0.1～0.5mol/L，并按每克海洋鱼类表皮以10～15ml的加入量加入。NaOH溶液的浓度过高会使蛋白发生变性，因此需要控制NaOH溶液的加入量及浓度。NaOH溶液浓度为0.1～0.5mol/L，每克海洋鱼类表皮加入10～15ml所述的NaOH溶液为本发明的一个优选范围。

[0025] 作为优选，步骤（3）中所述的正丁醇溶液中正丁醇的体积百分数为10～15%，并按每克海洋鱼类表皮以15～20ml的加入量加入。正丁醇溶液浓度过高也会使蛋白质发生变性。正丁醇溶液中正丁醇的体积百分数为10～15%，每克海洋鱼类表皮加15～20ml所述的正丁醇溶液体为本发明的一个优选范围。

[0026] 作为优选，根据权利要求1所述的制备方法，步骤一中所述的从海洋鱼类鱼骨中提取硫酸软骨素包括以下步骤：

[0027] a.将海洋鱼类鱼骨上的残肉剔净后在40～50℃热水中清洗干净。热水冲洗使残肉与软骨完全分离。

[0028] b.处理后的海洋鱼类鱼骨中加入NaOH溶液与NaCl溶液，再将海洋鱼类鱼骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50～60℃下搅拌浸提6～8h后用150～200目滤布过滤。先用碱液对软骨进行碱提，使硫酸软骨素初步溶于碱液中，加入NaCl以增加硫酸软骨素的溶解度，同时稳定硫酸软骨素的活性，再通过滤布过滤对硫酸软骨素进行粗分离。

[0029] c.将步骤b得到的滤渣按照步骤b再提取一次，合并步骤b与步骤c所得的两次滤液。再提取一次以充分提取硫酸软骨素。

[0030] d.将步骤c所得酶解液pH调至6.5～7.5，按每克海洋鱼类鱼骨以0.005～0.01g的加入量加入木瓜蛋白酶，在45～55℃下保温搅拌2～3 h后加热至90～100℃灭酶5～10min。加入木瓜蛋白酶进行酶解在除去溶液中蛋白质。

[0031] e.在步骤d的酶解液中不断加水搅拌加无水乙醇直至溶液中乙醇的体积百分数为60～65%，在0～4℃静置18～24 h后离心分离，沉淀物用无水乙醇洗涤两次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素。先用乙醇进行醇沉，使硫酸软骨素沉淀，再用乙醇对沉淀下来的硫酸软骨素进行脱水，脱水后进行冷冻干燥便得到硫酸软骨素。

[0032] 作为优选，步骤a中所述的NaOH溶液浓度为0.5～1.0 mol/L，并按每克海洋鱼类鱼骨以10～20ml的加入量加入，所述的NaCl溶液中NaCl的质量百分数为10～15%，并按每克海洋鱼类鱼骨以200～300ml的加入量加入。

[0033] 本发明先通过从海洋鱼类的表皮与软骨中分别提取的胶原蛋白与硫酸软骨素，再用提取的胶原蛋白与硫酸软骨素来制备复合胶原敷料，不仅成本较低，还提高了海洋鱼类的综合利用率，最重要的一点制备所得的复合胶原敷料生物安全性好，可避免病毒隐患，而且通过本发明制备得到的复合胶原敷料的韧性高，黏附性强，能促进伤口的愈合，可广泛用于皮肤创伤面的治疗。

具体实施方式

[0034] 下面以具体实施方式对本发明做进一步的描述。

[0035] 实施例1

[0036] 一.取1.2kg鳕鱼皮洗净后捣碎待用；捣碎后的鳕鱼皮中按每克鳕鱼皮以10ml的加入量加入12L浓度为0.1mol/L 的NaOH溶液，浸泡30h，每隔6 h更换1次NaOH溶液，最后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克鳕鱼皮以20ml的加入量加入24L体积百分数为10%的正丁醇溶液，搅拌20h后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克鳕鱼皮以10ml的加入量加入12L蒸馏水，再用盐酸调节pH为6.5后按每克鳕鱼皮以0.01g的加入量加入12g木瓜蛋白酶，在60℃下保温并搅拌5h，再用氨水调节酶解溶液pH至8.5后按每克鳕鱼皮以0.01g的加入量加入12g胰蛋白酶，在60℃下保温并搅拌3h，最后加热至100℃灭酶10min；将得到的酶解液在0℃离心，收取上层清夜，加入氯化钠固体直至清液中无沉淀物析出；将沉淀物以0.5mol/L醋酸溶液复溶后装入透析袋，用0.1 mol/L 醋酸溶液作为透析外液透析24 h，每
5h更换透析外液，再用蒸馏水作为透析外液透析28 h，每4h更换透析外液，最后将透析液冷冻干燥后得到胶原蛋白。

[0037] 二.取1.2kg鳗鱼鱼骨，将鳗鱼鱼骨上的残肉剔净后在40℃热水中清洗干净；在处理后的鳗鱼鱼骨中按每克鳗鱼鱼骨以10ml的加入量及每克鳗鱼鱼骨以200ml的加入量分别加入12L浓度为0.6 mol/L的NaOH溶液与240L质量百分数为10%的NaCl溶液，再将鳗鱼鱼骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50℃下搅拌浸提8h后用200目滤布过滤；将滤布上的滤渣按照上步骤提取一次，合并所得的两次滤液；将滤液用醋酸将pH调至7.5，按每克鳗鱼鱼骨以0.005g的加入量加入6g木瓜蛋白酶，在45℃下保温搅拌2 h后加热至90℃灭酶10min；在酶解液中不断加水搅拌加无水乙醇直至溶液中乙醇的体积百分数为65%，在0℃静置24 h后离心分离，沉淀物用无水乙醇洗涤两次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素。

[0038] 三.用步骤一提取的胶原蛋白、步骤二提取的硫酸软骨素与硫酸肝素、成纤维生长因子、苯扎溴铵、戊二醛同时溶于浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中混合均匀，混合液中，各组分的质量百分含量为：胶原蛋白为2.5%，硫酸软骨素为1%，硫酸肝素为0.03%，成纤维生长因子为0.001%，苯扎溴铵为0.3%，戊二醛为0.3%；将所得混合液注入模具中，在0℃下静置18 h，在-30℃预冷5h，最后迅速转至冷冻干燥机中，冷冻干燥的在降温范围-25℃～-60℃，降温速度为3℃/min，真空冷冻干燥24h后便得到复合胶原敷料粗品；将得到的复合胶原敷料粗品包装后，用60Co辐照灭菌30 min后得到复合胶原敷料成品。

[0039] 实施例2

[0040] 一.取1kg安康鱼皮洗净后捣碎待用；捣碎后的安康鱼皮中按每克安康鱼皮以12ml的加入量加入12L浓度为0.5mol/L 的NaOH溶液，浸泡26h，每隔5.5h更换1次NaOH溶液，最后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克安康鱼皮以15ml的加入量加入 15L体积百分数为15%的正丁醇溶液，搅拌18h后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克安康鱼皮以12ml的加入量加入12L蒸馏水，再用盐酸调节pH为7.5后按每克安康鱼皮以0.015g的加入量加入
15g木瓜蛋白酶，在45℃下保温并搅拌4h，再用氨水调节酶解溶液pH至8后按每克安康鱼皮以0.012g克的加入量加入12g胰蛋白酶，在45℃下保温并搅拌5h，最后加热至100℃灭酶5min；将得到的酶解液在2℃离心，收取上层清夜，加入氯化钠固体直至清液中无沉淀物析出；将沉淀物以0.7mol/L醋酸溶液复溶后装入透析袋，用0.2 mol/L 醋酸溶液作为透析外液透析36 h，每4h更换透析外液，再用蒸馏水作为透析外液透析26 h，每4.5h更换透析外液，最后将透析液 冷冻干燥后得到胶原蛋白。

[0041] 二.取1kg安康鱼鱼骨，将安康鱼鱼骨上的残肉剔净后在50℃热水中清洗干净；在处理后的安康鱼鱼骨中按每克安康鱼鱼骨以20ml的加入量及每克安康鱼鱼骨以300ml的加入量分别加入20L浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液与300L质量百分数为15%的NaCl溶液，再将安康鱼鱼骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在60℃下搅拌浸提7h后用150目滤布过滤；将滤布上的滤渣按照上步骤提取一次，合并所得的两次滤液；将滤液用醋酸将pH调至6.5，按每克安康鱼鱼骨以0.01g的加入量加入10g木瓜蛋白酶，在50℃下保温搅拌2.5 h后加热至100℃灭酶5min；在酶解液中不断加水搅拌加无水乙醇直至溶液中乙醇的体积百分数为62%，在2℃静置22 h后离心分离，沉淀物用无水乙醇洗涤两次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素。

[0042] 三.用步骤一提取的胶原蛋白、步骤二提取的硫酸软骨素与硫酸肝素、成纤维生长因子、血管生成素、苯扎溴铵、戊二醛同时溶于浓度为0.1 mol/L的醋酸溶液中混合均匀，混合液中，各组分的质量百分含量为：胶原蛋白为3%，硫酸软骨素为1.2%，硫酸肝素为0.04%，成纤维生长因子与血小板生成素共为0.005%，苯扎溴铵为0.3%，戊二醛为0.4%；将所得混合液注入模具中，在2℃下静置13 h，在-40℃预冷6h，最后迅速转至冷冻干燥机中，冷冻干燥的降温范围为-25℃～-60℃，降温速度为4℃/min，真空冷冻干燥36小时后便得到复合胶原敷料粗品；将得到的复合胶原敷料粗品包装后，用60Co辐照灭菌40 min后得到复合胶原敷料成品。

[0043] 实施例3

[0044] 一.取1.5kg鳕鱼皮洗净后捣碎待用；捣碎后的鳕鱼皮中按每克鳕鱼皮以12ml的加入量加入18L浓度为0.2mol/L 的NaOH溶液，浸泡24h，每隔6 h更换1次NaOH溶液，最后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克鳕鱼皮以18ml的加入量加入27L体积百分数为13%的正丁醇溶液，搅拌16h后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克鳕鱼皮以115ml的加入量加入22.5L蒸馏水，再用盐酸调节pH为7后按每克鳕鱼皮以0.02g的加入量加入30g木瓜蛋白酶，在50℃下保温并搅拌3h，再用氨水调节酶解溶液pH至7.5后按每克鳕鱼皮以0.02g的加入量加入30g胰蛋白酶，在50℃下保温并搅拌4h，最后加热至95℃灭酶8min；将得到的酶解液在4℃离心，收取上层清夜，加入氯化钠固体直至清液中无沉淀物析出；将沉淀物以
0.6mol/L醋酸溶液复溶后装入透析袋，用0.15 mol/L 醋酸溶液作为透析外液透析26 h，每
4.5h更换透析外液，再用蒸馏水作为透析外液透析24h，每4h更换透析外液，最后将透析液冷冻干燥后得到胶原蛋白。

[0045] 二.取1kg鳕鱼鱼骨，将鳕鱼鱼骨上的残肉剔净后在45℃热水中清洗干净；在处理后的鳕鱼鱼骨中按每克鳕鱼鱼骨以15ml的加入量及每克鳕鱼鱼骨以300ml的加入量分别加入15L浓度为1.0 mol/L的NaOH溶液与300L质量百分数为12%的NaCl溶液，再将鳕鱼鱼骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在55℃下搅拌浸提6h后用180目滤布过滤；将滤布上的滤渣按照上步骤提取一次，合并所得的两次滤液；将滤液用醋酸将pH调至7，按每克鳕鱼鱼骨以0.006g的加入量加入6g木瓜蛋白酶，在55℃下保温搅拌3 h后加热至95℃灭酶8min；在酶解液中不断加水搅拌加无水乙醇直至溶液中乙醇的体积百分数为65%，在4℃静置24 h后离心分离，沉淀物用无水乙醇洗涤两次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素。

[0046] 三.用步骤一提取的胶原蛋白、步骤二提取的硫酸软骨素与硫酸肝素、成纤维生长因子、人表皮生长因子、血小板生成素、血管生成素、苯扎氯铵、戊二醛同时溶于浓度为0.15 mol/L的醋酸溶液中混合均匀，混合液中，各组分的质量百分含量为：胶原蛋白为2.0%，硫酸软骨素为1.5%，硫酸肝素为0.05%，成纤维生长因子、人表皮生长因子、血小板生成素、血管生成素共为0.003%，苯扎溴铵为0.4%，戊二醛为0.6%；将所得混合液注入模具中，在4℃下静置15h，在-50℃预冷7h，最后迅速转至冷冻干燥机中，冷冻干燥的降温范围为-25℃～-60℃，降温速度为3.5℃/min，真空冷冻干燥28小时后便得到复合胶原敷料粗品；将得到的复合胶原敷料粗品包装后，用60Co辐照灭菌50 min后得到复合胶原敷料成品。

[0047] 实施例4

[0048] 一.取1.5kg鳕鱼皮洗净后捣碎待用；捣碎后的鳕鱼皮中按每克鳕鱼皮以14ml的加入量加入21L浓度为0.1mol/L 的NaOH溶液，浸泡30h，每隔5 h更换1次NaOH溶液，最后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克鳕鱼皮以16ml的加入量加入24L体积百分数为15%的正丁醇溶液，搅拌24h后用蒸馏水洗至pH为中性；按每克鳕鱼皮以10ml的加入量加入15L蒸馏水，再用盐酸调节pH为6.5后按每克鳕鱼皮以0.01g的加入量加入15g木瓜蛋白酶，在60℃下保温并搅拌3h，再用氨水调节酶解溶液pH至9.0后按每克鳕鱼皮以0.01g的加入量加入15克g蛋白酶，在50℃下保温并搅拌5h，最后加热至100℃灭酶10min；将得到的酶解液在0℃离心，收取上层清夜，加入氯化钠固体直至清液中无沉淀物析出；将沉淀物以0.5mol/L醋酸溶液复溶后装入透析袋，用0.2 mol/L 醋酸溶液作为透析外液透析36 h，每
5h更换透析外液，再用蒸馏水作为透析外液透析36 h，每5h更换透析外液，最后将透析液冷冻干燥后得到胶原蛋白。

[0049] 二.取1kg安康鱼鱼骨，将安康鱼鱼骨上的残肉剔净后在40℃热水中清洗干净；在处理后的安康鱼鱼骨中按每克安康鱼鱼骨以10ml的加入量及每克安康鱼鱼骨以250ml的加入量分别加入10L浓度为0.7 mol/L的NaOH溶液与250L质量百分数为10%的NaCl溶液，再将安康鱼鱼骨粉碎形成粉碎液，所得粉碎液在50℃下搅拌浸提8h后用200目滤布过滤；将滤布上的滤渣按照上步骤提取一次，合并所得的两次滤液；将滤液用醋酸将pH调