OsMADS57蛋白或其编码基因在抑制水稻分蘖中的应用转让专利
申请号 : CN201210183051.3
文献号 : CN102675441B
文献日 : 2014-07-30
发明人 : 种康 , 郭思义 , 徐云远
申请人 : 中国科学院植物研究所
摘要 :
本发明公开了一种OsMADS57蛋白或其编码基因在抑制水稻分蘖中的应用。本发明提供了OsMADS57蛋白或其编码基因或表达OsMADS57的重组载体在抑制植物分蘖中的应用。本发明的实验证明，在粳稻中花十号中克隆到一个OsMADS57基因，将其反向插入表达载体，得到反义表达载体；利用反义表达载体导入水稻中花十号，得到反义转基因水稻株系，与野生型水稻相比，反义转基因水稻株系的分蘖减少。
权利要求 :
1.一种重组载体在抑制水稻分蘖中的应用；
所述重组载体为将序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸插入表达载体pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间得到的反义表达载体，且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接，所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接。
2.一种抑制植物分蘖的方法，为将下述重组载体导入目的植物中，得到分蘖数小于所述目的植物的转基因植物；所述重组载体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸插入表达载体pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间得到的反义表达载体，且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接，所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接；所述目的植物为水稻。
说明书 :
OsMADS57蛋白或其编码基因在抑制水稻分蘖中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种OsMADS57蛋白或其编码基因在抑制水稻分蘖中的应用。
背景技术
[0002] 植物株型是影响作物产量的重要因素之一，特别对水稻作物而言。目前知道水稻的分蘖数目、分蘖角度、植株高度、叶夹角、水稻穗子的大小和水稻小穗分支多少共同决定了水稻株型，而水稻的分蘖数和穗子的形状又是决定水稻产量的最重要因素。对于水稻分蘖发育而言，分蘖期是水稻营养生长的最主要时期,包括从分蘖芽的分化到幼穗的形成。一般水稻品种，生长环境条件（温度、水分、营养状况）及其种植密度也会影响分蘖的发育。
生长周期长的水稻品种一般比生长周期短的水稻分蘖要少一些。水稻分蘖包括一级分蘖和二级分蘖。根据分蘖结实的情况，分蘖又分为有效分蘖和无效分蘖两种。有效分蘖的多少是决定水稻产量重要因素之一，所以我们通过各种手段尽可能的增加可育分蘖数量。
生长周期长的水稻品种一般比生长周期短的水稻分蘖要少一些。水稻分蘖包括一级分蘖和二级分蘖。根据分蘖结实的情况，分蘖又分为有效分蘖和无效分蘖两种。有效分蘖的多少是决定水稻产量重要因素之一，所以我们通过各种手段尽可能的增加可育分蘖数量。
[0003] 随着科学研究的进展，特别是水稻的基因组学和生物信息学的迅速发展。目前，水稻中与分蘖发育相关的一些基因陆续被克隆出来。如我国学者李家洋实验室克隆的MOC1基因直接影响水稻的分蘖数目，当该基因突变后表现出分蘖减少的表型，该基因的超表达转基因植株表现出分蘖增多的表型。该实验室最新研究发现MOC1相互作用的蛋白TAD1，编码这个蛋白的基因突变后表现出分蘖增多的表型。研究表明水稻中D17/HTD1及拟南芥同源基因MAX3和D10及拟南芥同源基因MAX4均编码类胡萝卜素切割双氧酶蛋白，它们分别简称carotenoid cleavage deoxygenate protein 7(CCD7)和carotenoid cleavage deoxygenate protein 8(CCD8)。MAX3和MAX4这两个基因参与了植物分支激素（独脚金内酯）的生物合成，这个激素合成的途径中发现位于CCD7和CCD8的下游存在另外一些关键基因，例如拟南芥中编码一种细胞色素P450酶MAX1，水稻还没有相关同源基因的报道。2009年李家洋课题组报道了一个和d10经典分蘖突变体表型类似的突变体d27，D27编码一个铁离子包含蛋白，亚细胞定位显示该基因和叶绿体共定位，主要在茎和根的微管细胞中表达。最终实验证据表明D27可能是独脚金内酯生物合成途径的一个新成员。另一个影响水稻分蘖发育的基因D3则编码一个含F-box的LRR蛋白，这个基因突变后也表现出分蘖增多的表型。2009年几个课题组相继报道了另一个和分蘖相关的突变体d14/htd2/d88，同样具有独脚金内酯途径中经典突变体的表型，即分蘖数增多和植株矮化，还表现出穗子变短和种子变小的表型。2003年日本一个课题组根据同源性分析发现玉米的TEOSINTEBRANCHED1(TB1)高度同源性基因OsTB1/FC1，该基因编码TCP转录因子家族的蛋白，是分蘖发育的负调控因子。这个基因的突变体表现出分蘖数增多和半矮化的表型，该基因超表达转基因植株表现出分蘖减少的表型。2009年日本另外一个课题组发现了这个基因的另一个突变体fc1，独脚金内酯处理该突变体的生理实验证明fc1表现出对这个激素不敏感的表型，作者推测OsTB1/FC1也可能位于MAX/RMS/D遗传途径的下游，部分参与了独脚金内酯的信号传导。2009年a rice dwarf and low-tillering(dlt)mutant被发现和研究，这个突变体表现出矮化和分蘖减少的表型，相应的DLT转基因证实了该突变体的表型，结果表明dlt突变体表现出类似于水稻中油菜素内酯缺陷和信号突变体的表型。
[0004] 组成型超表达技术和反义转基因是一个已经发展比较成熟的研究基因功能的技术。它是将基因以正向和反向的方式插入到强启动子的下游，可以使表达的基因转录本在体内得到强的表达和表达量降低，从而使目的蛋白表达量增加和表达量减少。当对某一个感兴趣的基因进行功能鉴定时，采用组成型超表达和反义转基因技术可以使我们了解在该基因的表达很大程度的增强和内源基因的表达量减少，研究目的基因表达增强和表达减少的情况下，植物的生长发育等过程是否会受到影响，从未可以推断该基因的可能的生物学功能。
发明内容
[0005] 本发明的一个目的是提供OsMADS57蛋白或其编码基因或表达OsMADS57的重组载体的新用途。
[0006] 本发明提供了OsMADS57蛋白或其编码基因或表达OsMADS57的重组载体在抑制植物分蘖中的应用；
[0007] 所述OsMADS57蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0008] 上述应用中，所述OsMADS57蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸；
[0009] 所述表达OsMADS57的重组载体为将所述OsMADS57的编码基因插入表达载体中，得到表达OsMADS57的载体。
[0010] 所述表达OsMADS57的重组载体具体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸插入表达载体pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间得到的载体，且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接，所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接。
[0011] 上述应用为将所述OsMADS57蛋白的编码基因导入目的植物中，得到分蘖数小于所述目的植物的转基因植物。
[0012] 上述应用中，所述OsMADS57蛋白的编码基因通过所述表达OsMADS57的重组载体导入目的植物中。
[0013] 上述应用中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0015] 本发明提供的方法，为将上述的应用中的所述OsMADS57蛋白的编码基因导入目的植物中，得到分蘖数小于所述目的植物的转基因植物。
[0016] 上述方法中，所述OsMADS57蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物中。
[0017] 上述方法中，所述重组载体为将所述OsMADS57的编码基因插入表达载体中，得到表达OsMADS57的载体；
[0018] 所述重组载体具体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸插入表达载体pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间得到的载体，且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接，所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接。
[0019] 本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
[0020] 本发明提供的重组载体，为将上述的应用中的所述OsMADS57的编码基因插入表达载体中，得到表达OsMADS57的载体。
[0021] 所述重组载体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸插入表达载体pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间得到的载体，且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接，所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接。
[0022] 本发明的实验证明，在粳稻中花十号中克隆到一个OsMADS57基因，将其反向插入表达载体，得到反义表达载体；利用反义表达载体导入水稻中花十号，得到反义转基因水稻株系，与野生型水稻相比，反义转基因水稻株系的分蘖减少。
附图说明
[0023] 图1为RT-PCR方法扩增到OsMADS57的全长
[0024] 图2为反义表达载体pUN-OsMADS57（反义）的物理图谱
[0025] 图3为反义转基因水稻的定量PCR鉴定
[0026] 图4为OsMADS57反义转基因水稻分蘖的表型
具体实施方式
[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 实施例1、OsMADS57蛋白及其编码基因的获得
[0030] 根据数据库分析的结果设计引物：
[0031] 反义表达载体构建使用引物：5′端引物：5’-CGGGATCCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3’(下划线序列为BamHI位点，序列3)，3′端引物：5’-GGGGTACCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’(下划线序列为KpnI位点，序列4)。
[0032] 提取粳稻中花十号三叶期幼苗总RNA，采用RT-PCR方法扩增到OsMADS57的726bp全长cDNA。具体操作过程如下：
[0033] 1）植物总RNA的提取：选取100mg三叶期水稻中花十号（Oryza sativa L.cvZhonghua 10）的幼苗（李梅芳，水稻花培品种—中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页。公众可从中国科学院植物研究所获得。）为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含1ml Trizol试剂（Invitrogen）的1.5ml离心管中，充分混匀；25℃放置5分钟；每管中加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15秒，25℃温育2-3分钟；12,000rpm，4℃，离心15分钟；把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，25℃放置10分钟使RNA沉淀；12,000rpm，4℃，离心10分钟；去上清，将RNA沉淀用1ml 75%乙醇清洗2次，超净台吹至半干；用50μl DEPC-ddH2O重悬沉淀，60℃水浴10分钟，以溶解RNA沉淀获得RNA溶液。将此RNA溶液分装后-70℃保存，备做反转录的模板。
[0034] 2）RT-PCR：取1μl上述RNA溶液，用DEPC-ddH2O稀释100倍，用分光光度计测定RNA浓度。参照RT-PCR试剂盒（Promega）说明书，根据RNA的定量结果，取含有2μgRNA的上述RNA溶液，加1.0μgOligo dT引物，用DEPC-ddH2O补充至15μl，混匀后70℃变性5分钟，冰浴5分钟。短暂离心后，加入25μl反转录混合物（5μlM-MLV 5×React ion Buffer，6μl dNTP Mixture (2.5mM)，1μl M-MLV Reverse Transcriptase，0.5μl RNase Inhibitor，12.5μlDEPC-ddH2O）。混匀后，42℃水浴1小时完成反转录过程；75℃水浴10分钟使反转录酶失活，得到含有第一链cDNA的混合物。
[0035] 取1μl上述第一链cDNA作为PCR的模板，按以下体系进行PCR反应：0.2μlLATaq（5U/μl）、10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTPs,0.5μl 5′端引物(10μM)，0.5μl3′端引物(10μM)，加ddH2O终体积20μl。
[0036] 5′端引物和3′端引物分别如下：
[0037] 以反义表达构建引物序列5′端引物：5’-CGGGATCCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3’(下划线序列为BamHI位点，序列3)，3′端引物：5’-GGGGTACCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’(下划线序列为KpnI位点，序列4)为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物（反义）。
[0038] 上述PCR程序为：94°C预变性30s后进入PCR循环，循环参数为98°C 10秒变性→55°C 15秒复性→72°C 40秒延伸,35个循环后在72°C继续合成10分钟。
[0039] 将PCR产物（反义）经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，PCR产物（反义）的条带大小为726bp。
[0040] 回收PCR产物（反义）进行测序，结果为PCR产物（反义）的核苷酸序列具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸，序列1的OFR为序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸。该PCR产物的基因命名OsMADS57，OsMADS57编码的蛋白为OsMADS57，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0041] 实施例2、OsMADS57蛋白及其编码基因的应用
[0042] 一、反义表达载体pUN-MADS57（反义）的获得
[0043] 1、pUN1301质粒的获得
[0044] 第一步：剪取约0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1%SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾水溶液，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟,弃上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNaseA的ddH2O中，得到玉米基因组DNA。
[0045] 第二步：取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板，以带有Hind III识别位点的5′引物（GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG）和带有BamHI识别位点的3′引物（CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG）为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后回收，得到片段经测序，该片段为序列表中的序列5自5’末端的第1-1986位核苷酸,为带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）。（玉米泛素启动子（UbiPro）也可以人工合成获得。）[0046] 第三步：用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI 121（北京拜尔迪生物技术有限公司目录号：MP-091）上切下，连接到载体pUC19（北京百泰克生物技术有限公司目录号：DP7801）的Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与第二步中经酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）相连，得到重组载体，命名为pUN19。
[0047] 第四步：用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切从第三步购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。
[0048] 2、表达载体pUN-MADS57（反义）的获得
[0049] 用限制性内切酶KpnI和BamHI对由实施例1得到的726bp PCR产物（反义）进行双酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的1步骤获得的质粒pUN1301连接，得到重组质粒。
[0050] 将重组质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸插入pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pUN-OsMADS57（反义），且序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过pUN1301的KpnI酶切位点与其连接，序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接，其物理图谱示意图如图2所示。
[0051] 二、转OsMADS57水稻（反义）的获得及鉴定
[0052] 1、转OsMADS57水稻（反义）的获得
[0053] 参照电激仪（EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司）操作指南，将pUN-MADS57（反义）用电击法转化农杆菌EHA105（Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11），经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌，命名为EHA105/pUN-OsMADS57（反义）。
[0054] 将EHA105/pUN-OsMADS57（反义）导 入 中花 十 号水 稻（Oryza sativaL.cv Zhonghua10，以下简称野生型水稻）的愈伤组织中，再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选一代；两周后，转移至N6D2S2培养基上筛选二代（2周/代）；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基（1），上，在分化培养箱（12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃）中培养7天；然后转移至分化培养基（2），上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得10个株系共100棵T0代转OsMADS57水稻（反义）。
[0055] 所用培养基如下：
[0056]
[0057] 2、转OsMADS57水稻（反义）的鉴定
[0058] 1）、GUS组织化学染色：
[0059] 将由实施例1获得的100棵T0代转OsMADS57水稻（反义）的2-3mm长的根段分别放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，染色后的组织用70%乙醇脱色。根呈蓝色的植株即为阳性转基因材料。GUS染色液（pH 7.0）组分为：100mMNa3PO4(pH 7.0)，
0.1%Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/ml X-Gluc。结果共鉴定出8个株系合计80棵阳性T0代转OsMADS57水稻（反义），将此幼苗移至温室栽培，按照不同株系收种，得到T1代转基因种子，在此基础上经过繁种得到纯合T2代种子。在以后的实验中选取转OsMADS57水稻（反义）1（AS1）和2（AS3）的纯合种子T2为材料。
0.1%Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/ml X-Gluc。结果共鉴定出8个株系合计80棵阳性T0代转OsMADS57水稻（反义），将此幼苗移至温室栽培，按照不同株系收种，得到T1代转基因种子，在此基础上经过繁种得到纯合T2代种子。在以后的实验中选取转OsMADS57水稻（反义）1（AS1）和2（AS3）的纯合种子T2为材料。
[0060] 2）、定量PCR鉴定：
[0061] 从AS1和AS3的T2转OsMADS57水稻（反义）幼苗中提取mRNA，并分别转录获得cDNA，以野生型水稻（水稻中花十号）为对照。利用荧光实时定量PCR法，以cDNA为模板，以1μl 5′端引物1(10μM)(5′-TTGAGCCAATCACAGCAAAGAG-3′)，1μl 3′端引物1(10μM)(5′-TCGTCCAGCTTGTACGGCATAG-3′)为引物，对阳性T2代转OsMADS57水稻中OsMADS57的表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。吸取1μl第一链cDNA溶液，稀释50倍作为模板，按以下体系进行PCR反应：10μlSYBR Green Realtime PCR Master Mix,4μl模板,1μl 5′端引物1(10μM)，1μl 3′端引物
1(10μM)，加ddH2O终体积20μl。
1(10μM)，加ddH2O终体积20μl。
[0062] 用Actin作为内参，Actin的5′端引物：5′-CGTATGAGCAAGGAGATCAC-3′，3′端引物为：5′-CACATCTGTTGGAAGGTGCT-3′。PCR程序为：预变性2分钟,进入PCR循环，循环参数为94°C 15秒→56°C 15秒→72°C 15秒，共40个循环。
[0063] 结果如图3所示，在Actin基因作为内参的情况下，与野生型水稻相比，AS1和AS3的T2幼苗中OsMADS57的表达丰度有了不同程度的下调，说明目的基因（OsMADS57)再转录水平已经成功表达且使内源OsMADS57转录本表达量减少。
[0064] 采用同样的方法将空载体pUN1301导入野生型水稻中得到T0代转空载体水稻，从T0代转pUN1301水稻上收获T1代转pUN1301水稻种子，播种，从T1代转pUN1301水稻上收获T2代转pUN1301水稻种子。
[0065] 三、转OsMADS57水稻（反义）的表型观察
[0066] 将T2代转OsMADS57水稻（反义）的AS1和AS3种子、中花十号野生型水稻种子（ZH10）和T2代转pUN1301水稻种子，均播种在花卉营养土和蛭石的混合物里（两者的混合比例为4:1），30℃萌发后放在温室里（32℃）培养至3叶期，接着把生长的幼苗种植于水稻田中。每个株系40个，实验重复三次，结果取平均值。
[0067] 对植株分蘖数进行观察，结果如下：
[0068] 拍照如图4A所示，可以看出，与野生型水稻相比，T2代转OsMADS57水稻（正义）OE1的分蘖数减少。
[0069] 在播种后约第70天统计T2代转OsMADS57水稻（反义）的AS1和AS3种子、中花十号野生型水稻种子（ZH10）和T2代转pUN1301水稻分蘖数，结果如图4B所示，T2代转OsMADS57水稻（反义）AS1、T2代转OsMADS57水稻（反义）AS3、中花十号野生型水稻（ZH10）的分蘖数分别为14个、11个和8个。T2代转pUN1301水稻和野生型水稻结果无显著差异。