一种块菌酒及其制备方法

摘要

本发明属于食品或医药技术技术领域，本发明提供了一种块菌酒及其制备方法。本发明所述制备方法可使块菌菌丝体提高69％；块菌胞外多糖产量提高150％；菌胞内多糖提高57％；本发明所述的制备方法简单易行，适合工业生产。

权利要求

1.一种块菌酒，其原料包含5-95重量份的块菌菌丝体，95-5重量份的谷物；其特征在于：其中所述的块菌菌丝体的制备方法为：

I、液体菌种培养：

1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入20-35℃恒温培养箱培养2-30天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯去皮，切片，煮沸15-20分钟过滤得滤液；将榛叶放入水中煮沸约10-15分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖，琼脂，用蒸馏水定容，调pH值为6-9；

2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为15-40℃，转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基的配方为：榛叶汁300-900g/L，蔗糖1-300g/L，蛋白胨

1-100g/L，酵母膏1-20g/L，硫酸镁1-10g/L，磷酸二氢钾1-10g/L，pH值为6-9；

3)二级液体种子培养：将步骤2)中培养的一级液体种子按照5-50％体积比的接种量转接入装有二级液体种子培养基的摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为15-40℃，转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基的配方为：榛叶汁300-900g/L，蔗糖1-300g/L，蛋白胨

1-100g/L，酵母膏1-20g/L，硫酸镁1-10g/L，磷酸二氢钾1-10g/L，pH值为6-9；

II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

1)配制营养水：将蔗糖10-50g，酵母膏0-20g，蛋白胨0-20g，磷酸二氢钾0-10g，硫酸镁0-10g溶于700-900ml水中，定容至1000ml，调节pH至6-9；

2)配制固态发酵培养基：按重量比为0.8-2∶1将谷物加入到营养水中；

3)固态发酵：按照固体发酵培养基干重的1-50％体积/重量，将二级液体种子接种于步骤2)所得的固态发酵培养基上，于20-40℃发酵培养2-60天，料层厚度为1-10cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉；

或者：

液态深层发酵法生产块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液制备方法为：

1)配制液体培养基：将鲜榛叶放入水中煮20-40分钟后过滤，取滤液，加入蔗糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸镁、磷酸二氢钾，用水定容，调pH值为6-9，消毒灭菌即得；

2)发酵条件为：按照5-50％体积比的接种量将I中所得的二级液体种子接种于1)所得的液体培养基上，装液量为容积的60-80％，在20-40℃，通气速率为30-60升/分钟，搅拌转速为200-800转/分钟的条件下培养2-30天，得块菌菌丝体液；

3)将步骤2)所得块菌菌丝体液离心，过滤，干燥，粉碎，过筛，灭菌，即得块菌菌丝体粉；

块菌酒的制备方法为：

制备方法一：将重量比为1∶0.1-2的谷物和块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液作为原料，接入2-8％重量比的甜酒曲和1-5％重量比的活化酵母液后，在20-40℃下发酵2-10天，然后在15-30℃静置发酵20-50天，按照黄酒的酿造工艺，制成块菌黄酒；或制备方法二：将块菌菌丝体发酵粉用超声波破碎，120℃蒸煮1-3小时，放至室温；

每100g块菌菌丝体发酵粉添加50-150mL的酵母-糖化酶-醋酸预混液；20-40℃恒温发酵10-30天，然后用纱布过滤，滤液4-8℃发酵20-80天，取上清，微孔滤膜除菌，密封，低温贮存，即得；所述的酵母-糖化酶-醋酸预混液包含体积分数为3-8％冰醋酸，酵母

5-15g/100mL，糖化酶10-20g/100mL。

2.根据权利要求1所述的一种块菌酒，其特征在于所述的块菌属菌株选自中国块菌、印度块菌、黑孢块菌、白块菌或夏块菌中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种块菌酒，其中所述的谷物为大米、小米、玉米、紫米，红米，黑米，小麦、大麦、青稞、荞麦或高粱的一种或几种。

说明书

一种块菌酒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及含有块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液的保健品及其制备方法。

背景技术

[0002] 块菌(Truffle)，也称松露，具有独特的香味、口感和营养价值，人类食用块菌已有上千年的历史。块菌富含17种氨基酸、8种维生素、适量的蛋白质、以及雄性酮、甾醇、鞘脂、脂肪酸、氨基酸及微量元素等50余种生理活性成分。并且含有人体自身不能合成的8种氨基酸、锌、锰、铁、钙、磷、硒等必需营养素，具有增强免疫力、抗衰老、益胃、清神、止血、疗痔等药用价值，具有抗癌活性，对癌细胞有一定的抑制作用，可以激发脑细胞活力。

[0003] 块菌泡制的保健酒香味独特、口感好，绿色保健和药理作用明显，具有壮阳、补肾，降低血清低密度脂蛋白、胆固醇，升高高密度脂蛋白、防止动脉粥样硬化及抗肿瘤等显著功效。

[0004] 文献报道连续通过10天给药接种有S-180肉瘤、EAC肉瘤液的小鼠，发现25mg/kg、50mg/kg的快菌多糖能明显的抑制小鼠S-180肉瘤及EAC肉瘤的生长。同时通过连续给药发现块菌多糖对小鼠脾脏的重量、外周血中的白细胞数及T淋巴细胞百分率具有明显的增加作用；能够促进T淋巴细胞转化，提高小鼠血清中IgG水平等。实验结果表明，块菌多糖作为一种新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制肿瘤作用明显。

[0005] 块菌多糖可以直接从块菌子实体中提取，亦可通过块菌液体深层发酵的方法获得，但前者不适于工业化大生产，原因在于：

[0006] 1、块菌作为一种生长于地下的药食两用真菌，在自然界中要求生长于碱性土壤、气候温和的环境，同时与橡树等树种的根系共生，苛刻的生长条件直接导致了天然产量的供不应求；

[0007] 2、为弥补块菌天然产卵量的不足，曾有不少学者进行了半人工模拟培养的研究，但从接种到收获一般需要7-9年时间，周期较长，需要耗费大量的人力和物力；

[0008] 3、由于块菌生长于地下，人工发现的难度较大，采集过程中易受到损伤，同时块菌生长于自然界受环境变化的影响较大，品质较难保证；

[0009] 4、目前市场上销售的新鲜块菌价格昂贵，因此若直接以块菌子实体作为块菌多糖的生产原料则无法回避受原料价格及数量的限制。

[0010] 目前，中国专利200610166503、中国专利申请200810172343公开了生产块菌活性菌丝体和块菌多糖的方法，均通过斜面培养，一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵的过程获得块菌活性菌丝体和块菌多糖。

发明内容

[0011] 经过大量的试验，我们惊奇的发现在发酵过程中增加固态发酵能过有效的提高块菌多糖的含量。本发明发酵方法所得的产物用浓硫酸-苯酚法测定块菌多糖的含量，测定结果表明，本发明的方法相比于现有的分批培养，培养产物中黑孢块菌菌丝体比分批培养提高了20％，尤其是块菌胞外多糖产量比分批培养法提高了50％，块菌细胞培养中块菌胞内多糖比分批培养法增加了24.8％。

[0012] 同时，我们还发现在培养基中添加适当重量比的榛叶汁，可明显提高块菌菌丝体的产量，培养产物中黑孢块菌菌丝体比分批培养提高了69.2％，尤其是块菌胞外多糖产量比分批培养法提高了150％，块菌细胞培养中块菌胞内多糖比分批培养法增加了57.3％。

[0013] 本发明的目的是提供一种块菌酒及其制备方法。

[0014] 本发明的目的是提供一种块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液的制备方法。

[0015] 本发明的目的是提供一种适于培养块菌的固态发酵法。

[0016] 本发明的目的是提供一种适于培养块菌的营养水的配方。

[0017] 具体而言，本发明提供了：

[0018] 一种块菌酒，其原料包含5-95重量份的块菌菌丝体，95-5重量份的谷物。

[0019] 所述的块菌菌丝体的制备方法包括以下步骤：

[0020] I、液体菌种培养：

[0021] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入20-35℃恒温培养箱培养2-30天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸15-20分钟过滤得滤液；将100-300g榛叶放入1000ml水中煮沸约10-15分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖10-30g，琼脂10-30g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为6-9；

[0022] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为15-40℃，转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁300-900，蔗糖1-300，蛋白胨1-100，酵母膏1-20，硫酸镁1-10，磷酸二氢钾1-10，pH值为6-9；

[0023] 3)二级液体种子培养：将步骤2)中培养的一级液体种子按照5-50％体积比的接种量转接入装有二级液体种子培养基的摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为15-40℃，转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁300-900，蔗糖
1-300，蛋白胨1-100，酵母膏1-20，硫酸镁1-10，磷酸二氢钾1-10，pH值为6-9；

[0024] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0025] 1)配置营养水：将蔗糖10-50g，酵母膏0-20g，蛋白胨0-20g，磷酸二氢钾0-10g，硫酸镁0-10g溶于700-900ml水中，定容至1000ml，调节pH至6-9；

[0026] 2)配置固态发酵培养基：按重量比为(0.8-2)∶1将谷物加入到营养水中；

[0027] 3)固态发酵：按照固体发酵培养基干重的1-50％体积/重量，将二级液体种子接种于步骤2)所得的固态发酵培养基上，于20-40℃发酵培养2-60天，料层厚度为1-10cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

[0028] 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。

[0029] 所述的块菌菌丝体的制备方法还包括：

[0030] III、液态深层发酵法生产块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液；

[0031] 1)配置液体培养基：将100-300g鲜榛叶放入1000ml水中煮20-40分钟后过滤，取滤液，加入50-200g的蔗糖，10-100g的蛋白胨，5-50g的酵母膏，1-40g的硫酸镁，1-40g的磷酸二氢钾，用水定容至1000ml，调pH值为6-9，消毒灭菌即得；

[0032] 2)发酵条件为：按照5-50％体积比的接种量将I中所得的二级液体种子接种于1)所得的液体培养基上，装液量为容积的60-80％，在20-40℃，通气速率为30-60升/分钟，搅拌转速为200-800转/分钟的条件下培养2-30天，得块菌菌丝体液；

[0033] 3)将步骤2)所得块菌菌丝体液离心，过滤，干燥，粉碎，过筛，灭菌，即得块菌菌丝体粉。

[0034] 一种块菌酒的制备方法：将重量比为1∶(0.1-2)的谷物和块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液作为原料，接入2-8％重量比的甜酒曲和1-5％重量比的活化酵母液后，在20-40℃下发酵2-10天，然后在15-30℃静置发酵20-50天，按照黄酒的酿造工艺，制成块菌黄酒。

[0035] 一种块菌酒的制备方法：将权利要求2所得的块菌菌丝体发酵粉用超声波破碎，120℃蒸煮1-3小时，放至室温；每100g块菌菌丝体发酵粉添加50-150mL的酵母-糖化酶-醋酸预混液；20-40℃恒温发酵10-30天，然后用纱布过滤，滤液4-8℃发酵20-80天，取上清，微孔滤膜除菌，密封，低温贮存，即得；所述的酵母-糖化酶-醋酸预混液包含体积分数为3-8％冰醋酸，酵母5-15g/100mL，糖化酶10-20g/100mL。

[0036] 所述的块菌属菌株选自中国块菌、印度块菌、黑孢块菌、白块菌或夏块菌中的一种或几种。

[0037] 所述的谷物为大米、小米、玉米、紫米，红米，黑米，小麦、大麦、青稞、荞麦或高粱的一种或几种。

[0038] 菌种活化是指将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养，获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境。

[0039] 所述的黄酒是指以粮食为原料的酿造酒，不包括蒸馏的烧酒。

[0040] 本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

[0041] 1、可明显提高块菌菌丝体的产量，比分批培养法提高了69％。

[0042] 2、可明显提高块菌胞外多糖产量，比分批培养法提高了150％；

[0043] 3、可明显提高块菌胞内多糖，比分批培养法提高了57％；

[0044] 4、本发明所述的制备方法简单易行，适合工业生产。

具体实施方式

[0045] 以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

[0046] 中国块菌、印度块菌、黑孢块菌、白块菌、夏块菌均购自昆明汇珍园块菌有限公司。

[0047] 试验例1

[0048] 对比例(分批培养法)：

[0049] I、液体菌种培养：

[0050] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜黑孢块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入25℃恒温培养箱培养10天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸17分钟过滤得滤液；再加入蔗糖15g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为7；

[0051] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为20℃，转速为100转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养5天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：蔗糖50，蛋白胨10，酵母膏5，硫酸镁3，磷酸二氢钾7，pH值为7；

[0052] 3)二级液体种子培养：将步骤2)中培养的一级液体种子按照10％体积比的接种量转接入装有二级液体种子培养基的摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为20℃，转速为150转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养5天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：蔗糖100，蛋白胨30，酵母膏10，硫酸镁5，磷酸二氢钾4，pH值为7；

[0053] II、液态深层发酵法生产块菌菌丝体液；

[0054] 1)配置液体培养基：取100g的蔗糖，30g的蛋白胨，15g的酵母膏，10g的硫酸镁，5g的磷酸二氢钾，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为7，分装试管后消毒灭菌即得；

[0055] 2)接种、培养：按照10％重量比将II中所得的块菌菌丝体发酵粉接种于1)所得的液体培养基上，在25℃，通气速率为35升/分钟，转速为250转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养13天，得块菌菌丝体液。

[0056] 2)发酵条件为：按照10％体积比的接种量将I中所得的二级液体种子接种于1)所得的液体培养基上，装液量为容积的70％，在30℃，通气速率为50升/分钟，搅拌转速为600转/分钟的条件下培养15天，得块菌菌丝体液。块菌多糖含量的检测方法：细胞在60℃烘干后称重，烘干的细胞按照文献(Tang，Y.J.，Zhu，L.L.，Li.D.S.，Mi，Z.Y，Li，H.M..Significance ofinoculation density and carbon source on the mycelia growth and Tuberpolysaccharides production by submerged fermentation of Chinese truffle Tubersinense.Process Biochemistry 2008，43：576-586.)的方法破碎处理后，用浓硫酸-苯酚法测定块菌多糖的含量。

[0057] 对对比例、实施例1、实施例3进行如下分析测定：

[0058] A、胞外多糖产量的测定：在30μm孔径滤膜过滤下得细胞干重；发酵液中加入四倍体积的无水乙醇，混合过夜，在13000rpm离心沉淀得到胞外块菌多糖。经1mol/L氢氧化钠溶解，采用浓硫酸-苯酚法测定胞外多糖产量。

[0059] B、胞内多糖产量的测定：菌丝体100mg，加入1mol/L氢氧化钠溶解，采用浓硫酸-苯酚法测定胞内多糖产量，计算胞内多糖产量(胞内多糖含量乘以细胞干重)。

[0060] 表1不同培养方法对块菌菌丝体及多糖产量的影响

[0061]

[0062] 与对照组比较**p＜0.01，与药物1组比较#p＜0.05

[0063] 从表1可知，与对比例相比，实施例1及实施例3的活性菌丝体量获得了显著的增高，相比于对比例，实施例1增高了20％，实施例3增高了69.1％，表明增加固态发酵步骤及向培养基中添加榛叶汁，可以促进块菌活性菌丝体的升生产。

[0064] 另外，从表1中亦可知，实施例1及实施例3中的块菌多糖相比对立也显著增加，且实施例3相比于实施例1的块菌多糖也明显增加，其中胞外多糖增加66％，胞内多糖增加26％。

[0065] 试验例2提高免疫力试验

[0066] 试验动物：BALB/C雄性小鼠，体重18-20g。

[0067] 试验药物：

[0068] 药物1组：试验例1中对比例得到的产品

[0069] 药物2组：实施例9得到的产品

[0070] 药物3组：实施例10得到的产品

[0071] 试验方法：取小鼠20只，随机分组成5组，将小鼠造模为免疫力低下，正常组不造模，造模成功开始给药，对照组给予生理盐水0.2ml/20g。给药1-3组灌胃给药，给药量30ml/kg，连续给药30天，停药后24小时断头放血处死小鼠，在无菌条件下取出脾脏，用
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1640培养液(含10％小牛血清)制成脾细胞悬液，将小鼠脾细胞调整到5×10 细胞/ml，加到96孔培养板中，每孔100μl，每个孔加双份(即一个加ConA，一个不加ConA)。ConA
20μl(浓度为1000μg/ml)，1640培养液80μl，是每孔至200μl体积，于5％CO237℃恒
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温箱内培养72小时，终止培养前24小时，每孔加3H-TdR3.7×10(iucr)。用细胞收集器(TITERTEK CELL HARVESTER 550)收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，依次用蒸馏水、5％三胺醋酸、无水乙醇洗涤，将滤纸置于60℃温箱中烘干，加到含5ml闪烁液的杯内，经液闪仪(BECKMEN LS 9800)测参入放射性活度(cpm)，然后计算刺激指数(SI)，即SI＝加入ConA孔cpm/未加入ConA孔cpm。

[0072] 表2不同药物对免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化的影响。

[0073]组别 SI
正常组 0.689±0.071**
对照组 0.125±0.125
药物1组 1.321±0.103**
药物2组 3.120±0.631**#
药物3组 3.096±0.583**#

[0074] 与对照组比较**p＜0.01，与药物1组比较#p＜0.05

[0075] 由表2可知，本发明所制备的块菌酒可使免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化显著增加。

[0076] 试验例3小鼠抗疲劳实验

[0077] 试验动物：昆明种小鼠，体重18-20g。

[0078] 试验药物：

[0079] 药物1组：试验例1中对比例得到的产品

[0080] 药物2组：实施例9得到的产品

[0081] 药物3组：实施例10得到的产品

[0082] 试验方法：取小鼠20只，随机分组成4组，对照组给予生理盐水0.2ml/20g。给药1-3组灌胃给药，给药量30ml/kg，给药1小时后，快速将小鼠放入事先备好的游泳池内，记录小鼠子入池开始至不再游泳的时间。结果见表3。

[0083] 表3抗疲劳试验结果

[0084]组别 游泳时间(min)
对照组 2.5±0.8
药物1组 4.6±0.3**
药物2组 8.4±0.6**#
药物3组 8.6±0.8**#

[0085] 与对照组比较**p＜0.01，与药物1组比较#p＜0.05

[0086] 由表2可知，本发明所制备的块菌酒可显著延长小鼠的游泳时间，说明本发明所述的药酒具有很好抗疲劳作用。

[0087] 实施例1(制备块菌菌丝体发酵粉)

[0088] I、液体菌种培养：

[0089] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜黑孢块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入25℃恒温培养箱培养15天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸16分钟过滤得滤液；将200g榛叶放入1000ml水中煮沸约15分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为7；

[0090] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为30℃，转速为200转/分钟的旋转式摇瓶机上振荡培养8天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁600，蔗糖150，蛋白胨50，酵母膏10，硫酸镁5，磷酸二氢钾5，pH值为7；

[0091] 3)二级液体种子培养：将75ml的步骤2)中培养的一级液体种子转接入装有二级液体种子培养基的250ml摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为25℃，转速为150转/分钟的旋转式摇瓶机上振荡培养8天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁500，蔗糖100，蛋白胨45，酵母膏8，硫酸镁6.5，磷酸二氢钾4.7，pH值为7；

[0092] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0093] 1)配置营养水：将蔗糖30g，酵母膏10g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁5g溶于800ml水中，定容至1000ml，调节pH至7；

[0094] 2)配置固态发酵培养基：将1500g高粱加入到1000g营养水中；

[0095] 3)固态发酵：将38ml二级液体种子接种于步骤2)所得的干重为150g固态发酵培养基上，于30℃发酵培养40天，料层厚度为5cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

[0096] 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。

[0097] 实施例2(制备块菌菌丝体发酵粉)

[0098] I、液体菌种培养：

[0099] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜中国块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入33℃恒温培养箱培养25天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸17分钟过滤得滤液；将150g榛叶放入1000ml水中煮沸约12分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖15g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为7.5；

[0100] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为20℃，转速为100转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养5天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁400，蔗糖10，蛋白胨90，酵母膏5，硫酸镁3，磷酸二氢钾6，pH值为7.5；

[0101] 3)二级液体种子培养：将25ml的步骤2)中培养的一级液体种子转接入装有二级液体种子培养基的250ml摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为20℃，转速为100转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养5天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁450，蔗糖10，蛋白胨7，酵母膏17，硫酸镁3.1，磷酸二氢钾8.6，pH值为7.5；

[0102] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0103] 1)配置营养水：将蔗糖15g，酵母膏5g，蛋白胨18g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g溶于850ml水中，定容至1000ml，调节pH至7.5；

[0104] 2)配置固态发酵培养基：将1000g荞麦加入到1000g营养水中；

[0105] 3)固态发酵：将15ml二级液体种子接种于步骤2)所得的干重为150g固态发酵培养基上，于25℃发酵培养10天，料层厚度为3cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

[0106] 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。

[0107] 实施例3(制备块菌菌丝体粉)

[0108] I、液体菌种培养：

[0109] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜黑孢块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入25℃恒温培养箱培养15天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸16分钟过滤得滤液；将200g榛叶放入1000ml水中煮沸约15分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为7；

[0110] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为30℃，转速为200转/分钟的旋转式摇瓶机上振荡培养8天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁600，蔗糖150，蛋白胨50，酵母膏10，硫酸镁5，磷酸二氢钾5，pH值为7；

[0111] 3)二级液体种子培养：将75ml的步骤2)中培养的一级液体种子转接入装有二级液体种子培养基的250ml摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为25℃，转速为150转/分钟的旋转式摇瓶机上振荡培养8天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁500，蔗糖100，蛋白胨45，酵母膏8，硫酸镁6.5，磷酸二氢钾4.7，pH值为7；

[0112] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0113] 1)配置营养水：将蔗糖30g，酵母膏10g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁5g溶于800ml水中，定容至1000ml，调节pH至7；

[0114] 2)配置固态发酵培养基：将1500g高粱加入到1000g营养水中；

[0115] 3)固态发酵：将38ml二级液体种子接种于步骤2)所得的干重为150g固态发酵培养基上，于30℃发酵培养40天，料层厚度为5cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

[0116] 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。

[0117] III、液态深层发酵法生产块菌菌丝体粉

[0118] 1)配置液体培养基：将200g鲜榛叶放入1000ml水中煮30分钟后过滤，取滤液，加入150g的蔗糖，50g的蛋白胨，25g的酵母膏，20g的硫酸镁，25g的磷酸二氢钾，用水定容至1000ml，调pH值为7，消毒灭菌即得；

[0119] 2)发酵条件为：将I中所得的二级液体种子5ml接种于1)所得的液体培养基20ml上，装液量为容积的70％，在30℃，通气速率为45升/分钟，搅拌转速为500转/分钟的条件下培养15天，得块菌菌丝体液；

[0120] 3)将步骤2)所得块菌菌丝体液离心，过滤，干燥，粉碎，过筛，灭菌，即得块菌菌丝体粉。

[0121] 实施例4(制备块菌菌丝体液)

[0122] I、液体菌种培养：

[0123] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜白块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入28℃恒温培养箱培养20天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸18分钟过滤得滤液；将250g榛叶放入1000ml水中煮沸约13分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖
25g，琼脂25g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为8；

[0124] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为25℃，转速为150转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养10天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁700，蔗糖100，蛋白胨10，酵母膏15，硫酸镁7，磷酸二氢钾2，pH值为8；

[0125] 3)二级液体种子培养：将50ml的步骤2)中培养的一级液体种子转接入装有二级液体种子培养基的250ml摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为30℃，转速为200转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养10天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁650，蔗糖150，蛋白胨56，酵母膏3，硫酸镁8.2，磷酸二氢钾6.5，pH值为8；

[0126] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0127] 1)配置营养水：将蔗糖25g，酵母膏15g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾8g，硫酸镁3g溶于750ml水中，定容至1000ml，调节pH至8；

[0128] 2)配置固态发酵培养基：将1800g黑米加入到1000g营养水中；

[0129] 3)固态发酵：将30ml二级液体种子接种于步骤2)所得的干重为150g固态发酵培养基上，于35℃发酵培养20天，料层厚度为8cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

[0130] 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。

[0131] III、液态深层发酵法生产块菌菌丝体液；

[0132] 1)配置液体培养基：将150g鲜榛叶放入1000ml水中煮25分钟后过滤，取滤液，加入100g的蔗糖，30g的蛋白胨，15g的酵母膏，5g的硫酸镁，30g的磷酸二氢钾，用水定容至1000ml，调pH值为8，消毒灭菌即得；

[0133] 2)发酵条件为：将I中所得的二级液体种子2ml接种于1)所得的液体培养基20ml上，装液量为容积的65％，在25℃，通气速率为40升/分钟，搅拌转速为400转/分钟的条件下培养5天，得块菌菌丝体液。

[0134] 实施例5(制备块菌菌丝体粉)

[0135] I、液体菌种培养：

[0136] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜夏块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入30℃恒温培养箱培养10天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸19分钟过滤得滤液；将280g榛叶放入1000ml水中煮沸约14分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖
13g，琼脂28g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为8.5；

[0137] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为35℃，转速为250转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养13天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁850，蔗糖250，蛋白胨6，酵母膏17，硫酸镁8，磷酸二氢钾1-10，pH值为8.5；

[0138] 3)二级液体种子培养：将100ml的步骤2)中培养的一级液体种子转接入装有二级液体种子培养基的250ml摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为35℃，转速为250转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养13天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁750，蔗糖250，蛋白胨84，酵母膏13，硫酸镁2.9，磷酸二氢钾7.3，pH值为8.5；

[0139] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0140] 1)配置营养水：将蔗糖45g，酵母膏18g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾6.4g，硫酸镁2.5g溶于870ml水中，定容至1000ml，调节pH至8.5；

[0141] 2)配置固态发酵培养基：将1300g玉米加入到1000g营养水中；

[0142] 3)固态发酵：将60ml二级液体种子接种于步骤2)所得的干重为150g固态发酵培养基上，于28℃发酵培养50天，料层厚度为2cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

[0143] 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。

[0144] III、液态深层发酵法生产块菌菌丝体粉；

[0145] 1)配置液体培养基：将250g鲜榛叶放入1000ml水中煮35分钟后过滤，取滤液，加入180g的蔗糖，80g的蛋白胨，45g的酵母膏，30g的硫酸镁，80g的磷酸二氢钾，用水定容至1000ml，调pH值为8.5，消毒灭菌即得；

[0146] 2)发酵条件为：将I中所得的二级液体种子8ml接种于1)所得的液体培养基20ml上，装液量为容积的75％，在35℃，通气速率为50升/分钟，搅拌转速为600转/分钟的条件下培养20天，得块菌菌丝体液；

[0147] 3)将步骤2)所得块菌菌丝体液离心，过滤，干燥，粉碎，过筛，灭菌，即得块菌菌丝体粉。

[0148] 实施例6(制备块菌菌丝体粉)

[0149] I、液体菌种培养：

[0150] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜印度块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入35℃恒温培养箱培养2天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸15分钟过滤得滤液；将100g榛叶放入1000ml水中煮沸约15分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖
10g，琼脂10g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为6；

[0151] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为15℃，转速为50转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养15天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁300，蔗糖1，蛋白胨1，酵母膏1，硫酸镁1，磷酸二氢钾1，pH值为6；

[0152] 3)二级液体种子培养：将12.5ml的步骤2)中培养的一级液体种子转接入装有二级液体种子培养基的250ml摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为15℃，转速为50转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养15天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁300，蔗糖1，蛋白胨1，酵母膏1，硫酸镁1，磷酸二氢钾1，pH值为6；

[0153] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0154] 1)配置营养水：将蔗糖10g，磷酸二氢钾10g，硫酸镁10g溶于700ml水中，定容至1000ml，调节pH至6；

[0155] 2)配置固态发酵培养基：将800g青稞加入到1000g营养水中；

[0156] 3)固态发酵：将1.5ml二级液体种子接种于步骤2)所得的干重为150g固态发酵培养基上，于20℃发酵培养60天，料层厚度为10cm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；

[0157] 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。

[0158] III、液态深层发酵法生产块菌菌丝体粉

[0159] 1)配置液体培养基：将300g鲜榛叶放入1000ml水中煮20分钟后过滤，取滤液，加入200g的蔗糖，100g的蛋白胨，50g的酵母膏，40g的硫酸镁，40g的磷酸二氢钾，用水定容至1000ml，调pH值为6，消毒灭菌即得；

[0160] 2)发酵条件为：将I中所得的二级液体种子1ml接种于1)所得的液体培养基20ml上，装液量为容积的80％，在20℃，通气速率为60升/分钟，搅拌转速为800转/分钟的条件下培养30天，得块菌菌丝体液；

[0161] 3)将步骤2)所得块菌菌丝体液离心，过滤，干燥，粉碎，过筛，灭菌，即得块菌菌丝体粉。

[0162] 实施例7(制备块菌菌丝体液)

[0163] I、液体菌种培养：

[0164] 1)斜面菌种培养：将野生未成熟的新鲜黑孢块菌和白块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入20℃恒温培养箱培养30天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为：将马铃薯200g去皮，切片，煮沸20分钟过滤得滤液；将300g榛叶放入1000ml水中煮沸约10分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖30g，琼脂30g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为9；

[0165] 2)一级液体种子培养：将步骤1)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为40℃，转速为300转/分钟的旋转式摇瓶机上振荡培养2天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁900，蔗糖300，蛋白胨100，酵母膏20，硫酸镁10，磷酸二氢钾10，pH值为9；

[0166] 3)二级液体种子培养：将125ml的步骤2)中培养的一级液体种子转接入装有二级液体种子培养基的250ml摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为40℃，转速为300转/分钟的旋转式摇瓶机上振荡培养2天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为：榛叶汁900，蔗糖300，蛋白胨100，酵母膏20，硫酸镁10，磷酸二氢钾10，pH值为9；

[0167] II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉：

[0168] 1)配置营养水：将蔗糖50g，酵母膏20g，蛋白胨20g，溶于900ml水中，定容至1000ml，调节pH至9；

[0169] 2)配置固态发酵培养基：将2000g大麦加入到1000g营养水中；

[0170] 3)固态发酵：将75ml二级液体种子接种于步骤2)所得的干重为150g固态发酵培