一种黄酒用氨基甲酸乙酯降解酶产生菌转让专利
申请号 : CN201210125030.6
文献号 : CN102676399B
文献日 : 2013-06-12
发明人 : 田亚平 , 谷晓蕾 , 吴延涛
申请人 : 江南大学
摘要 :
一种黄酒用氨基甲酸乙酯降解酶产生菌，属于与食品质量提升相关的小酶种产生菌及酶特性研究领域。本发明菌株分类命名为变幻青霉（Penicilliumvariabile）JN-A525，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.5763。本菌株的扩增ITS区全序列其氨基酸序列为SEQIDNO:1。该菌所产的EC降解酶，最适pH相对较宽为4.0-6.0，最适温度为50℃，该菌产生的酶在模拟黄酒（乙醇15%，EC3%，pH4.4）条件下对氨基甲酸乙酯（EC）有相对较强的水解能力，所产EC降解酶有在清酒、黄酒、米酒等发酵食品中去除已产生的微量EC与MC的应用潜力，可与酸性脲酶联合使用，使许多发酵食品的质量品质和安全性得到较好的提升。
权利要求 :
1.一种氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌，其分类命名为变幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.5763。
2.根据权利要求1所述的EC降解酶产生菌，其特征在于：所述菌的ITS区序列如SEQ ID NO:1所示。
说明书 :
一种黄酒用氨基甲酸乙酯降解酶产生菌
技术领域
[0001] 一种黄酒用氨基甲酸乙酯（EC）降解酶产生菌，涉及该菌的鉴定及所产酶的基本特性，具体的说是从小鼠的肠道中分离出一株可以产生EC降解酶产生菌，通过ITS序列法鉴定其种属。对提取获得的粗酶分析其最适pH、最适温度、pH值和温度稳定性范围、底物的特异性以及乙醇耐受性等基本特性，并考察其在黄酒中的初步应用效果。属于与食品质量提升相关的小酶种产生菌及酶特性研究领域。
背景技术
[0002] 氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，简称为EC）可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。一般认为EC主要的致癌机理是：约0.1%的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化为2+
N-羟基-氨基甲酸乙酯，后者能够诱导Cu 调控的DNA损伤，这种损伤多发生于胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的残基上，进而影响生物的遗传物质，引发癌变。
N-羟基-氨基甲酸乙酯，后者能够诱导Cu 调控的DNA损伤，这种损伤多发生于胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的残基上，进而影响生物的遗传物质，引发癌变。
[0003] 国内外对酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途径为尿素途径，我国黄酒及日本清酒中90％以上的氨基甲酸乙酯是来源于酒中所含尿素与乙醇的反应：
[0004]
[0005] 通过氨基甲酸乙酯的形成途径的分析可知，发酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、酱油等）和酒精饮料（如葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等）中EC的形成主要来自尿素和乙醇的反应。降低黄酒中EC含量的方法可分为传统工艺的改良和酶解法。目前，利用酶解法去除黄酒中EC已成为现在及将来的发展趋势。尿素是生成氨基甲酸乙酯的前体物质，利用酸性脲酶处理黄酒，可以除去黄酒中大部分尿素，因而减少生成氨基甲酸乙酯的可能性。而氨基甲酸乙酯降解酶则能直接作用于氨基甲酸乙酯，有效分解其为尿素和氨，减少黄酒中已经产生的EC含量。本发明中一株EC降解酶产生菌株的发现和对其相关的研究，为未来黄酒中EC含量更好的减少和控制提供较好的补充手段。
[0006] 随着生活水平的日益提高，国内对酒饮料的消费量日趋上升，尤其是葡萄酒、米酒、黄酒、啤酒等含酒精饮料更是成为人们消费的热点，因此有效的降低酒精饮品中的EC含量水平势在必行。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种产EC降解酶的菌株，该EC降解酶在清酒、黄酒、米酒等发酵食品的生产条件下具有较好的活性；本发明提供该菌以及该菌所产的EC降解酶的相关酶学性质及该酶在黄酒中应用的结果。
[0008] 本发明的技术方案：一种氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌，是从小鼠的肠道中分离得到一株产EC降解酶的菌株，其分类命名为变幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.5763。
[0009] 所述的EC降解酶产生菌，本菌株的扩增ITS区全序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0010] 菌株CGMCC No.5763所产酶的最适pH为4.0-6.0，最适温度为50℃左右；该酶在40-50℃之间，pH值7-9之间，酶具有较好的稳定性。
[0011] 本发明的菌株CGMCC No.5763是从小鼠的肠道组织及内容物中分离获取。
[0012] 菌株的鉴定：
[0013] （1）设计特异性引物，引物名称：ITS1，ITS4
[0014] （2）提取基因组DNA。
[0015] （3）合成引物，扩增ITS区全序列，扩增结果如图3所示。
[0016] （4）PCR产物纯化。
[0017] （5）PCR产物测序。本菌株的扩增ITS区全序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0018] （6）系统发育树：如图6所示。
[0019] 将EC分解酶产生菌CGMCC No.5763的rDNA ITS序列的测序结果通过NCBI网站上的Blast程序与Genbank中核酸数据库进行比对，发现和Penicillium variabile 的rDNA ITS序列相似性达97%，同时EC分解酶产生菌CGMCC No.5763与Penicillium variabile 在基于rDNA ITS序列的系统进化树上处于同一分支，且二者的菌落形态、菌丝形态特征相同，生理生化特征基本一致，因此鉴定该菌株为是青霉属（Penicillium）中变幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525。
[0020] 该菌株在察氏培养基上，菌落质地绒状，致密，平坦，较薄；边缘菌丝体黄色，略带绿色；菌落反面呈橙黄色至红棕色；在电镜中观察分生孢子为卵圆形或椭圆形，壁光滑或稍粗糙。
[0021] 粗酶液的制备及研究
[0022] 斜面培养基：蔗糖30g/L、NaNO3 3 g/L、K2HPO4 1 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L、FeSO4 0.01 g/L、琼脂15-20 g/L、pH自然；
[0023] 发酵培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、pH 6.0；
[0024] 孢子悬浮液的制备：用适量的无菌水洗下琼脂斜面上新鲜、生长旺盛的孢子，然后移入装有玻璃珠的三角瓶中，在振荡器上充分振荡，使孢子均匀分散。
[0025] 将该菌的孢子悬液以3%的接种量接种于含有70 mL发酵液的锥形瓶中，置于恒温调速摇床中进行发酵培养，转速为100 r/min，温度为30℃。发酵培养3d后，将发酵液离心，所得的菌丝体利用超声波破碎，10000×g，4℃，20 min。将获得的上层清液置于4℃保存。通过离心获得发酵液中的菌体量为13.87g/L，测得总酶活为340.8U/L，从而可以测量得到单位菌体的产酶量为24.57u/g。
[0026] 酶活测定方法和粗酶酶学性质
[0027] （1）酶活测定方法：
[0028] ①原理：在一定条件下，该菌株的粗酶液与底物（3% EC，pH4.4）反应后，利用终止剂、显色剂I、显色剂II分别作用后。在一定范围内其颜色的深浅与酶的活力成正比，故在625nm的波长下进行比色，计算酶活力。
[0029] ②酶反应体系：稀释后的粗酶液；显色剂I：称取15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL；显色剂II：称取13.125g NaOH和7.5mL NaClO用超纯水定容至250mL；终止剂：称取10g三氯乙酸用超纯水定容至100mL。
[0030] ③NH4+标准溶液制备
[0031] 1mL氨水溶于底物反应液（3% EC，pH4.4）并定容至145mL，配成0.1mol/L的NH4+溶液，并以此为母液，用相同的底物反应液（3% EC，pH4.4）配制成0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、+0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L的NH4 标准溶液。
[0032] ④氨离子标准曲线的绘制
[0033] 用移液管准确移取1mL NH4+标准梯度液分别置于顺序编号的10mL比色管中。37℃下恒温保温30min，立即用吸1mL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在625nm下比色测+定OD值，以OD值为纵坐标，NH4 梯度为横坐标作图，得到标准曲线。
[0034] ⑤酶活的测定步骤
[0035] 取两支10mL比色管，在两管中分别加入1mL底物反应液（3% EC，pH4.4），再在一支比色管中加入1mL酶液，在另一支比色管中加入1mL超纯水。然后，在50℃恒温水浴箱中反应30min后，在两管中各加入1mL终止剂，混匀后加入1mL的显色剂I和1mL显色剂II，强烈震荡，继续在50℃恒温水浴箱中保温15 min后取出，用超纯水稀释至10mL，625nm处比色，并记录OD值。
[0036] 酶活计算公式：
[0037] 酶活力＝ΔOD625×n×k×10/30
[0038] 式中：ΔOD625：酶反应后样品测定与空白试验光密度值之差；n：酶活测定液稀释倍数；k：标准曲线斜率的倒数；10：1mL样品液稀释至10mL的倍数； 30：酶反应的时间(min)。
[0039] 酶活力定义：在常压、37℃、pH4.4条件下每分钟分解底物产生1µmol氨为一个酶活力单位。
[0040] （2）粗酶酶学性质（见图4、图5）
[0041] 本发明的有益效果：本发明分离得到的菌株，经鉴定为变幻青霉菌，其产的EC降解酶在pH 7.0-9.0之间很稳定，但当pH高于10.0或低于3.0时，酶的活力开始迅速降低直到失去活性。经试验测定该菌产酶的最适pH为4.0-6.0，说明其作用范围相对较宽。温度在40-50℃的范围内，酶活性变化不大，且酶很稳定，当温度高于60℃，酶的活性开始迅速降低直到失活。经试验测定该菌产酶的最适温度为50℃。并对该菌产生的酶在不同酒精度中进行试验，测得该酶对1%-15%浓度的酒精有一定耐受性。在模拟黄酒（15% 乙醇、3% EC、pH4.4）条件下，该酶对EC有相对较强的降解作用，并对氨基甲酸甲酯(MC)也有一定的作用，但对氨基酸类不能作用。故该变幻青霉(Penicillium variabile)JN-A525所产EC降解酶有在清酒、黄酒、米酒等发酵食品中去除已产生的微量EC与MC的应用潜力。
[0042] 固相微萃取-气质联用技术测定酶液对黄酒中风味物质的影响。
[0043] 顶空-固相微萃取-气质联用法分析酶处理前后的黄酒中EC的含量，考察酶在黄酒中去除EC的初步应用效果（见表1）。
[0044] 生物材料样品保藏：一种氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌，是从小鼠的肠道中分离得到一株产EC降解酶的菌株，其分类命名为变幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.5763，保藏日期2012年2月16日。
附图说明
[0045] 图1氨离子浓度标准曲线。
[0046] 图2菌株所产EC降解酶的底物的特异性。
[0047] 图3合成引物，扩增ITS区全序列，扩增结果。
[0048] 图4酶反应的最适温度。
[0049] 图5酶反应的最适 pH。
[0050] 图6系统发育树。
具体实施方式
[0051] 实施例1
[0052] 1、菌株的分离：
[0053] 从小鼠肠道中一株EC降解酶产生菌。
[0054] 所用的分离培养基：0.23%羟乙基哌嗪乙酸、0.1%维生素混合物（30g/L胆碱盐酸、10mg/L烟酰胺、2.5mg/L泛酸钙、2.5mg/L盐酸硫胺、1.25mg/L核黄素、0.75mg/L吡哆醛盐酸、0.6mg/L对氨基苯甲酸、0.5mg/L叶酸、0.1mg/L生物素）、0.02%矿物质混合物（0.25%氨基甲酸乙酯、0.2%乙酰胺）。
[0055] 菌株的鉴定：
[0056] 该菌株在察氏培养基上，菌落质地绒状，致密，平坦，较薄；边缘菌丝体黄色，略带绿色；菌落反面呈橙黄色至红棕色；在电镜中观察分生孢子为卵圆形或椭圆形，壁光滑或稍粗糙。
[0057] 将EC降解酶产生菌JN-A525的rDNA ITS序列的测序结果通过NCBI网站上的Blast程序与Genbank中核酸数据库进行比对，发现和Penicillium variabile 的rDNA ITS序列相似性达97%，同时EC分解酶产生菌与Penicillium variabile 在基于rDNA ITS序列的系统进化树上处于同一分支，且二者的菌落形态、菌丝形态特征相同，生理生化特征基本一致，因此鉴定该菌株为是青霉属（Penicillium）中变幻青霉（Penicillium variabile）。
[0058] 粗酶液的制备及研究
[0059] 斜面培养基：蔗糖30g/L、NaNO3 3 g/L、K2HPO4 1 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L、FeSO4 0.01 g/L、琼脂15-20 g/L、pH自然；
[0060] 发酵培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、pH 6.0；
[0061] 孢子悬浮液的制备：用适量的无菌水洗下琼脂斜面上新鲜、生长旺盛的孢子，然后移入装有玻璃珠的三角瓶中，在振荡器上充分振荡，使孢子均匀分散。
[0062] 将该菌的孢子悬液以3%的接种量接种于含有70 mL发酵液的锥形瓶中，置于恒温调速摇床中进行发酵培养，转速为100 r/min，温度为30℃。发酵培养3d后，将发酵液离心，得到的菌丝体利用超声波破碎，10000×g，4℃，20 min。将获得的上层清液置于4℃保存。通过离心获得发酵液中的菌体量为13.87g/L，测得总酶活为340.8U/L，从而可以测得单位菌体的产酶量为24.57u/g。
[0063] 对该菌产生的EC降解酶分别进行温度、pH稳定性的实验；最适温度及pH的实验；底物特异性及酒精耐受度实验。
[0064] 酶反应的最适温度和热稳定性：用所产的酶液分别在不同温度下（30-70℃）测定模拟酒样（酒精度为15%、EC 含量为3%、pH4.4）中EC分解酶酶活，50℃时酶活达到最高。在40-50℃之间，酶活表现有较高的相对活力，55℃以上，酶活失活较快。将酶液分别置于
40-75℃的恒温水浴锅中保温，于1h同时取样测定酶活，与未加热处理的酶对比，结果得出：EC降解酶在40-50℃有较好的稳定性。
40-75℃的恒温水浴锅中保温，于1h同时取样测定酶活，与未加热处理的酶对比，结果得出：EC降解酶在40-50℃有较好的稳定性。
[0065] 酶反应的最适pH和pH稳定性：测定不同pH值下，酶液的酶活，结果酶作用的最适pH值约6.0。以不同pH值的缓冲液将菌体稀释适当倍数，4℃保温1h，标准条件下测定酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，可知该酶pH值7-9之间酶具有较好的稳定性。
[0066] EC降解酶底物的特异性：分别以甘氨酸、谷氨酸、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、γ-氨基丁酸为底物，相同条件下，测定酶活。由图2可知，该酶对氨基甲酸乙酯有相对较强的水解释放氨离子的能力，而对氨基甲酸甲酯也可以作用，但作用较弱，对一些氨基酸则基本没什么作用。
[0067] 乙醇耐受性：分别取酒精含量为0、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%，EC含量3%，pH4.5的底物1mL于标记好的比色管中，各加入1mL酶液，50℃水浴反应30min，测定OD值。实验结果为EC分解酶酶活随着酒精含量的增加而降低。
[0068] 3、酶液对黄酒中风味物质的影响
[0069] 采用固相微萃取-气质联用技术测定酶液对黄酒中风味物质的影响。
[0070] 样一为对照，经GC-MS检测，对照品种含有36种风味物质，其中包括18种酯类、5种酸类、4种醇类、2种酚类、1种酮类、2种烷类化合物、1种呋喃化合物。样二是经酶液处理的黄酒，含有38种风味物质，其中酚类增加了一种2，6-二特丁基-4-甲苯酚，醇类增加了一种2-甲基丁醇，酸类增加了一种胺鲜酯酸，少了一种呋喃类化合物。样三是经灭活的酶液处理的黄酒，含37中风味物质，其中多了一种醇类即2,3-丁二醇。其余基本和对照保持一样。该实验说明了酶液对黄酒中的风味物质没有吸附作用，经过酶液作用的黄酒风味物质有极微小的变化，基本不影响黄酒的整体风味和质量。
[0071] 酶在黄酒中去除EC的初步应用效果
[0072] 用顶空固相微萃取技术富集黄酒中的EC，再用气相色谱-质谱联用进行定量分析。
[0073] 顶空固相微萃取：吸取处理过的酒样 8ml置于20mL的顶空瓶中，用微量进样器加入8µLPC内标溶液，再加入3.1gNaCl，旋紧瓶盖，插入萃取头，在70℃下250r/min恒温搅拌萃取45min。
[0074] 气质色谱-质谱连用检测：萃取完毕后将萃取头取出，插入气相色谱进样口250℃热解吸5min，载气为高纯He，流速2mL/min；不分流进样。
[0075] 黄酒被酶处理的样品条件：
[0076] 对照：按每mL黄酒加0.7mL超纯水37℃处理1h后的黄酒样品；
[0077] 样一：按每mL黄酒加0.1U粗酶液37℃处理1h后的黄酒样品；
[0078] 样二：将样一经100℃沸水浴灭酶处理1h；
[0079] 样三：按每mL黄酒加0.3U粗酶液37℃处理1h后的黄酒样品；
[0080] 样四：将样三经 100℃沸水浴灭酶处理1h；
[0081] 样五：按每mL黄酒加0.5U酶粉37℃处理1h后的黄酒样品；
[0082] 各样品中EC去除率如表1所示。
[0083] 表1 EC降解酶在黄酒中去除EC的初步应用效果
[0084]样品 对照 样一 样二 样三 样四 样五
EC含量（µg/L) 154.28 127.49 135.79 112.14 139.75 98.81
酶液吸附EC（%） — — 11.98 — 9.05 —
酶解去除EC（%） — 6.11 — 19.22 — 35.95
EC总去除率（%） — 18.09 — 28.27 — 35.95
EC含量（µg/L) 154.28 127.49 135.79 112.14 139.75 98.81
酶液吸附EC（%） — — 11.98 — 9.05 —
酶解去除EC（%） — 6.11 — 19.22 — 35.95
EC总去除率（%） — 18.09 — 28.27 — 35.95
[0085] 结果表明：该菌所产的粗酶液扣除其具备的一定吸附作用后，对黄酒中的EC仍表现出明显的降解作用，且酶解后黄酒中主要挥发性风味物质基本没有影响，在黄酒中加入酶粉样品时，酶解作用总去除EC率可达到35.95%，因此该菌所产的酶在去除黄酒中EC上具有较大的潜力，为在黄酒及发酵型酒精饮料的质量提升上的应用建立了良好的基础。