桉树WPGS1或WPGS2基因及其过量表达具有增加植物生物量功能

摘要

本发明公开了一个来源于桉树的WPGS1基因与WPGS2基因及其编码蛋白与应用，属于生物技术领域。提取桉树中RNA反转录成cDNA，进行深度测序得到桉树全长cDNA序列，根据NCBI公布的拟南芥AtGA-20和AtEXO蛋白氨基酸序列所推定的DNA序列和测序获得的桉树cDNA文库序列进行相似性比较，得到桉树中WPGS1和WPGS2基因的全长cDNA序列，并将它们导入拟南芥中。过表达WPGS1和WPGS2基因显著地提高了转基因植株的生物量。

权利要求

1.来源于桉树的WPGS1基因，其cDNAs是下述核苷酸序列:编码序列表中SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸。

2.根据权利要求1所述的基因，其cDNAs是下述核苷酸序列:序列表中SEQ ID NO:3的DNA序列。

3.一种表达WPGS1基因的重组表达载体，该重组表达载体至少包括权利要求1所述的基因。

4.一种提高拟南芥株高和叶盘直径的方法，是将权利要求1所述的DNA序列导入拟南芥组织，细胞或器官，拟南芥株高和叶盘直径获得提高。

说明书

桉树WPGS1或WPGS2基因及其过量表达具有增加植物生物

量功能

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因及编码蛋白与应用，特别是涉及两个来源于桉树的WPGS1基因和 WPGS2基因及其编码蛋白与其在提高植物生物量的应用。

背景技术

[0002] 桉树是桃金娘科（Myrtaceae）桉树属（Eucalyptus）的总称，是一种集观赏、用材、纸浆原料、药用于一体的优良树种。由于林木生长周期长，遗传杂和性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，常规的育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求，因此人们将研究重点及成功希望寄托于基因工程技术来解决桉树常规育种难以解决的问题，加速优质、高产桉树新品种的选育进程。林木等木本植物基因资源丰富，但许多天然优良基因尚未被分离利用，大部分基因的功能仍处于未知的状态。因此，研究桉树中能增加生物量的基因可为进一步进行基因工程改造、获得高产量的优良树种奠定基础，具有重要意义。

[0003] 目前对林木基因的分离及功能鉴定主要通过与模式植物拟南芥或烟草等的同源基因进行相似性比较，建立进化树，运用反向遗传学方法，通过调控基因表达如过表达或基因沉默等技术研究基因的功能。苏晓华等（2009）从美洲黑杨中分离得到MADS-box基因PdP1,并在烟草中过表达，导致其提前开花。李海霞等（2009）将毛白杨的PtDRG01基因导入烟草，转基因植株的烟草花叶病毒苏亮显著少于对照，表明该基因具有抗病毒功能。Sonoda等将赤桉HD-Zip class Ⅱ转录因子EcHB1基因转入烟草，转基因植株纤维长度和干重增加，叶片、根和茎的生长量均高于对照。

[0004] 本专利涉及的两个基因均为在拟南芥中证实有增加生物量功能的基因的桉树同源基因。在拟南芥中，GA-20氧化酶基因（GA20 Oxidase gene）编码的GA20氧化酶参与了植物激素赤霉素的合成。在赤霉素合成路线中，20-氧化酶催化氧化过程，从而去除C20，产生具有生物活性的C19-赤霉素。过表达植物20-氧化酶会诱导下胚轴增长，增加茎长和促进开花。

[0005] Farrar 等(2003 )通过研究拟南芥启动子诱捕系AtEM201 发现一在胚胎和幼苗活跃的细胞分裂区尤其在顶端分生组织和幼叶中活跃表达的基因, 并将其命名为 EXORDIUM(EXO)。AtEXO基因在结构上与烟草的PH1-I 基因相关, 分析结果表明它是控制细胞分裂和维持分生组织负调节系统的一个组分。 AtEXO的过表达植物能比其野生型植物拥有更大更粗壮的株型，并有延迟植物黄化的表现型。

[0006] 上述基因在拟南芥及烟草等草本科植物中已有较为透彻的研究，但在林木植物中的分离鉴定工作还有待进行，其功能尚待研究。因此，克隆和鉴定桉树中的同源基因，研究其真实的生物功能，利用生物学技术和遗传学的方法，改良林木的生物量产量，对培育新品种有着重要的理论意义及经济价值。

发明内容

[0007] 本发明的目的是从桉树中克隆出两个和增加植物生物量有关的基因WPGS1与WPGS2并转入拟南芥中验证其在双子叶植物中的基因功能，从而为该基因进一步应用于林木树种的基因改造奠定基础。

[0008] 本发明的又一目的是提供一种提高植物生物量的方法。

[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0010] 本发明通过对桉树的RNA进行深度测序得到桉树的全长cDNA文库。然后从NCBI Genbank中查找到与拟南芥的AtGA20与AtEXO编码蛋白的氨基酸序列相似的桉树全长cDNA（SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4），并命名为WPGS1（Woody Plant Growth Stimulator）和WPGS2。WPGS1基因或WPGS2基因，其cDNAs是下述核苷酸序列:

[0011] 1)序列表中SEQ ID NO : 3 和SEQ ID NO : 4 的DNA序列；

[0012] 2)编码序列表中SEQ ID NO : 1和SEQ ID NO : 2的氨基酸酸序列；

[0013] 其中WPGS1基因长度为1149bp，编码382个氨基酸，和推定的AtGA20蛋白的序列相似度为65%，而WPGS2基因长972bp，编码323个氨基酸，和推定的拟南芥EXO蛋白的序列相似度为78%。

[0014] 本发明提供一种表达WPGS1基因或WPGS2基因的重组二元载体，该重组表达载体为pEUV (Eucalyptus Vector)。

[0015] 本发明还提供一种提高植物生物量的方法，是将WPGS1基因或WPGS2基因的DNA序列导入植物组织，细胞或器官，植物生物量获得提高。

[0016] 所述植物包括双子叶植物。

[0017] 本发明所提供的提高植物生物量的方法，是将桉树的WPGS1基因和WPGS2基因用已知方法进行分离，修饰和设计所得到的。分离出的WPGS1基因和WPGS2基因在分离后插入pEUV载体（如图1），利用二元载体，经农杆菌侵染加插于拟南芥的种子中（如图2），利用改造的双重椰菜花叶病毒35S启动子（Δ35S-35S），令其过量表达，从而得到植物生物量增加的表现型（图1，图3，图4）。利用35S启动子令载体上的基因过表达，使植物的生物量比野生种的植物在相同种植环境下得到提升，详细的步骤可参考具体实施方式。

[0018] 本发明的有益效果如下：

[0019] 本发明提供了一个来源于桉树的WPGS1基因及其编码蛋白。转基因实验证明，WPGS1基因的过表达株诱导下胚轴增长，增加茎长和促进开花。因此在同样的生长环境及生长时间下，WPGS1基因的过表达能显著提高植株生物量（如图3）。

[0020] 本发明亦提供了一个来源于桉树的WPGS2基因。其编码蛋白是一个BR响应基因的调控子，属BR上调基因。转基因实验证明，WPGS2的过表达植物比其野生型植物的叶盘直径显著增长。令其在相同的生长环境及生长时间下，比野生型植物有更高的生物量产量（如图4）。

附图说明

[0021] 图1是pEUV(Eucalyptus Vector)载体资料，图1（A）为pEUV-WPGS1，图1（B）为pEUV-WPGS2。其中35S代表椰菜花叶病毒35S启动子，△ 35S代表除去82个碱基的TATA序列的椰菜花叶病毒35S启动子。

[0022] 图2是过表达突变株鉴定。（A）为WPGS1过表达突变株基因组DNA鉴定，（B）为WPGS2过表达突变株基因组DNA鉴定。

[0023] 图3是WPGS1的过表达导致茎增长。(A)为WPGS1过表达系的T2代和参照Col0在播种后41天的比较。其中样本量>15，在t test中，P值＜0.01；(B)WPGS1过表达系的T2代和参照Col 0在播种后34天的株高比较。

[0024] 图4是转基因植物(WPGS2)与野生型植物(Col)于播种41天后的叶盘大小的比较。(A)为野生型植物(Col 0)与转基因植物(WPGS2)的叶盘直径的平均值的计量化比较，样本量>15，在t test中，P值＜0.01；(B)为WPGS2过表达株系T2代与野生型(Col)于播种41天后叶盘大小的比较。

具体实施方式

[0025] 下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅是用于说明而不是限制本发明。

[0026] 1．桉树的cDNA的制备

[0027] 以现有Guo at al. 2008所采用的方法的技术方法，选取新鲜的桉树 (Eucalyptus cv DH32-29) 叶片，放入液氮中冰冻，然后放入-80℃冰箱中保存备用。

[0028] 使用十六烷基三甲基溴化胺（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB）法提取组织总RNA，具体实施：1）65℃水域中预热15 ml CTAB提取液；2）液氮中研磨2-3克桉树冷冻组织；3）转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即激烈涡旋30s，然后65℃水浴4-5分钟；4）加入等体积的氯仿/异戊醇，涡旋混合，10000 转/分钟常温离心15分钟；5）将上清转移至一新的离心管中，重复抽提一次；6）将上清转移至一新的离心管中，加入1/3体积的氯化锂，至终浓度为2 M，4℃沉淀过夜；7）4℃全速离心1小时，弃上清，用500 μl 70%乙醇洗沉淀，然后用500 μl 100%乙醇洗沉淀；8）用500 μl SSTE溶解沉淀，转移至1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次；9）加入2倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时；10）4℃全速离心20分钟，沉淀RNA；11）先用400μl 70%乙醇洗沉淀，然后用400 μl 100%乙醇洗沉淀，吹干后用100 μl的二乙基焦碳酸酯处理的水溶解RNA；12）用DNA酶处理提取的RNA，-20℃保存备用。

[0029] 将约5 μg桉树叶片组织的总RNA，采用Invitrogen公司的反转录试剂盒（Superscript III First Strand）合成cDNA。

[0030] 2．WPGS1和WPGS2基因的克隆

[0031] 将桉树（品名DH32-29）cDNA送至公司（天津生物芯片技术有限公司）进行深度测序（deep sequencing）以获得cDNA全长序列。通过NCBI Genebank查找得到拟南芥GA20和EXO基因编码的蛋白氨基酸序列，与桉树全长cDNA序列进行相似性比对，得到桉树中相似性最高的全长cDNA序列并分别命名为WPGS1和WPGS2，其中WPGS1基因长度为1149bp，编码382个氨基酸，和AtGA20蛋白的序列相似度为65%，而WPGS2基因长972bp，编码323个氨基酸，和拟南芥EXO蛋白的序列相似度则为78%。

[0032] 由此得到WPGS1和WPGS2全长cDNA序列（SEQ ID No：3，4），据此设计克隆桉树WPGS1和WPGS2的引物：

[0033] WPGS1-F: GTGGGCCCATGTCTTTCTTATTGGACACAAGAAC;

[0034] WPGS1-R: CCTTAATTAATT AGGCTTTGGGAGATAGGAAC

[0035] WPGS2-F: GTGGGCCCATGGCATTCTTCTTCTTCGCTTCTAAG

[0036] WPGS2-R: CCTTAATTAATCATACCAGAGTCGAACACGACGACGT

[0037] 以现有的Polymerase Chain Reaction(PCR)的方法，进行WPGS1基因扩增， 其扩增体系如下：10 X pfx 缓冲液5μl，硫酸镁（50 mM） 2μl，dNTPs（10 mM）1μl，引物GA20-F（10μM）1μl，引物GA20-R（10μM）1μl，桉树cDNA模板2μl，pfx 高保真酶0.4μl（购自Takara公司），水38μl，总体积50μl。PCR扩增程序为：先94 ºC 预变性5分钟；然后94 ºC 40 秒，53 ºC 40 秒， 68 ºC 40 秒，共40个循环，最后68 ºC延伸 5分钟。其PCR产物参照QIAGEN公司的QIAquick胶纯化试剂盒进行胶纯化。

[0038] 以现有的Kary Mulis 研发的Polymerase Chain Reaction(PCR)的方法，进行WPGS2基因扩增， 其扩增体系如下：：10 X pfx 缓冲液5μl，硫酸镁（50 mM） 2μl，dNTPs（10 mM）1μl，引物EXO -F（10μM）1μl，引物EXO -R（10μM）1μl， 桉树cDNA模板2μl，pfx高保真酶0.4μl（购自Takara公司），水38μl，总体积50μl。PCR扩增程序为：先94 ºC 预变性5分钟；然后94 ºC 40 秒，53 ºC 40 秒， 68 ºC 40 秒，共40个循环，最后68 ºC延伸 5分钟。其PCR产物参照QIAGEN公司的QIAquick胶纯化试剂盒进行胶纯化。

[0039] 3. WPGS1和WPGS2过表达拟南芥的获得及其性状的观察

[0040] 根据New England Biolab的说明书将pEUV载体用MluI限制性内切酶在37℃酶切4小时使其变成线性，将胶纯化后的目的基因PCR产物与线性的pEUV载体混合后利用Invitrogen工司的In-fusion试剂盒，将目的基因链接到pEUV，所形成的二元重组表达载体的结构如图1所示，其中图1（A）为pEUV-WPGS1的结构图，图1（B）为pEUV-WPGS2的结构图。其中35S代表椰菜花叶病毒35S启动子，△ 35S代表除去82个碱基的TATA序列的椰菜花叶病毒35S启动子。

[0041] 然后，表达载体pEUV转化根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101用扩增基因的引物进行菌落PCR鉴定，签定结果如图2所示，其中图2（A）为WPGS1过表达突变株基因组DNA鉴定，图2（B）为WPGS2过表达突变株基因组DNA鉴定。

[0042] 对阳性克隆进行大量培养，通过蘸花浸染法转化拟南芥，当代收获为T0代转基因种子。将T0代转基因种子在含有50mg/L潮霉素（hygromycin）的MS培养基上进行筛选，得到转基因阳性植株T1代。T1代植株成熟后得到T2代种子。最后将T2代种子播种在含有25mg/L潮霉素的MS培养基上进行筛选，只有转入pEUV载体的种子才能在含有25mg/L潮霉素的MS培养基上发芽，发芽6天后转入泥土定植，定期对成活植株的生长状况进行各项生长指标的测量（株高，叶盘直径，叶盘叶片数等），并与在相同条件下生长的野生型拟南芥的生长指标（株高，叶盘直径，叶盘叶片数等）进行比较。比较试验的结果可见图3，图4。图3中的WPGS1过表达植株的植株高度在播种后34天比野生型高出20％。图4中的WPGS2过表达植株的植株的叶盘直径于播种41天后比野生型高出20％。