一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽及其用途

摘要

一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽为十个氨基酸所组成的胜肽(decapeptide)，如序列辨识编号：2所示。该合成胜肽参照自一禽类所自然分泌的GnRH-II；一种促进鱼类卵黄生成的制剂，包含上述的合成胜肽；以及，一种促进鱼类卵黄生成的方法，是将如上所述的制剂埋植至一硬骨鱼类的体壁或体腔，以促进该硬骨鱼类卵细胞的成熟。

权利要求

1.一种如序列辨识编码:2所示的十个氨基酸所组成的合成胜肽于促进鱼类卵细胞的发育成熟且达卵黄发育第三期中的应用，其中该合成胜肽N端的谷氨酸（Glu）未经环化形成pyro-Glu，且该合成胜肽C端的甘氨酸（Gly）则未被酰胺化转成Gly-NH2。

说明书

一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽及其用途

技术领域

[0001] 本发明关于一种合成胜肽及其应用，特别是一种可以促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，及其在诱发和促进种鱼成熟的应用。

背景技术

[0002] 台湾的水产养殖产业发展历史悠久，近二十年来，由于养殖技术的科技化及养殖品种的多元化，带动养殖产业快速发展与成长。台湾早期的鱼类养殖大都以粗放混养的养殖形式，种苗来源多仰赖捕捞，故种苗数量、来源及品质多不稳定，无法符合产业发展的需求；近年来，因幼苗培育技术及人工饵料的建立，促使水产养殖的集约化、企业化，集约式养殖方式使养殖鱼类的放养密度大幅度增加，因而对于种苗数量、质量上的需求也相对提升；因此，种苗的来源无法完全依赖自然捕捞，必须以人工繁殖技术诱导养殖鱼类性腺发育、卵巢成熟(即卵黄发育达第三期)，再以环境因子或内分泌等刺激诱导排卵及产卵，培育稚鱼以满足现今养殖产业对种苗的需求；然而，目前多数养殖业者在种苗生产与开发上往往遭遇诸多问题，有必要针对养殖鱼类生殖调控机制加以研究并建立良好的育苗系统。

[0003] 鱼类的生殖调控机制较为复杂且相关生理研究至近十数年才渐有成果展现，主要是由外在环境的刺激(如光周期、温度等)以及内分泌系统而控制；一般而言，鱼类的生殖内分泌应与脊椎动物相同，是由荷尔蒙分泌调控信息传递，通过下视丘-脑垂体-生殖性腺(hypothalamus-pituitary-gonad)的传递路径，进而控制一连串的生殖反应，诱发生殖细胞的成长及成熟。下视丘是分泌促性腺激素释素(GonadotropinReleasing Hormone；GnRH)或促性腺激素抑制因子(Gonadotropin Inhibiting Factor；GnIF，如多巴胺Dopamine)分别刺激或抑制脑垂体促性腺激素(Gonadotropin；GtH)的合成、释放，该促性腺激素可通过血液输送至卵细胞或精细胞膜上的接受器，促使蛋白质激酶磷酸化，诱发类固醇合成(Steroidogenesis)；其中，雌二醇是主导卵细胞的成熟，即为卵黄生成作用(Vitellogenesis)，再由成熟促动因子(maturation factor)的作用使卵细胞进入最后成熟阶段，而成熟卵细胞(即卵黄第三期)则由水温、光照及其他环境因子的诱导以致排卵及产卵，为雌鱼性成熟的生理作用途径及调控机制；其中，由下视丘所分泌的GnRH由十个氨基酸所组成，为所有脊椎动物在繁殖调控上负责连接外在刺激及内在分泌的主要机制，因此，脊椎动物的GnRH普遍具有很高的物种相似度，约50～90%。在过去研究中，已有多种GnRH由脊椎动物各物种中分离出来，一般认为，同一物种中应具有一种以上的GnRH，在该物种内分泌系统的调控上代表不同意义；而在鱼类生殖细胞的发育成熟过程中，GnRH分别在调控卵黄生成以及最后的成熟步骤中扮演重要角色。

[0004] 由上所述，下视丘分泌的促性腺激素释素(GnRH)及脑垂体分泌的促性腺激素(GtH)皆为刺激鱼类生殖发育的主要因子，现有种鱼的人工繁殖操作多用脑垂体注入法(Hypophysation)，即以促性腺激素(GtH)处理以获得预期的产卵结果，然而，该GtH具有种间差异性且无法以合成方式取得，如以基因工程方式生产则成本偏高，故使用范围受限；而目前养殖产业最常使用的激素制剂除含GtH成分的脑垂体萃取或纯化制剂外，还有人类胎盘绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin；hCG)及商用激素混合制剂[由LHRHA与多巴胺拮抗剂(Domperidome)混合]，两者的使用皆为促进成熟种鱼卵细胞的最后成熟，即由第三卵黄期至排卵、产卵的过程，然而，上述各种激素制剂皆无法促进养殖鱼类卵细胞的早期发育，亦即无法诱发及促进养殖鱼类卵黄生成作用，因此，对于生殖季节短暂，在人为养殖条件下难以自然发育成熟，成熟状态不稳定，生殖季节不利于进行人工种苗培育或种苗来源稀少的养殖鱼类，不易建立一种有效控制产卵及种苗量产的技术，为现今养殖产业的发展瓶颈。

发明内容

[0005] 本发明的主要目的是针对上述问题加以改进，提供一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，可以促进硬骨鱼类卵细胞的早期发育、成熟。

[0006] 本发明的次一目的是提供一种促进鱼类卵黄生成的的制剂，可以调节重要养殖鱼类的产卵季节。

[0007] 本发明的又一目的是提供一种促进鱼类卵黄生成的方法，以提高种鱼性腺发育率，降低产业成本及提升经济效益。

[0008] 为达到前述发明目的，本发明所运用的技术手段包含有：

[0009] 一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽为十个氨基酸所组成的胜肽(decapeptide)，具有以下序列:Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly，该合成胜肽参照自一禽类所自然分泌的GnRH-II。

[0010] 一种促进鱼类卵黄生成的制剂，包含上述的合成胜肽。

[0011] 一种促进鱼类卵黄生成的方法，是将如上所述的制剂埋植至一硬骨鱼类的体壁或体腔，如体侧肌肉或腹腔，以促进该硬骨鱼类卵细胞的成熟。

附图说明

[0012] 图1：本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂的埋植示意图。

[0013] 图2a：本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂于点带石斑的施用效果示意图。

[0014] 图2b：本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂于点带石斑的施用效果又一示意图。

[0015] 图3：本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂于乌鱼的施用效果示意图。

[0016] 【主要元件符号说明】

[0017] 1 注射器 2 硬骨鱼类 21 背鳍。

具体实施方式

[0018] 为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下：

[0019] 本发明一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，为十个氨基酸所组成的胜肽(decapeptide)，该合成胜肽的序列参照自一禽类(如鸡、鸭或鹅等)所自然分泌的GnRH-II序列；该合成胜肽可以诱发及促进硬骨鱼类的卵黄生成作用。将该合成胜肽埋植至一硬骨鱼类的体壁或体腔，可以有效促进该硬骨鱼类的卵黄生成及堆积，促使雌性种鱼发育成熟，并且可调控该硬骨鱼类雌性种鱼的生殖季节。

[0020] 更详言之，本发明的合成胜肽，参考鸡所自然分泌的GnRH-II的氨基酸序列p-Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly-NH2(请参见序列表，序列识别编码:1)，由一氨基酸合成仪(即以solid-phase peptide synthesis方式合成)进行人工合成，该合成胜肽具有以下序列:Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly(请参见序列识别编码:2)，相较于该鸡所自然分泌的GnRH-II，该合成胜肽N端的谷氨酸Glu)未经环化而形成pyro-Glu，而该合成胜肽C端的甘胺酸(Gly)则未被酰胺化而转成Gly-NH2，因此，该合成胜肽的第一及第十个氨基酸皆未经修饰，亦即未被阻断，与鸡所自然分泌的GnRH Ⅱ在结构上略有不同，该合成胜肽可由Edman降解法(Edman degradation)进行氨基酸定序；一般而言，生物体所分泌的GnRH因具有很高的种间相似度，故由本发明的合成胜肽可以刺激多数硬骨鱼类的脑垂体，促使脑垂体合成及释放促性腺激素(GtH)，开启该硬骨鱼类的生殖内分泌系统，促使卵黄生成作用开始进行。

[0021] 本发明一种促进鱼类卵黄生成的方法，是将一制剂埋植于一硬骨鱼类的体壁或体腔，如体侧肌肉或腹腔，该制剂包含本发明的合成胜肽，使该合成胜肽可以在硬骨鱼类体内缓慢释放，刺激该硬骨鱼类的卵细胞发育、成熟，进而调控该硬骨鱼类的生殖季节。本实施例将该合成胜肽混合一基质，再填入一玻璃管进行压制，以便压缩、固化而制成本发明的制剂，该合成胜肽的剂量可以为10微克(μg)～5毫克(mg)/单位个体重量，较佳依照施用个体的种类及体重的不同稍作调整，如每单位鮨鱼体重(公斤)施用100～500微克(μg)的合成胜肽；该基质由一胆固醇(cholesterol)、一纤维素(cellulose)及少量油脂黏着剂所共同构成的混合物，其中，该胆固醇所占的质量比例约为50～95%，纤维素则为5～50%，该合成胜肽由胆固醇及纤维素包覆、压制而呈缓释锭剂形式，较佳于压制前混合少量油脂黏着剂(如植物油，椰子油)，以增加黏性加速制程；该合成胜肽具有与禽类GnRH-II的胜肽序列(p-Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly-NH2)相同的序列及近似的结构，可以刺激该硬骨鱼类的生殖内分泌系统；纤维素具有组织支撑的功能，可以维持该制剂的构形；该胆固醇可以包覆该合成胜肽，使该合成胜肽具有缓释效果，同时该胆固醇为生物体合成荷尔蒙的重要原料，可以辅助该硬骨鱼类的生殖内分泌系统合成生殖激素。

[0022] 请参照图1所示，为本发明制剂的埋植示意图，由一注射器1将该制剂直接植入一硬骨鱼类2背鳍21基部的肌肉中，使该制剂所含的合成胜肽可以缓慢释放于该硬骨鱼类中，以长时间刺激该硬骨鱼类的脑垂体释放促性腺激素，使卵黄生成、堆积。为证实本发明一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽可以有效促使硬骨鱼类的卵黄生成堆积，将该制剂埋植至一养殖硬骨鱼类，观察该养殖硬骨鱼类的卵黄生成及卵细胞成熟情形。

[0023] 请参照图2a及2b所示，本实施例是采用点带石斑(Epinephelus coioides)进行试验，该点带石斑为台湾地区主要养殖的石斑鱼种，市场价格高，于天然海域的分布范围极广，该点带石斑的生殖季节为春末(4～5月)至夏中(6～8月)，有时会延长至秋初，由4～5年的成熟雌鱼进行产卵；该点带石斑的养殖技术在台湾虽已渐成熟，然而在繁殖发展上，却无法改善；点带石斑为适高水温鱼种，虽然台湾位处亚热带，其生殖季节高峰仍偏处春、夏季，又种鱼在人工养殖状态下须待其自然成熟后方能以激素注射促使其产卵，因此种苗生产技术及流程尚有瓶颈亟待突破。

[0024] 请再参照图2a及2b所示，是将本发明的制剂及一商用激素制剂(如LHRHA)分别埋植至数组体重达2～3.5公斤的成熟点带石斑，逐月抽取并监测该点带石斑的卵细胞发育情况，判别卵巢成熟程度；其中，该商用激素制剂同样混合一纤维素、一胆固醇及一植物油，再注入该玻璃管进行压缩、固化，制成缓释锭剂形式，以避免实验差距；该点带石斑卵细胞的发育情况及成熟度由卵径大小变化及卵黄堆积状态判别，其卵细胞发育阶段依序约略可分为1.卵黄泡期:卵径大小为10～70微米(μm)；2.卵黄发育第一期:卵径大小为70～120微米；3.卵黄发育第二期：卵径大小为120～250微米；4.卵黄发育第三期:卵径大小>400微米，此时卵细胞已完成卵黄堆积达成熟阶段。数组点带石斑的分组状态如下表所示:

[0025] 第1表:点带石斑分组状态

[0026]组别 主要埋植物 埋植剂量(微克)a
a1(本发明) 合成胜肽 100
a2(本发明) 合成胜肽 200
a3(商用制剂) LHRHA 100
a4(对照组) 胆固醇 100

[0027] a埋植剂量依照鱼体的单位重量推算，本实施例是于每单位石斑鱼体重(公斤)施用100或200微克(μg)的合成胜肽或商用制剂等。

[0028] 由图2a及2b结果，埋植本发明的制剂的第a1及a2组，该两组点带石斑于埋植本发明的制剂四个月后(8月埋植，埋植四个月后约为十二月)分别有100%及80%个体其卵巢内卵细胞的卵径发育达250微米(μm)以上，并且该两组点带石斑各有83.3%及80%个体卵巢内卵细胞卵径发育达400微米(μm)以上，即达成熟阶段；而第a3组点带石斑的卵巢，则是于埋植该商用制剂4个月后仅有41.7%个体卵巢内卵细胞卵径发育达250微米(μm)，其中36.4%达400微米(μm)；而第a4组的点带石斑则是于埋植该胆固醇制剂约4个月后(8月初埋植，埋植后4个月为12月)仅有16.7%个体卵巢内卵细胞的卵径发育达400微米。此外，未作任何制剂处理的个体仅有7%个体卵巢内卵细胞卵径发育达400微米(μm)(未于图中呈现)。

[0029] 再由图2a及2b结果，上述各制剂皆于8月初埋植于数组点带石斑的体侧肌肉，其中，第a1、a2组点带石斑是于埋植本发明的制剂后约4～5个月(12月左右)，各有83.3%及80%点带石斑卵巢内卵细胞的卵径已成长至400微米以上，显示卵巢发育状态已达发育后期，此时，可以借助注射一商用GtH制剂(如hCG)或以其他环境刺激(如成熟雄性种鱼的追尾求偶等)促使该两组点带石斑产卵，使该点带石斑的自然生殖季节可由原本的春、夏季改变为秋末或冬季。

[0030] 由以上结果显示，本发明的制剂埋植于一硬骨鱼类后，可以于2～4个月内有效促使该硬骨鱼类卵巢卵细胞的发育成熟且达卵黄发育第三期(即卵径达400微米以上)；相较于埋植一般商用激素制剂或合成生殖荷尔蒙的原料(胆固醇)对于硬骨鱼类的卵巢生成作用具有较快且较佳的刺激效果；再者，借助埋植本发明的制剂，可以改变或延长一硬骨鱼类的生殖季节，使该硬骨鱼类可于非自然生殖季节获得良好的卵巢成熟结果；由此，本发明的合成胜肽确实有助于硬骨鱼类卵细胞的早期发育及后期成熟，并且可以调控该硬骨鱼类的生殖季节。

[0031] 请参照图3所示，为本发明的制剂与多种市售商用激素制剂(包含Ovaprin:内含sGnRHA及domperidone；雌二醇(estradiol)及MixT:内含多种雄性素(androgen))施用于乌鱼(Mugil cephalus)的结果，是将该制剂与上述其他商用激素制剂分别埋植至数组乌鱼进行试验，数组乌鱼的埋植情况如下表所示。乌鱼同样为台湾重要的养殖鱼类，是台湾特产乌鱼子的来源，早年乌鱼养殖种苗多由野生捕捉，但近年来由于养殖方式集约化且天然海域资源锐减，以致目前养殖鱼苗主要仰赖人工繁殖，以维持市场需求量；乌鱼的成长季为3～9月，9月以后卵巢开始发育进入生殖季节，11月至卵巢发育后期为乌鱼子的主要产季。

[0032] 第2表:乌鱼分组状态

[0033]

[0034] a合成胜肽的埋植剂量是依照鱼体的单位重量推算，本实施例是于每单位乌鱼体重(公斤)施用400微克(μg)的合成胜肽。

[0035] 请再参照图3所示，上述各制剂是于五月初即分别埋植至各组乌鱼的体侧肌肉，第b5组乌鱼则不作任何处理；逐月抽取并监测各组乌鱼的卵细胞发育情况，判别卵巢成熟程度；该乌鱼的卵细胞发育情形则同样由卵径大小变化及卵黄堆积状态判别。

[0036] 由图3结果，第b1组乌鱼于埋植本发明的制剂3个月后(约为7～8月时)卵细胞即开始发育，逐渐由100～120微米成长至>400微米(至10月时)；而第b2组乌鱼则是于埋植该Ovaprin制剂后5个月内(5～10月)皆未见卵巢发育迹象；第b3组乌鱼是于埋植该雌二醇制剂4个月后始发现卵细胞发育(此时约为卵细胞100～120微米)，成长至第5个月时卵径仍小于400微米；第b4组乌鱼则于埋植该MixT制剂后3～4个月时卵细胞开始发育，卵径由100～120微米渐成长至250微米左右(至10月时)；而第b5组乌鱼是于自然放养环境中，于自然生殖季节(9月以后)前其卵细胞卵径皆仅达170微米左右，至十月份则稍微成长至200微米，尚未发育成熟。

[0037] 由以上结果显示，本发明的制剂相较于其他市售商用激素制剂(如Ovaprin等)，对于刺激硬骨鱼类的卵巢早期发育进展较快且效果较佳；并且，本发明的制剂可有效诱使一硬骨鱼类于非自然生殖季节出现卵细胞发育的现象；由此可知，本发明的合成胜肽可以应用于新激素制剂的开发，建立促进养殖鱼类卵细胞早期发育(即卵黄生合成与卵黄于卵细胞内的堆积)及后期成熟以达产卵的技术，并且，该合成胜肽由人工方式合成(氨基酸合成仪)，生产成本低，具有量产价值，相较于其他商用激素则具有较高的经济效益与较高的应用价值，可用以开发新激素制剂应用于养殖鱼类的种苗生产，以促进养殖产业的收益。

[0038] 本发明一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，为十个氨基酸所组成的胜肽，具以下序列:Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly，该合成胜肽之序列是参照自一禽类所分泌的GnRH-II(序列为p-Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly-NH2)，具有刺激硬骨鱼类卵细胞的早期发育、成熟的功效。

[0039] 本发明一种促进鱼类卵黄生成的制剂，该制剂包含该合成胜肽，可以于一硬骨鱼类体内缓慢释放，诱使该硬骨鱼类于非自然生殖季节出现卵细胞发育的现象，为本发明的功效。

[0040] 本发明一种促进鱼类卵黄生成的方法，利用该制剂应用于水产养殖，提高种鱼性腺发育率，降低产业成本，具有增加养殖产业收益的功效。