一株链孢囊菌C-3560产生的抗肿瘤抗生素加迪霉素

摘要

本发明涉及一种由链孢囊菌C-3560产生的抗肿瘤活性物质，所述抗肿瘤活性蛋白分子量为10.8kDa，其N-末端序列如序列表SEQ？ID？No.1所示；该活性物质生物学实验研究结果证明，其对体外培养的多种肿瘤细胞有明显的抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞凋亡，并产生细胞周期阻滞；体内动物实验确证，其可明显抑制小鼠H22肝癌的肿瘤生长，有望进一步研发成为临床有效的抗肿瘤药物。

权利要求

1.一种抗肿瘤活性蛋白加迪霉素，其特征是：保藏编号为CGMCC No6059的链孢囊菌C‐3560菌株的发酵液，经5000rpm4℃低温离心20min，取上清液并经3kDa超滤膜组件浓缩，获得粗浓缩液；经体积180ml，柱径比9:48的DEAE‐cellulose阴离子交换柱层析，并以500ml0.05mol/l NaCl溶液洗脱，收集流穿液和0.05mol/l NaCl的洗脱液，合并；然后经体积80ml，柱径比3:25的Butyl Sepharose疏水柱层析，以250ml1.7mol/l(NH4)2SO4溶液洗脱，再分别以1.3mol/l、1.2mol/l和1.1mol/l(NH4)2SO4溶液洗脱各150ml，分部收集，合并经微生物检定法检测的活性组分，以超滤离心管3500rpm离心浓缩，获得浓缩液；再经柱体积800ml，柱径比7:200的Sephadex G50葡聚糖凝胶色谱柱层析，以去离子水洗脱并分部收集，合并经微生物检定法检测的活性洗脱峰组分，浓缩即为加迪霉素；化学结构特征为分子量10.8kDa，且N‐末端序列为：Ala Thr Pro Ser Phe Ser Val Thr Pro Ala Thr Gly Val Ser Asp

1 5 10 15

Gly Gly Thr Val Thr Ala Thr Ile Thr Gly Ala Ala Ala Gly Glu

16 20 25 30 。

2.制备权利要求1所述活性蛋白加迪霉素的方法，其特征是，保藏编号为CGMCC No6059的链孢囊菌C‐3560菌株在酵母提取物－葡萄糖－燕麦斜面培养基培养；经可溶性淀粉－饴糖－消化血清粉－酵母提取物种子培养基培养；转种糊精－饴糖－消化血清粉－酵母－黄豆粉发酵培养基28‐30℃培养96小时；发酵液经5000rpm4℃低温离心20min，取上清液，上清液经3kDa超滤膜组件浓缩，获得粗浓缩液；经体积180ml，柱径比9:48的DEAE‐cellulose阴离子交换柱层析，并以500ml0.05mol/l NaCl溶液洗脱，收集流穿液和0.05mol/l NaCl的洗脱液，合并；然后经体积80ml，柱径比3:25的Butyl Sepharose疏水柱层析，以250ml1.7mol/l(NH4)2SO4溶液洗脱，再分别以1.3mol/l、1.2mol/l和1.1mol/l(NH4)2SO4溶液洗脱各150ml，分部收集，合并经微生物检定法检测的活性组分，以超滤离心管3500rpm离心浓缩，获得浓缩液；再经柱体积800ml，柱径比7:200的Sephadex G50葡聚糖凝胶色谱柱层析，以去离子水洗脱并分部收集，合并经微生物检定法检测的活性洗脱峰组分，浓缩即为加迪霉素。

3.权利要求1所述活性蛋白加迪霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

一株链孢囊菌C-3560产生的抗肿瘤抗生素加迪霉素

技术领域：

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种由链孢囊菌产生的抗肿瘤活性物质，具体而言，涉及一种具有抗肿瘤活性的蛋白和N-端序列及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 背景技术：

[0002] 迄今，已有超过10余种微生物来源的抗肿瘤抗生素作为抗癌药物应用于临床中。它们均来源于微生物发酵的次级代谢产物或经微生物次级代谢产物进行的半合成。由于自然界微生物的来源多样性和次生代谢产物的多样性，已报道的由微生物产生的抗肿瘤活性物质为数众多。然而，临床上使用的许多已知抗肿瘤抗生素的药学特性（如毒性、药效、适应症和耐药肿瘤细胞株的产生等）还存在诸多不如人意之处。因此，人们不断筛选新的菌株和新的抗生素，以期获得更加高效、低毒、具有良好药学特性的抗肿瘤药物。随着新的抗肿瘤筛选模型和筛选方法的建立，更多的抗肿瘤活性化合物被发现，作为抗肿瘤药物研究的先导化合物，有望进一步研发成为临床有效的抗肿瘤药物。

[0003] 本研究所在筛选抗肿瘤抗生素的过程中，从我国湖北省武汉市珞珈山土壤样品中分离得到一株链孢囊菌属Streptosporangium C-3560，并于2012年5月3日送交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.6059。经多种抗肿瘤筛选模型检验，发现该菌株的发酵产物具抗菌及抗肿瘤活性。经分离、纯化、理化性质鉴定，该活性物质是一个分子量为10.8kDa的蛋白，N末端30个氨基酸序列，与NCBI数据库的比对结果显示，其与已知蛋白氨基酸序列最高同源性为59％；经CA《化学文摘》数据库检索结果，未发现相同序列；抗肿瘤活性研究表明，其具有良好的抗肿瘤活性，定名为加迪霉素(JDM)。本发明所提供链孢囊菌Streptosporangium C-3560产生的抗肿瘤抗生素加迪霉素及其应用，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。 发明内容：

[0004] 本发明提供了一种新的具有抗肿瘤活性的蛋白加迪霉素；

[0005] 本发明提供了加迪霉素的制备方法；

[0006] 本发明还提供了加迪霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0007] 所述抗肿瘤活性蛋白加迪霉素分子量为10.8kDa，其N末端序列如序列表SEQID No.1所示：

[0008] Ala Thr Pro Ser Phe Ser Val Thr Pro Ala Thr Gly Val Ser Asp [0009] 1 5 10 15 [0010] Gly Gly Thr Val Thr Ala Thr Ile Thr Gly Ala Ala Ala Gly Glu [0011] 16 20 25 30。 [0012] 所述加迪霉素的制备方法主要包括以下步骤：

[0013] 1）链孢囊菌C-3560发酵液多级培养制备（斜面菌株培养、种子液制备、发酵液制备与浓缩）；

[0014] 2）发酵浓缩液离心取上清液，经阴离子交换柱层析，收集流穿液； [0015] 3）流穿液经疏水层析，洗脱收集活性组分；

[0016] 4）活性组分经凝胶色谱层析，收集活性部分，冷冻干燥，得到加迪霉素。 [0017] 所述加迪霉素生物学实验研究结果证明，其对体外培养的多种肿瘤细胞有明显的抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞凋亡，并产生细胞周期阻滞；体内动物实验确证，加迪霉素可明显抑制小鼠H22肝癌的肿瘤生长。

[0018] 发明优点：

[0019] 本发明所提供的抗肿瘤抗生素加迪霉素是一个新的蛋白类的抗生素。目前，临床应用的蛋白类抗肿瘤抗生素较少，JDM增加了抗肿瘤药物的来源，为抗肿瘤药物的开发和应用提供了新的物质基础。附图说明：

[0020] 图1葡聚糖Sephadex G50凝胶过滤柱层析洗脱图谱

[0021] 其中：X轴-收集组分的编号，顺序为从右至左；Y轴-紫外吸收的强度，单位为mV；

[0022] 图2加迪霉素的HPLC色谱图，检测波长为280nm；

[0023] 其中：X轴—时间，单位为min；Y轴—紫外吸收的强度，单位为mAU； [0024] 图3加迪霉素的SDS-PAGE电泳图，其分子量约为11kDa；

[0025] 其中：a—加迪霉素；b—标准蛋白分子量Marker；

[0026] 图4加迪霉素的MALDI-TOF质谱图

[0027] 其中：X轴—分子离子峰的m/z值；Y轴—分子离子峰的信号响应值，单位a.u.；+ 2+
其分子离子峰（m/z）为10807.9[M+H] 以及5403.8[M+H] ，确定加迪霉素的分子量为
10.8kDa；

[0028] 图5加迪霉素对超螺旋质粒DNA pBR322的切割

[0029] 其中：I—超螺旋DNA；II—切口DNA；III—线性DNA；15、16、17—SephadexG50凝胶层析所收集的编号为15、16、17的活性组分；NC—pBR322质粒对照；图6MTT法检测加迪霉素及丝裂霉素对细胞增殖的抑制作用

[0030] 其中：横坐标轴为药物的浓度，单位为μmol/l；纵坐标轴为细胞存活性率（％）； 不同浓度JDM处理的PG细胞； 不同浓度JDM处理的HCT116细胞； 不同浓度JDM处理的HepG2细胞； 不同浓度MMC处理的PG细胞； 不同浓度MMC
处理的HCT116细胞； 不同浓度MMC处理的HepG2细胞；

[0031] 图7加迪霉素作用48小时细胞周期分布图

[0032] 其中：加迪霉素的浓度分别为0.01、0.05和1.0μmol/l；

[0033] 图8加迪霉素作用48小时细胞凋亡图

[0034] 其中：加迪霉素的浓度分别为0.05、0.1、0.5、1.0和5.0μmol/l。 具体实施方式：

[0035] 以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0036] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0037] 以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0038] 《实施例1》链孢囊菌C-3560的培养特征

[0039] 形态特征：在葡萄糖天门冬素琼脂和燕麦粉琼脂插片培养15天后，C-3560菌株形成圆形、卵圆形或不规则形的孢囊，长度大约为8-12μm。孢囊内孢子排 列成单圈，椭圆形，无鞭毛，不运动，表面光滑。基内菌丝体无横隔，不断裂。气生菌丝呈乳白至白色，长度中等，有分枝的孢子丝较短，直形，表面光滑。

[0040] 形状特征：C-3560菌株在8种培养基上的培养特征如表2所示。

[0041] 表2C-3560菌株的培养特征

[0042]

[0043] 链孢囊菌C-3560 16S rDNA序列分析：

[0044] C-3560菌株的16S rDNA序列与GenBank比较表明，该菌属链孢囊菌属Streptosporangium。菌株C-3560与紫晶链孢囊菌（Streptosporangiumamethystogenes）的16S rDNA序列同源性最高，为98.63％。综合考虑菌株C-3560的培养特征、生理生化指标，16rDNA，确认C-3560与紫晶链孢囊菌（Streptosporangium amethystogenes）同属。 [0045] 《实施例2》链孢囊菌C-3560的发酵液制备

[0046] 将甘油管保藏的链孢囊菌C-3560菌株接种到斜面培养基上。斜面培养基按重量比为：酵母提取物0.4，麦芽提取物1.0，葡萄糖1.0，燕麦粉1.0， FeSO4·7H2O 0.0001，MnCl2·4H2O 0.0001，ZnSO4·7H2O 0.0001，琼脂1.4-1.8，蒸馏水100，pH值为7.0。28-30℃恒温静止培养10-14天。将斜面培养物挖块接种于1000ml种子培养基中（种子培养基按重量比为：可溶性淀粉1.0，饴糖2.0，NaCl 0.3，消化血清粉0.5，酵母提取物0.2，黄豆粉1.0，FeSO4·7H2O 0.0001，MnCl2·4H2O 0.0001，ZnSO4·7H2O 0.0001，蒸馏水100）。28-30℃恒温，190rpm震荡培养72小时。取培养好的种子培养液，按10％比例接入10L发酵培养基中（发酵培养基按重量比为：糊精1.0，饴糖2.0，NaCl 0.3，消化血清粉0.5，啤酒酵母0.2，黄豆粉1.0，FeSO4·7H2O 0.0001，MnCl2·4H2O 0.0001，ZnSO4·7H2O0.0001）。28-30℃恒温，
90rpm往复震荡培养96小时。获得可提取蛋白的发酵液10L

[0047] 《实施例3》多步层析制备加迪霉素

[0048] C-3560菌株的发酵液经5000rpm 4℃低温离心20min，取上清液。上清液经3kDa超滤膜组件（CLW-003型，截留分子量为3kDa，北京旭邦膜设备有限责任公司）浓缩，获得粗浓缩液1L供以下多部层析：

[0049] 1）DEAE-cellulose弱阴离子交换柱层析

[0050] 粗浓缩液1L经5000rpm 4℃低温离心20min，获得上清液；经DEAE-cellulose+（Whatman DE52型）弱阴离子交换柱层析（Na 型，以去离子水预平衡），该交换柱的柱体积为
180ml，柱径比为9∶48收集流穿液。以500ml 0.05mol/l NaCl溶液洗脱。收集0.05mol/l NaCl的洗脱液，合并流穿液与活性峰为粗提液；

[0051] 2）Butyl Sepharose疏水柱层析

[0052] Butyl Sepharose疏水柱以1.7mol/l(NH4)2SO4溶液预平衡。将粗提液加入(NH4)2SO4至终浓度为1.7mol/l，经5000rpm 4℃低温离心20min，取上清液。经Butyl Sepharose疏水柱层析。该Butyl Sepharose疏水柱（Butyl Sepharose 4 FastFlow GE公司）体积为80ml，柱径比为3∶25。以1.7mol/l、1.3mol/l、1.2mol/l和1.1mol/l(NH4)2SO4溶液四步洗脱，1.7mol/l(NH4)2SO4溶液的洗脱体积为250ml，1.3mol/l、1.2mol/l和1.1mol/l(NH4)2SO4溶液的洗脱体积均为150ml。分部洗脱并分部收集，合并经微生物检定法检测的活性组分共185ml，以超滤离心管（Amicon Ultra-15 3K）3500rpm离心浓缩，获得浓缩液6ml。

[0053] 3）Sephadex G50凝胶过滤层析

[0054] 将2）步骤所得的浓缩液，经葡聚糖凝胶（Sephadex G50，GE公司）色谱层析，柱体积为800ml，柱径比为7∶200，以去离子水洗脱，图1是葡聚糖凝胶（Sephadex G50）色谱层析的色谱图。分部洗脱并分部收集，各组分微生物检定法检测活性，标示为编号为15、16、17所示位置的组分具明显抗枯草杆菌活性。

[0055] 4）将3）步骤所收集 的活性组分经HPLC高效 液相色谱鉴定纯度（BioSep-SEC-S3000色谱柱，菲罗门公司），色谱图图2中保留时间10.466min的色谱峰为加迪霉素。收集纯度大于99％的组分共25mL，以超滤离心管（AmiconUltra-15 3K）3500rpm离心浓缩，获得加迪霉素蛋白纯品溶液2ml。BCA法（BCA试剂盒，Thermo公司）测定蛋白浓度为5.24mg/ml。加迪霉素溶液进行SDS-PAGE电泳鉴定，图3中所示加迪霉素的分子量小于14.3kDa。加迪霉素经MALDI-TOF质谱法鉴定分子量，图4中分子离子峰显示的分子量为
10.8kDa。

[0056] 5）氨基酸序列测定

[0057] 采用自动化EDMAN降解法测定加迪霉素的N-末端序列（序列表SEQ No1） [0058] 《实施例4》加迪霉素的生物学活性检测

[0059] 1）微生物检定法：以直径5mm的圆滤纸片，沾取发酵液及分部收集组分，测量抑菌圈直径。检定菌为枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]。

[0060] 2）DNA断裂法：将3.5μl 50M Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液、4.5μl pBR322 DNA溶液（100ng/μl）和1μl加迪霉素溶液混合，置室温暗处反应1h，再加入电泳样品孔，在1％琼脂糖凝胶中电泳1h，用溴化乙锭水溶液（0.45mg/L）染色30min。在紫外灯下（302nm）检测pBR322 DNA拓扑结构的变化；并用凝胶成像系统扫描凝胶，记录结果。图5表明，加迪霉素具有切割pBR322质粒的活性，可改变DNA分子的拓扑结构。

[0061] 3）体外抑制肿瘤细胞增殖的检测

[0062] 采用MTT法进行体外细胞毒性实验，取对数生长期人肝癌HepG 2细胞，人肺癌PG细胞和人肠癌HCT 116细胞，按每孔4000个细胞接种于96孔板中，37℃，5％CO2培养24h后加药，设空白对照组用于调零，加迪霉素设5μmol/l、1μmol/l、0.2μmol/l.、0.04μmol/l、8nmol/l、1.6nmol/l、0.32nmol/l、0.064nmol/l和0.0128nmol/l浓度组，每组重复3孔，37℃，5％CO2培养48h。同时设丝裂霉素 对照组平行实验。各孔加MTT（5mg/ml）10μl，继续孵育4h，弃上清，加入100μl DMSO，震荡15min待甲瓒（Formazan）结晶（在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，MTT的四唑环开裂，生成蓝紫色结晶）充分溶解后，使用酶标仪在
570nm处测定吸光值（A）。每个监测点取3孔的平均值，实验重复3次，计算IC50值。细胞存活率％＝（加药组细胞A值—本底A值）/（对照组细胞A值—本底A值）×100％。图6显示了加迪霉素和丝裂霉素对人肝癌HepG 2细胞，人肺癌PG细胞和人肠癌HCT 116细胞三种细胞株增殖的抑制作用。

[0063] 结果显示，加迪霉素对HepG2、PG和HCT116细胞的IC50值分别为0.020μmol/l、0.016μmol/l和0.034μmol/l。对照药品丝裂霉素对HepG2、PG和HCT116细胞的IC50值分别为1.605μmol/l、1.367μmol/l和0.290μmol/l。说明，实验组加迪霉素比对照组丝裂霉素具有明显优越的抑瘤活性。，

[0064] 4）加莫霉素对细胞周期的影响

[0065] HepG 2细胞经加迪霉素处理24h后，收集正常对照组细胞和各浓度组细胞，加入冰冷的PBS缓冲液，将细胞轻轻吹打成单个细胞，离心，PBS洗2遍，用约300μl的PBS重悬细胞，一边震荡一边加入1.5ml-20℃预冷95％乙醇，4℃固定过夜。染色前细胞用PBS洗2遍，沉淀重悬于PI染液（50μg/ml+200μg/ml RNase A）由37℃避光染色30min。细胞经
200目尼龙网过滤后，用流式细胞仪测定DNA含量并分析细胞周期变化。

[0066] 结果显示，与对照组相比，加迪霉素作用HepG 2细胞48h后，G2/M期的细胞有明显增加，并随着浓度的增加，阻滞作用增强，表明加迪霉素可使HepG 2细胞产生G2/M期阻滞。图7所示结果表明，加莫霉素浓度为0.01μmol/l时，G2/M期的细胞为91.95％，浓度为0.05μmol/l时，G2/M期的细胞即可达到100％。

[0067] 5）加迪霉素对细胞凋亡的影响

[0068] Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞的凋亡率：酶消化收集正常对5 6
照组和各浓度组的细胞，将待测细胞的浓度调整为5×10-1×10cells/ml；取1ml细胞悬液，1000rpm，4℃离心5min，弃上清；加入1ml冷PBS，轻轻振荡使细胞悬浮；1000rpm，4℃离心5min，弃上清，重复两次。将细胞重悬于500μl binding buffer，加入10μl Annexin V-FITC，轻轻摇匀，室温反应30min；加入5μlPI轻轻摇匀，室温反应5min；细胞经200目尼龙网过滤后，在流式细胞仪上进 行检测，采集荧光强度并分析处理数据。 [0069] 结果表明，不同浓度的加迪霉素作用HepG 2细胞48h后，细胞凋亡率随浓度增加而升高。0.05μmol/l、0.1μmol/l、0.5μmol/l、1.0μmol/l和5.0μmol/l作用于HepG
2细胞，凋亡率分别为11.78±2.72％、12.35±5.44％、21.12±1.10％、36.875±1.02％和
77.22±13.47％，明显高于对照组7.55±2.62％。图8显示了HepG2细胞在不同浓度加迪霉素作用下的凋亡情况。

[0070] 6）加迪霉素抑制小鼠肝癌H22肿瘤生长

[0071] 实验采用雌性昆明小鼠，体重18～22g（购自军事医学科学院）。取小鼠腹腔悬液传代的肝癌H22细胞，每只小鼠腋窝皮下接种200万个细胞（0.2ml）。实验按照体重随机分组：尾静脉注射生理盐水对照组，加迪霉素1.0mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg组及丝裂霉素2.0mg/kg组，每组10只。给药方案：腋窝皮下移植肿瘤后24h、4天、7天经尾静脉注射加迪霉素给药。第11天处死小鼠，称体重，剥离肿瘤称瘤重。

[0072] 实验结果如表1所示，加迪霉素可抑制小鼠肝癌H22肿瘤的生长，尾静脉注射加迪霉素1.0mg/kg及0.5mg/kg，对肿瘤生长的抑制率分别为52.1％（P<0.01）和38.4％(P<0.01)。加迪霉素剂量1.0mg/kg与丝裂霉素剂量2.0mg/kg对肿瘤生长的抑制率相当，分别为52.1％和51.8％

[0073] 表1加迪霉素对小鼠肝癌H22肿瘤生长的抑制作用

[0074]

[0075] 注：**与对照组比较P<0.01 。